אנו אסירי תודה על התרומות הכספיות לפיתוח קו הקרן על ידי CEMHTI (אורלינס, צרפת, ANR-13-BS08-0012-01) ו- Labex OSUG@2020 (גרנובל, צרפת, ANR-10-LABX-0056). פרויקט FAME-UHD נתמך כספית על ידי "האמפרנט הגדול" הצרפתי EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), קונסורציום CEA-CNRS CRG ומכון INSU CNRS. אנו אסירי תודה על כל התרומות במהלך הניסויים ובמיוחד על כל האנשים שעבדו על BM30B ו- BM16. המחברים מכירים במתקן הקרינה האירופי של סינכרוטרון למתן זמן קרן קרינה של קרינת סינכרוטרון. אנו מכירים גם בפרויקט PHYTOMET ANR לתמיכה כספית (ANR-16-CE01-0008) ובפרויקט SEDMAC לתמיכה כספית (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

1. הכנת כדוריות התאים הסרטניים האנושיים PC-3 ו- OVCAR-3 עבור דגימת סלניום
הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מ- Weekley et al.10. כל הצעדים צריכים להתבצע תחת מכסה מנוע תרבית תאים תחת תנאים והגבלות של בטיחות ביולוגית ברמה 2, תוך שימוש בטכניקות אספטיות.
<ol><li>ספירת התאים באמצעות תא ספירת ...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

פרוטוקול זה שימש לחקר הצורה הכימית של סלניום וברזל בדגימות ביולוגיות על ידי ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן. הוא מתמקד בהכנת קריו ואחסון של דגימות ביולוגיות ותרכובות ייחוס, כמו גם במדידות HERFD-XAS.
הכנת קריו ואחסון הכנת הקריו של כדורי הדגימה הביולוגית בתפזורת מאפש...

