Nous sommes reconnaissants pour les contributions financières au développement de la ligne de faisceau par CEMHTI (Orléans, France, ANR-13-BS08-0012-01) et Labex OSUG@2020 (Grenoble, France, ANR-10-LABX-0056). Le projet FAME-UHD est soutenu financièrement par le Français « grand emprunt » EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), le consortium CRG CEA-CNRS et l’institut INSU CNRS. Nous sommes reconnaissants de toutes les contributions au cours des expériences, en particulier de toutes les personnes travaillant sur BM30B et BM16. Les auteurs reconnaissent l’European Synchrotron Radiation Facility pour la fourniture de temps de faisceau de rayonnement synchrotron. Nous reconnaissons également le projet PHYTOMET ANR pour le soutien financier (ANR-16-CE01-0008) et le projet SEDMAC pour le soutien financier (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

1. Préparation des granulés de cellules cancéreuses PC-3 et OVCAR-3 humaines pour la spéciation du sélénium
REMARQUE : Le protocole suivant est adapté de Weekley et al.10. Toutes les étapes doivent être effectuées sous une hotte de culture cellulaire dans des conditions et des restrictions de niveau de biosécurité 2, en utilisant des techniques aseptiques.
<ol><li>Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules Malassez. Ensemencez...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Ce protocole a été utilisé pour étudier la forme chimique du sélénium et du fer dans des échantillons biologiques par spectroscopie d’absorption de rayons X. Il se concentre sur la cryo-préparation et le stockage d’échantillons biologiques et de composés de référence, ainsi que sur les mesures HERFD-XAS.
Cryo-préparation et stockage La cryo-préparation des granulés d’échantillons biologiques en vrac permet de préserver l’intégrité chimique des esp...

L’étude des biotransformations cellulaires d’éléments essentiels ou toxiques nécessite des techniques de spéciation à haute sensibilité et devrait minimiser les étapes de préparation des échantillons qui sont souvent sujettes à la modification des espèces chimiques.
Les éléments physiologiques tels que le sélénium et le fer sont connus pour être particulièrement difficiles à spécifier en raison de leur chimie complexe, de diverses stabilités des espèces de sélénium ou de fer et de leur faible concentration dans la gamme ppm (mg / kg) ou même inférieure au ppm. Ainsi, l’étude de la spéciation de ces éléments par XAS peut être extrêmement difficile. Le synchrotron XAS et en particulier le XAS à haute résolution de fluorescence d’énergie détecté (HERFD-XAS), qui permet un rapport signal/fondtrès faible 1, sont disponibles dans les sources synchrotron pour spécier des éléments hautement dilués dans des matrices biologiques complexes 2,3. Les mesures conventionnelles de fluorescence-XAS peuvent être effectuées à l’aide d’un détecteur à semi-conducteurs (SSD) à résolution d’énergie avec une largeur de bande d’énergie d’environ 150 à 250 eV, sur la ligne de faisceau CRG-FAME de l’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, tandis que les mesures HERFD-XAS nécessitent un spectromètre à analyseur de cristaux (CAS), avec une largeur de bande d’énergie d’environ 1 à 3 eV, sur la ligne de faisceau CRG-FAME-UHD à l’ESRF2 . Les photons de fluorescence sont discriminés par rapport à leur énergie avec des processus électroniques ou optiques respectivement.
La cryo-préparation de l’échantillon est essentielle pour préserver les structures et maintenir l’intégrité chimique de la composition, permettant ainsi une analyse proche de l’état biologique natif5. De plus, les analyses effectuées à des températures cryogéniques aussi basses que 10 K à l’aide d’un refroidissement cryogénique à l’hélium liquide (LN2) permettent aux dommages causés par le rayonnement de ralentir et de préserver la spéciation élémentaire pour XAS. Bien que certaines revues sur les techniques XAS appliquées aux échantillons biologiques signalent la nécessité de préparer et d’analyser des échantillons dans des conditions cryogéniques (par exemple, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), aucune d’entre elles ne décrit clairement le protocole détaillé connexe. Dans cette publication, une méthode de cryo-préparation de cellules cancéreuses et de micro-organismes planctoniques est décrite pour la spéciation HERFD-XAS de Se8 et Fe9 à température cryogénique.
Les bonnes pratiques pour la préparation des échantillons et l’environnement lors des mesures spectroscopiques XAS de pointe nécessitent 1) une configuration; 2) une procédure d’analyse qui limite autant que possible les effets des dommages causés par les rayonnements; et 3) un échantillon (ou une référence de composé modèle) aussi homogène que possible en ce qui concerne la taille du faisceau de photons X. Le premier élément est pris en compte en effectuant l’acquisition à basse température, à l’aide d’un cryostat d’hélium liquide. Le deuxième élément est traité en effectuant chaque acquisition sur une zone fraîche de l’échantillon en la déplaçant par rapport au faisceau. Enfin, compte tenu de la troisième condition, les échantillons (granulés) et les références (poudres) sont conditionnés dans des granulés en vrac pressés afin de limiter autant que possible les porosités et les inhomogénéités et d’éviter la rugosité par rapport à la taille du faisceau sur la surface de l’échantillon sondé aux rayons X. Nous expliquons comment le protocole traite tous ces points.
Nous avons utilisé la lignée cellulaire de la prostate humaine PC-3 (potentiel métastatique élevé) et la lignée cellulaire ovarienne OVCAR-3 (qui représente jusqu’à 70% de tous les cas de cancer de l’ovaire) pour étudier les propriétés antiprolifératives des cellules cancéreuses des nanoparticules de sélénium (Se-NP), et phaeodactylum tricornutum diatomée comme espèce modèle pour étudier la séquestration du fer dans le phytoplancton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

