Wir danken CEMHTI (Orleans, Frankreich, ANR-13-BS08-0012-01) und Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankreich, ANR-10-LABX-0056) für die Beamline-Entwicklung. Das FAME-UHD-Projekt wird vom französischen "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), dem CEA-CNRS CRG-Konsortium und dem INSU CNRS-Institut finanziell unterstützt. Wir sind dankbar für alle Beiträge während der Experimente, insbesondere für alle Personen, die an BM30B und BM16 arbeiten. Die Autoren würdigen die European Synchrotron Radiation Facility für die Bereitstellung der Synchrotronstrahlungsstrahlzeit. Wir erkennen auch das PHYTOMET ANR-Projekt für finanzielle Unterstützung (ANR-16-CE01-0008) und das SEDMAC-Projekt für finanzielle Unterstützung (INCA-Plan cancer-ASC16019CS) an.

1. Herstellung der humanen PC-3- und OVCAR-3-Krebszellpellets für die Selenspeziation
HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde von Weekley et al.10 übernommen. Alle Schritte müssen unter einer Zellkulturhaube unter Bedingungen und Einschränkungen der Biosicherheitsstufe 2 unter Verwendung aseptischer Techniken durchgeführt werden.
<ol><li>Zählen Sie die Zellen mit einer Malassez-Zellzählkammer. Samen Sie 150.000-200.000 Zellen pro Flasche für die PC-3-Zelllinie u...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die chemische Form von Selen und Eisen in biologischen Proben durch Röntgenabsorptionsspektroskopie zu untersuchen. Es konzentriert sich auf die Kryopräparation und Lagerung von biologischen Proben und Referenzverbindungen sowie auf die HERFD-XAS-Messungen.
Kryo-Aufbereitung und Lagerung Die Kryo-Aufbereitung der biologischen Probenpellets ermöglicht die Erhaltung der chemischen Integrität der in den Proben vorhandenen Spezies. Dies ...

Die Untersuchung der zellulären Biotransformationen essentieller oder toxischer Elemente erfordert Speziationstechniken mit hoher Empfindlichkeit und sollte die Probenvorbereitungsschritte minimieren, die häufig zur Modifikation chemischer Spezies neigen.
Es ist bekannt, dass physiologische Elemente wie Selen und Eisen aufgrund ihrer komplexen Chemie, der verschiedenen Eigenschaften der Selen- oder Eisenspezies und ihrer geringen Konzentration im ppm- (mg/kg) oder sogar sub-ppm-Bereich besonders schwer zu speziieren sind. Daher kann das Studium der Speziation dieser Elemente durch XAS äußerst schwierig sein. Synchrotron XAS und insbesondere hochauflösende fluoreszenzdetektierte XAS (HERFD-XAS), die ein sehr niedriges Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis1 ermöglichen, stehen an Synchrotronquellen zur Verfügung, um hochverdünnte Elemente in komplexen biologischen Matrizen zu spezitieren 2,3. Herkömmliche Fluoreszenz-XAS-Messungen können mit einem energieaufgelösten Festkörperdetektor (SSD) mit einer Energiebandbreite von ~150–250 eV auf der CRG-FAME-Beamline an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4 durchgeführt werden, während HERFD-XAS-Messungen ein Kristallanalysatorspektrometer (CAS) mit einer Energiebandbreite von ~1–3 eV auf der CRG-FAME-UHD-Beamline am ESRF2 benötigen. . Fluoreszenzphotonen werden hinsichtlich ihrer Energie bei elektronischen bzw. optischen Verfahren diskriminiert.
Die Kryopräparation der Probe ist unerlässlich, um Strukturen zu erhalten und die chemische Integrität der Zusammensetzung aufrechtzuerhalten, wodurch eine Analyse nahe am biologischen nativen Zustandermöglicht wird 5. Darüber hinaus ermöglichen Analysen, die bei kryogenen Temperaturen von bis zu 10 K mit flüssiger heliumkryogener Kühlung (LN2) durchgeführt werden, eine Verlangsamung der Strahlenschäden und die Erhaltung der Elementartbildung für XAS. Obwohl einige Übersichtsarbeiten zu XAS-Techniken, die auf biologische Proben angewendet werden, die Notwendigkeit der Vorbereitung und Analyse von Proben unter kryogenen Bedingungen berichten (z. B. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beschreibt keiner von ihnen eindeutig das zugehörige detaillierte Protokoll. In dieser Veröffentlichung wird ein Verfahren zur Kryopräparation von Krebszellen und Planktonmikroorganismen für die HERFD-XAS-Speziation von Se8 und Fe9 bei kryogener Temperatur beschrieben.
Gute Praktiken für die Probenvorbereitung und -umgebung bei hochmodernen XAS-Spektroskopiemessungen erfordern 1) eine Einrichtung; 2) ein Analyseverfahren, das die Auswirkungen von Strahlenschäden so weit wie möglich begrenzt; und 3) eine Probe (oder Modellverbindungsreferenz), die in Bezug auf die Strahlgröße der Röntgenphotonen so homogen wie möglich ist. Der erste Punkt wird berücksichtigt, indem die Erfassung bei niedriger Temperatur unter Verwendung eines flüssigen Heliumkryostaten durchgeführt wird. Der zweite Punkt wird behandelt, indem jede Akquisition auf einem frischen Bereich der Probe durchgeführt wird, indem sie in Bezug auf den Balken bewegt wird. Unter Berücksichtigung der dritten Bedingung werden schließlich Proben (Pellets) und Referenzen (Pulver) in gepressten Bulk-Pellets konditioniert, um Porositäten und Inhomogenitäten so weit wie möglich zu begrenzen und Rauheiten in Bezug auf die Strahlgröße auf der röntgensondierten Probenoberfläche zu vermeiden. Wir erklären, wie das Protokoll mit all diesen Punkten umgeht.
Wir verwendeten die humane Prostatazelllinie PC-3 (hohes metastasierendes Potenzial) und die Eierstockzelllinie OVCAR-3 (die bis zu 70% aller Eierstockkrebsfälle ausmacht), um die antiproliferativen Eigenschaften von Krebszellen von Selennanopartikeln (Se-NPs) und Phaeodactylum tricornutum diatomee als Modellspezies zur Untersuchung der Eisensequestrierung in Phytoplankton zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