המחקר של ביו-טרנספורמציות תאיות של יסודות חיוניים או רעילים דורש טכניקות ספקולציה עם רגישות גבוהה ואמור למזער את שלבי הכנת הדגימה שלעתים קרובות נוטים לשינוי של מינים כימיים.
יסודות פיזיולוגיים כמו סלניום וברזל ידועים כקשים במיוחד לחיזוי בשל הכימיה המורכבת שלהם, תנוחות שונות של מיני הסלניום או הברזל, והריכוז הנמוך שלהם ב-ppm (mg/kg) או אפילו בתת-ppm. לפיכך, המחקר של speciation של אלמנטים אלה על ידי XAS יכול להיות מאתגר ביותר. סינכרוטרון XAS ובמיוחד פלואורסצנציה ברזולוציה אנרגטית גבוהה שזוהתה XAS (HERFD-XAS), המאפשרת יחס אות-לרקע נמוך מאוד1, זמינים במקורות סינכרוטרון כדי לחזות אלמנטים מדוללים מאוד במטריצות ביולוגיות מורכבות 2,3. מדידות פלואורסצנציה-XAS קונבנציונליות יכולות להתבצע באמצעות גלאי מצב מוצק (SSD) עם רוחב פס אנרגיה ~150-250 eV, על קו הקרן CRG-FAME במתקן הקרינה האירופי סינכרוטרון (ESRF)4, בעוד שמדידות HERFD-XAS זקוקות לספקטרומטר מנתח גבישים (CAS), עם רוחב פס אנרגיה ~1-3 eV, על קו הקרן CRG-FAME-UHD ב- ESRF2 . פוטונים פלואורסצנטיים מופלים ביחס לאנרגיה שלהם באמצעות תהליכים אלקטרוניים או אופטיים בהתאמה.
הכנת הקריו-דגימה חיונית כדי לשמר מבנים ולשמור על שלמות כימית קומפוזיציונית, ובכך לאפשר ניתוח קרוב למצב הטבעי הביולוגי5. יתר על כן, ניתוחים שבוצעו בטמפרטורות קריוגניות נמוכות עד כדי 10 K באמצעות קירור קריוגני הליום נוזלי (LN2), מאפשרים לנזקי קרינה להאט ולשמר את הספקולציה היסודית עבור XAS. למרות שסקירות מסוימות על טכניקות XAS המיושמות על דגימות ביולוגיות מדווחות על הצורך להכין ולנתח דגימות בתנאים קריוגניים (למשל, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), אף אחת מהן אינה מתארת בבירור את הפרוטוקול המפורט הקשור. בפרסום זה, שיטה להכנת קריו של תאים סרטניים ומיקרואורגניזמים פלנקטון מתוארת עבור HERFD-XAS speciation של Se8 ו- Fe9 בטמפרטורה קריוגנית.
תרגול טוב להכנת דגימה וסביבה במהלך מדידות ספקטרוסקופיה XAS חדישות דורשות 1) התקנה; 2) הליך ניתוח המגביל ככל האפשר את השפעות נזקי הקרינה; ו-3) מדגם (או ייחוס תרכובת מודל) הומוגני ככל האפשר ביחס לגודל קרן הפוטונים של קרני הרנטגן. הפריט הראשון נלקח בחשבון על ידי ביצוע הרכישה בטמפרטורה נמוכה, באמצעות קריוסטאט הליום נוזלי. הפריט השני מטופל על ידי ביצוע כל רכישה על שטח טרי של הדגימה על ידי הזזתו ביחס לקורה. לבסוף, בהתחשב במצב השלישי, דגימות (גלולות) והפניות (אבקות) מותנות בכדורי תפזורת לחוצים על מנת להגביל את הנקבוביות ואת אי-ההומוגניות ככל האפשר, וכדי למנוע חספוס ביחס לגודל הקרן על משטח הדגימה הנבדק בקרן רנטגן. אנו מסבירים כיצד הפרוטוקול מתמודד עם כל הנקודות הללו.
השתמשנו בקו תאי הערמונית האנושיים PC-3 (פוטנציאל גרורתי גבוה) ובקו תאי השחלות OVCAR-3 (המהווה עד 70% מכלל מקרי סרטן השחלות) כדי לחקור את התכונות האנטי-פרוליפרטיביות כלפי תאים סרטניים של ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs), ו-Phaeodactylum tricornutum diatom כמין מודל לחקר רצף הברזל בפיטופלנקטון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

חקר היסודות עם ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן (XAS) מעניין במיוחד כאשר חוקרים את תפקידן של מתכות במערכות ביולוגיות. הכנת דגימות היא הליך מפתח ולעתים קרובות מורכב, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. למרות שטכניקות צפייה ברנטגן נמצאות בשימוש נרחב, עדיין לא הופץ פרוטוקול מפורט למשתמשים בטכניקה. יתר על כן, שינוי מצב כימי הוא מדאיג, וטכניקות מבוססות cryo מומלץ לנתח את הדגימות הביולוגיות במצב הידרציה כמעט ילידי שלהן כדי לספק את השימור המרבי של שלמות כימית של התאים או הרקמות. כאן אנו מציעים פרוטוקול הכנה תאית המבוסס על דגימות שהשתמרו ב-cryo. הוא מודגם במחקר ספקטרוסקופיית ספיגת קרני רנטגן של סלניום בתאים סרטניים ברזולוציה גבוהה ברזולוציה גבוהה של אנרגיה, ובמחקר של ברזל בפיטופלנקטון. פרוטוקול זה יכול לשמש עם דגימות ביולוגיות אחרות וטכניקות רנטגן אחרות שעלולות להיפגע על ידי הקרנה.