L’étude des éléments avec spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS) est particulièrement intéressante lors de l’étude du rôle des métaux dans les systèmes biologiques. La préparation des échantillons est une procédure clé et souvent complexe, en particulier pour les échantillons biologiques. Bien que les techniques de spéciation aux rayons X soient largement utilisées, aucun protocole détaillé n’a encore été diffusé pour les utilisateurs de la technique. En outre, la modification de l’état chimique est préoccupante et des techniques cryogéniques sont recommandées pour analyser les échantillons biologiques dans leur état hydraté quasi natif afin de préserver au maximum l’intégrité chimique des cellules ou des tissus. Nous proposons ici un protocole de préparation cellulaire basé sur des échantillons cryo-conservés. Il est démontré dans une étude par spectroscopie d’absorption des rayons X à haute résolution d’énergie détectée par fluorescence du sélénium dans les cellules cancéreuses et une étude du fer dans le phytoplancton. Ce protocole peut être utilisé avec d’autres échantillons biologiques et d’autres techniques de rayons X qui peuvent être endommagés par l’irradiation.

Les principaux objectifs de ces préparations étaient d’étudier l’interaction entre les nanoparticules de sélénium (Se-NP) et les cellules cancéreuses, ainsi que la liaison et la séquestration du fer dans le phytoplancton.
Les spectres HERFD-XANES du sélénium à l’état initial (BSA Se-NP) et dans les cellules incubées en milieu nutritif (BSA Se-NP après 24 h d’incubation) sont représentés à la figure 10. Les résultats ont montré que le sél...

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Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Ce protocole présente une procédure détaillée pour préparer des cryoéchantillons biologiques pour des expériences de spectroscopie d’absorption de rayons X basées sur le synchrotron. Nous décrivons toutes les étapes nécessaires pour optimiser la préparation des échantillons et la cryoconservation avec des exemples du protocole avec les cellules cancéreuses et phytoplanctoniques. Cette méthode fournit une norme universelle de cryo-préparation des échantillons.