Die Untersuchung von Elementen mit Röntgenabsorptionsspektroskopie (XAS) ist von besonderem Interesse, wenn es darum geht, die Rolle von Metallen in biologischen Systemen zu untersuchen. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiges und oft komplexes Verfahren, insbesondere für biologische Proben. Obwohl Röntgenspeziationstechniken weit verbreitet sind, wurde noch kein detailliertes Protokoll für Benutzer der Technik verbreitet. Darüber hinaus ist die Modifikation des chemischen Zustands besorgniserregend, und kryobasierte Techniken werden empfohlen, um die biologischen Proben in ihrem fast nativen hydratisierten Zustand zu analysieren, um die maximale Erhaltung der chemischen Integrität der Zellen oder Gewebe zu gewährleisten. Hier schlagen wir ein zelluläres Präparationsprotokoll vor, das auf kryokonservierten Proben basiert. Es wird in einer hochauflösenden fluoreszenzdetektierten Röntgenabsorptionsspektroskopie von Selen in Krebszellen und einer Studie von Eisen in Phytoplankton demonstriert. Dieses Protokoll kann mit anderen biologischen Proben und anderen Röntgentechniken verwendet werden, die durch Bestrahlung beschädigt werden können.

Die Hauptziele dieser Präparate waren die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Selen-Nanopartikeln (Se-NPs) und Krebszellen sowie der Eisenbindung und -sequestrierung in Phytoplankton.
HERFD-XANES-Spektren des Selens im Anfangszustand (BSA Se-NPs) und in Zellen im Nährmedium (BSA Se-NPs nach 24 h Inkubation) sind in Abbildung 10 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass Selen in den anfänglichen Se-NPs sowohl als Se(0)- als auch als selenitähnli...

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Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Dieses Protokoll stellt ein detailliertes Verfahren zur Vorbereitung biologischer Kryoproben für Synchrotron-basierte Röntgenabsorptionsspektroskopie-Experimente vor. Wir beschreiben alle Schritte, die zur Optimierung der Probenvorbereitung und Kryokonservierung erforderlich sind, anhand von Beispielen für das Protokoll mit Krebs- und Phytoplanktonzellen. Diese Methode bietet einen universellen Standard für die Kryopräparation von Proben.

Biologische Probenvorbereitung für die Speziation bei kryogener Temperatur mittels hochauflösender Röntgenabsorptionsspektroskopie