המטרות העיקריות של תכשירים אלה היו לחקור את האינטראקציה בין ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs) ותאים סרטניים, לבין קשירת ברזל וריצוף בפיטופלנקטון.
ספקטרום HERFD-XANES של הסלניום במצב ההתחלתי (BSA Se-NPs) ובתאים דגירה במדיום תזונתי (BSA Se-NPs לאחר דגירה של 24 שעות) מוצגים באיור 10. התוצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

פרוטוקול זה מציג הליך מפורט להכנת קריאוסמפלים ביולוגיים לניסויים ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן מבוססי סינכרוטרון. אנו מתארים את כל השלבים הנדרשים כדי לייעל את הכנת הדגימה ואת שימור ההקפאה באמצעות דוגמאות של הפרוטוקול עם תאי סרטן ופיטופלנקטון. שיטה זו מספקת תקן אוניברסלי של הכנת קריו לדוגמה.

הכנת דגימות ביולוגיות לספקולציה בטמפרטורה קריוגנית באמצעות ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

פרוטוקול זה תוקן עבור דגימות תאיות, ומאפשר השוואה של ניסויים הפועלים במיקומים שונים של סינכרוטרון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זרימת עבודה פשוטה ופשוטה המאפשרת שימור מהיר ואמין של האינטגרציה הכימית של הדגימה. אנשים חדשים בטכניקה זו עשויים להתקשות עם התאים הקפואים המתנפחים ועם ההעמסה המהירה של הכדור התאי לסדר הקריוסמפלה.ניתוק מדויק ומהיר של דגימות בטמפרטורה קריוגנית הוא קריטי. ככזה, הדגמה חזותית היא חיונית כדי להבין כיצד לבצע את הטכניקה. כדי להכין את כדוריות התאים של הערמונית האנושית ותאי סרטן השחלות לצורך דגימת סלניום, זרעו את המספר המתאים של תאים מכל קו תאים לשלושה צלוחיות T-75 לכל מצב במדיום תרבית התאים המתאים במכסה המנוע של זרימה למינרית והניחו את הצלוחיות לתוך אינקובטור תרביות תאים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד שהתאים נפגשים ב-80%.כדי לחשוף את התאים הסרטניים לטיפול בסלניום, תחילה תמיסות מלאי ננו-חלקיקים טריים שהוכנו באמבטיית מים באולטרסאונד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני דילול סדרתי של תמיסת הננו-חלקיקים של סלניום במדיום תרבית תאים מלאה לריכוזי העבודה המתאימים. במכסה הזרימה הלמינרי, לשטוף בעדינות את התאים פעמיים עם חמישה מיליליטרים של 37 מעלות צלזיוס PBS לכל שטיפה ולהשתמש בפיפטה סטרילית של 25 מיליליטר כדי להוסיף בזהירות 15 מיליליטרים של טיפול סלניום של עניין לתחתית הבקבוקון. סגרו את המכסים מבלי לאטום לחלוטין את הבקבוקון והניחו את הצלוחיות אופקית בחממת תרביות התאים למשך 24 שעות.כדי להכין את כדורי התא לאחר הכביסה וחידוש מדיום התרבית, השתמשו במגרד תאים אחד לכל בקבוקון כדי לנתק בעדינות את התאים. השתמש במדיום כדי לשטוף את כל התאים שנדבקו לצלוחית לתוך הסופרנטנט ולאסוף את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה. שטפו את הכדורים פעמיים בחמישה מיליליטרים של PBS לכל צינור לכל שטיפה כדי להסיר את כל העקבות הנותרים של הטיפול ולהחיות את התאים במיליליטר אחד של PBS.מעבירים את התאים לצינור פוליפרופילן של 1.5 מיליליטר ואוספים את התאים בצנטריפוגה נוספת. לאחר מכן השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להסיר בעדינות את כל הסופרנטנט ולהטביע את החלק התחתון של כל צינור 1.5 מיליליטר לתוך חנקן נוזלי עד לרמה של גלולת התא. מיד לאחר ההקפאה, העבירו את הצינורות לתוך תפירת חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.