Préparation d’échantillons biologiques pour la spéciation à température cryogénique à l’aide de la spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Ce protocole a été normalisé pour les spécimens cellulaires, permettant la comparaison d’expériences en cours à différents endroits synchrotron. Le principal avantage de cette technique est un flux de travail simple et direct qui permet une préservation rapide et fiable de l’intégration chimique de l’échantillon. Les personnes novices dans cette technique peuvent avoir du mal avec l’engrenage des cellules itérées congelées et le chargement rapide de la pastille cellulaire dans l’ordre du cryoéchantillonnage.Un découplage précis et rapide d’un échantillon en température cryogénique est essentiel. En tant que tel, une démonstration visuelle est essentielle pour comprendre comment exécuter la technique. Pour préparer les pastilles de lignées cellulaires du cancer de la prostate et de l’ovaire humain à la spéciation du sélénium, ensemencez le nombre approprié de cellules de chaque lignée cellulaire dans trois flacons T-75 par condition dans le milieu de culture cellulaire approprié dans une hotte à flux laminaire et placez les flacons dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et à 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 80%.Pour exposer les cellules cancéreuses au traitement au sélénium, il faut d’abord soniquer des solutions mères de nanoparticules fraîchement préparées dans un bain-marie à ultrasons pendant 30 minutes à température ambiante avant de diluer en série la solution de nanoparticules de sélénium dans un milieu de culture cellulaire complet aux concentrations de travail appropriées. Dans la hotte à écoulement laminaire, lavez doucement les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS de 37 degrés Celsius par lavage et utilisez une pipette stérile de 25 millilitres pour ajouter soigneusement 15 millilitres du traitement au sélénium d’intérêt au fond de la fiole. Fermez les couvercles sans sceller complètement la fiole et placez les flacons horizontalement dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures.Pour préparer les granulés cellulaires après le lavage et le réapprovisionnement du milieu de culture, utilisez un grattoir cellulaire par flacon pour détacher doucement les cellules. Utilisez un milieu pour rincer toutes les cellules collées à la fiole dans le surnageant et recueillir les cellules dissociées par centrifugation. Lavez les granulés deux fois sur cinq millilitres de PBS par tube et par lavage pour éliminer toutes les traces restantes du traitement et resusciter les cellules dans un millilitre de PBS.Transférer les cellules dans un tube de polypropylène de 1,5 millilitre et prélever les cellules avec une autre centrifugation. Utilisez ensuite une pipette de 200 microlitres pour retirer doucement tout le surnageant et plonger la partie inférieure de chaque tube de 1,5 millilitre dans de l’azote liquide au niveau de la pastille de la cellule. Immédiatement après la congélation, transférer les tubes dans un dewar d’azote liquide pour un stockage à long terme.Pour la spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution, optimisez tous les cristaux du spectromètre de l’analyseur de cristaux dans des conditions de Bragg par rapport à l’énergie de la ligne de fluorescence d’intérêt et utilisez une référence pour laquelle la position énergétique du bord d’absorption est connue pour calibrer l’énergie du faisceau monochromatique incident. Transférer le porte-échantillon dans un cryostat d’hélium liquide pour les échantillons biologiques et régler le cryostat à 10 degrés Kelvin, puis fermer le clapier expérimental en suivant les règles de sécurité du synchrotron et commencer l’analyse. Ici, les spectres représentatifs de spectroscopie d’absorption des rayons X à haute résolution du sélénium à l’état initial et dans les cellules incubées en milieu nutritif démontrent que le sélénium dans les nanoparticules initiales de sélénium était présent à la fois sous forme de sélénium zéro et de forme semblable à la cellulite.Après les interactions avec les cellules PC3, cependant, le sélénium était principalement présent dans les cellules sous forme de sélénium zéro, démontrant un changement d’espèces de sélénium dans les cellules. Pour le fer, les spectres de référence de la spectroscopie d’absorption des rayons X à haute résolution présentent des positions de bord distinctes en fonction de l’état d’oxydation du fer, avec des espèces réduites de fer déplacées vers des valeurs de faible énergie. Deux spectres successifs collectés sur la même position d’une pastille de diatomée étaient similaires, indiquant que les dommages au faisceau étaient limités entre deux acquisitions lors de l’utilisation d’un cryostat d’hélium à 10 Kelvin.De plus, les spectres des différentes positions de la pastille de diatomée étaient identiques, ce qui démontrait que la pastille de l’échantillon était homogène et que les spectres pouvaient être moyennés pour obtenir un meilleur spectre de rapport signal/bruit. Les étapes les plus critiques sont la préparation du diltuion de nanoparticules, la granulation à température cryogénique et la préparation des échantillons de référence standard. Cette procédure peut être appliquée à d’autres techniques d’analyse en vrac, telles que ICP-MS ou HPLC-ICP-MS ou à d’autres techniques spectroscopiques non synchrotron pouvant être réalisées à température cryogénique.D’autres questions scientifiques peuvent être explorées à l’aide de cette procédure, en particulier dans les domaines de la biogéologie, de la biochimie et des sciences de l’environnement ou de la recherche en toxicologie. Les composés de sélénium et les nanoparticules de sélénium peuvent être aussi difficiles pour votre santé et doivent être manipulés dans une hotte chimique dédiée à l’aide de gants, de lunettes et d’un masque facial.

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