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Dieses Protokoll wurde für zelluläre Proben standardisiert, so dass Experimente an verschiedenen Synchrotronstandorten verglichen werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein einfacher und unkomplizierter Workflow, der eine schnelle und zuverlässige Konservierung der chemischen Integration der Probe ermöglicht. Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, können mit der Pelletierung der gefrorenen iterierten Zellen und dem schnellen Laden des Zellpellets in die Kryoprobenordnung zu kämpfen haben.Eine präzise und schnelle Entlinkung einer Probe bei kryogener Temperatur ist entscheidend. Daher ist eine visuelle Demonstration unerlässlich, um zu verstehen, wie die Technik ausgeführt wird. Um menschliche Prostata- und Eierstockkrebs-Zelllinien-Zellpellets für die Selenspeziation vorzubereiten, legen Sie die entsprechende Anzahl von Zellen aus jeder Zelllinie in drei T-75-Kolben pro Zustand im entsprechenden Zellkulturmedium in einer laminaren Durchflusshaube und legen Sie die Kolben in einen Zellkultur-Inkubator von 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, bis die Zellen zu 80% konfluent sind.Um die Krebszellen einer Selenbehandlung auszusetzen, beschallen Sie zunächst frisch zubereitete Nanopartikel-Stammlösungen in einem Ultraschallwasserbad für 30 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie die Selen-Nanopartikellösung in vollständigem Zellkulturmedium auf die entsprechenden Arbeitskonzentrationen verdünnen. Waschen Sie in der Laminar-Flow-Haube die Zellen vorsichtig zweimal mit fünf Millilitern von 37 Grad Celsius PBS pro Waschgang und verwenden Sie eine sterile 25-Milliliter-Pipette, um vorsichtig 15 Milliliter der interessierenden Selenbehandlung auf den Boden des Kolbens zu geben. Schließen Sie die Deckel, ohne den Kolben vollständig zu versiegeln, und legen Sie die Kolben 24 Stunden lang horizontal in den Zellkulturinkubator.Um die Zellpellets nach dem Waschen und Auffüllen des Kulturmediums vorzubereiten, verwenden Sie einen Zellenschaber pro Kolben, um die Zellen vorsichtig zu lösen. Verwenden Sie Medium, um alle am Kolben haften Zellen in den Überstand zu spülen und die dissoziierten Zellen durch Zentrifugation zu sammeln. Waschen Sie die Pellets zweimal in fünf Millilitern PBS pro Röhrchen pro Waschgang, um alle verbleibenden Spuren der Behandlung zu entfernen und die Zellen in einem Milliliter PBS zu resuspendieren.Geben Sie die Zellen in ein 1,5-Milliliter-Polypropylenröhrchen und sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation. Verwenden Sie dann eine 200-Mikroliter-Pipette, um den gesamten Überstand vorsichtig zu entfernen und den unteren Teil jedes 1,5-Milliliter-Rohrs in flüssigen Stickstoff auf das Niveau des Zellpellets zu tauchen. Unmittelbar nach dem Einfrieren die Röhrchen zur Langzeitlagerung in einen flüssigen Stickstoff-Dewar überführen.Für eine hochauflösende Röntgenabsorptionsspektroskopie optimieren Sie alle Kristalle des Kristallanalysatorspektrometers unter Bragg-Bedingungen in Bezug auf die interessierende Fluoreszenzlinienenergie und verwenden Sie eine Referenz, für die die Energieposition der Absorptionskante bekannt ist, um die einfallende monochromatische Strahlenergie zu kalibrieren. Geben Sie den Probenhalter für biologische Proben in einen flüssigen Helium-Kryostaten und stellen Sie den Kryostaten auf 10 Grad Kelvin ein, schließen Sie dann den Versuchsstall gemäß den Synchrotron-Sicherheitsregeln und beginnen Sie mit der Analyse. Hier zeigen repräsentative hochauflösende Röntgenabsorptionsspektroskopiespektren des Selens im Anfangszustand und in Zellen, die auf Nährmedium inkubiert wurden, dass das Selen in den ursprünglichen Selennanopartikeln sowohl als Selennull- als auch als Cellulite-ähnliche Formen vorlag.Nach Interaktionen mit den PC3-Zellen war das Selen jedoch hauptsächlich als Selennull in den Zellen vorhanden, was eine Veränderung der Selenspezies innerhalb der Zellen zeigt. Für Eisen weisen hochauflösende Röntgenabsorptionsspektroskopie-Referenzspektren je nach Eisenoxidationsstufe unterschiedliche Kantenpositionen auf, wobei reduzierte Eisenspezies auf niedrige Energiewerte verschoben werden. Zwei aufeinanderfolgende Spektren, die an der gleichen Position eines Kieselalgenpellets gesammelt wurden, waren ähnlich, was darauf hindeutet, dass der Strahlschaden zwischen zwei Akquisitionen begrenzt war, wenn ein Helium-Kryostat bei 10 Kelvin verwendet wurde.Darüber hinaus waren Spektren aus verschiedenen Positionen des Kieselalgenpellets identisch, was zeigt, dass das Probenpellet homogen war und dass die Spektren gemittelt werden konnten, um ein besseres Signal-Rausch-Verhältnisspektrum zu erhalten. Die kritischsten Schritte sind die Vorbereitung des Nanopartikeldiltuions, die Pelletierung bei kryogener Temperatur und die Aufbereitung der Standardreferenzproben. Dieses Verfahren kann auf andere Massenanalysetechniken wie ICP-MS oder HPLC-ICP-MS oder andere nicht-synchrotronspektroskopische Techniken angewendet werden, die bei kryogener Temperatur durchgeführt werden können.Andere wissenschaftliche Fragen können mit diesem Verfahren untersucht werden, insbesondere in den Bereichen Biogeologie, Biochemie und Umweltwissenschaften oder toxikologische Forschung. Selenverbindungen und Selen-Nanopartikel können für Ihre Gesundheit ebenso anstrengend sein und sollten in einer speziellen chemischen Kapuze mit Handschuhen, Brillen und einer Gesichtsmaske manipuliert werden.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted Metabolomics aus biologischen Quellen Mit UltraPerformance Flüssigkeits-Chromatographie-hochauflösender Massenspektrometrie (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Forschung

Chemie

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

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X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

Herstellung von Kohlenstoff-Nanoschichten bei Raumtemperatur

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

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Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Quantifizierung der Fluoreszenz Röntgendaten mit MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

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Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Totalreflexion Absorption Spectroscopy (TIRAS) zum Nachweis von solvatisierte Elektronen an einer Plasma-Liquid-Schnittstelle

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

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This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

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