עבור ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה, יש לייעל את כל הגבישים מהספקטרומטר של מנתח הגבישים בתנאי בראג ביחס לאנרגיית קו הפלואורסצנציה המעניינת, והשתמשו בהתייחסות שעבורה מיקום האנרגיה של קצה הבליעה ידוע כמכויל את אנרגיית הקרן המונוכרומטית של האירוע. מעבירים את בעל הדגימה להליום קריוסטאט נוזלי לדגימות ביולוגיות ומניחים את הקריוסטט ל-10 מעלות קלווין, ואז סוגרים את ההאץ' הניסיוני בהתאם לכללי הבטיחות של הסינכרוטרון, ומתחילים בניתוח. כאן, ספקטרוסקופיית ספיגת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה מייצגת ספקטרום של הסלניום במצב ההתחלתי ובתאים המדוגרים למדיום תזונתי מדגימה כי הסלניום בננו-חלקיקי הסלניום הראשוניים היה נוכח הן כצורות סלניום אפס והן כצורות דמויות צלוליטיס.עם זאת, לאחר אינטראקציות עם תאי PC3, הסלניום היה נוכח בעיקר בתאים כסלניום אפס, מה שהדגים שינוי של מיני סלניום בתוך התאים. עבור ברזל, ספקטרוסקופיית ייחוס של קליטת קרני רנטגן ברזולוציה גבוהה מציגה מיקומי קצה שונים בהתאם למצב חמצון הברזל, כאשר מינים מופחתים של ברזל מועברים לערכי אנרגיה נמוכים. שני ספקטרום רצופים שנאספו על אותה תנוחה של כדור דיאטום היו דומים, מה שמעיד על כך שהנזק לקורה היה מוגבל בין שתי רכישות בעת שימוש בקריוסטאט הליום ב-10 קלווין.יתר על כן, ספקטרום ממיקומים שונים של גלולת הדיאטום היו זהים, מה שהוכיח כי גלולת הדגימה הייתה הומוגנית וכי ניתן לממוצע את הספקטרום כדי לקבל ספקטרום יחס אות לרעש טוב יותר. הצעדים הקריטיים ביותר הם הכנת דילטויון הננו-חלקיקים, גלולה בטמפרטורה קריוגנית, והכנת דגימות הייחוס הסטנדרטיות. ניתן ליישם הליך זה על טכניקות אנליטיות אחרות בתפזורת, כגון ICP-MS או HPLC-ICP-MS או טכניקות ספקטרוסקופיות אחרות שאינן סינכרוטרוניות המסוגלות להתבצע בצורה בטמפרטורה קריוגנית.ניתן לבחון שאלות מדעיות אחרות באמצעות הליך זה, במיוחד בתחומי הביוגיאולוגיה, הביוכימיה ומדעי הסביבה או מחקר הטוקסיקולוגיה. תרכובות סלניום וננו-חלקיקי סלניום יכולים להיות מפרכים לבריאותכם ויש לתמרן אותם במכסה מנוע כימי ייעודי באמצעות כפפות, משקפיים ומסכת פנים.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics לא ממוקדים ממקורות ביולוגיים באמצעות Ultraperformance כרומטוגרפיה נוזלית-רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

הכנת תאים חסידים הדמיה הקרינה רנטגן על ידי קיבוע כימי

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

הכנת פחמן Nanosheets בטמפרטורת החדר

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

ראפיד תפוקה גבוהה זיהוי מינים של חומר הבוטני באמצעות ניתוח ישיר בזמן אמת רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

לכימות רנטגן פלורסצנטיות נתונים באמצעות מפות

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

ספקטרוסקופיית בליעה גמורה (TIRAS) עבור זיהוי Solvated אלקטרונים על ממשק פלזמה-נוזל

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

ספיגת מתכת חיוני של חיידקים גראם שליליים: רנטגן פלורסצנטיות, רדיואיזוטופים, ותא Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

זיהוי רגיש היסודות של הכימיה בסוללות דרך בליעה רכה רנטגן, רנטגן פלסטית תהודה פיזור

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

שיפור ההבלטה צמיגות גבוהה של Microcrystals עבור זמן לפתור את טורי קריסטלוגרפיה הפמטו-שנייה-רנטגן לייזרים

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...