CEMHTI(フランス、オルレアン、ANR-13-BS08-0012-01)とラベックスOSUG@2020(フランス、グルノーブル、ANR-10-LABX-0056)によるビームライン開発への財政的貢献に感謝しています。FAME-UHDプロジェクトは、フランスの「グランド・エンプラント」EquipEx(EcoX、ANR-10-EQPX-27-01)、CEA-CNRS CRG コンソーシアム、INSU CNRS研究所によって財政的に支援されています。実験中のすべての貢献、特にBM30BとBM16に取り組んでいるすべての人に感謝しています。著者らは、放射光ビームタイムの提供に関する欧州放射光施設を認めている。我々はまた、財政支援のためのPHYTOMET ANRプロジェクト(ANR-16-CE01-0008)及び財政支援のためのSEDMACプロジェクト(INCA-Plan cancer-ASC16019CS)を認識する。

セレンスペシエーションのためのヒトPC-3およびOVCAR-3癌細胞ペレットの調製
注:以下のプロトコルは、Weekleyら10から適合されている。すべてのステップは、無菌技術を使用して、バイオセーフティレベル2の条件および制限の下で細胞培養フードの下で実施されなければならない。
<ol><li>マラセス細胞計数室を用いて細胞を計数する。PC-3細胞株について?...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

このプロトコルは、X線吸収分光法によって生物学的サンプル中のセレンおよび鉄の化学的形態を研究するために使用された。これは、生物学的サンプルおよび参照化合物のクライオ調製および保管、ならびにHERFD-XAS測定に焦点を当てています。
クライオ調製および貯蔵 バルク生物学的試料ペレットの凍結調製は、試料中に存在する種の化学的完全性の保?...

必須または毒性元素の細胞内変換の研究には、高感度のスペシエーション技術が必要であり、化学種の改変を受けやすいことが多いサンプル調製ステップを最小限に抑える必要があります。
セレンや鉄などの生理学的元素は、その複雑な化学的性質、セレンまたは鉄種の様々な安定性、およびppm(mg / kg)またはサブppm範囲でのそれらの低濃度のために、種分化することが特に困難であることが知られている。したがって、XASによるこれらの元素のスペシエーションの研究は、非常に困難な場合があります。シンクロトロンXAS、特に高エネルギー分解能蛍光検出XAS(HERFD-XAS)は、非常に低いシグナル対バックグラウンド比1を可能にし、シンクロトロン源で利用可能な、複雑な生物学的マトリックス2,3中の高度に希釈された元素をスペシエーションする。従来の蛍光XAS測定は、欧州放射光施設(ESRF)4のCRG-FAMEビームライン上で、エネルギー帯域幅約150~250eVのエネルギー分解固体検出器(SSD)を使用して実行できますが、HERFD-XAS測定には、ESRF2のCRG-FAME-UHDビームライン上で、約1~3eVのエネルギー帯域幅を持つ水晶分析器分光器(CAS)が必要です。.蛍光光子は、それぞれ電子的または光学的プロセスによってそれらのエネルギーに関して区別される。
サンプルクライオ調製は、構造を維持し、組成化学的完全性を維持するために不可欠であり、したがって、生物学的天然状態5に近い分析を可能にする。さらに、液体ヘリウム極低温冷却(LN2)を使用して10 Kという低い極低温で実施された分析により、放射線損傷が減速し、XASの元素スペシエーションが維持されます。生物学的試料に適用されたXAS技術に関するいくつかのレビューは、極低温条件下で試料を調製および分析する必要性を報告しているが(例えば、Sarretら6、Porcaro et al.7)、それらのどれも関連する詳細なプロトコルを明確に記述していない。この公報では、極低温でのSe8 およびFe9 のHERFD−XASスペシエーションについて、癌細胞およびプランクトン微生物の凍結調製方法が記載されている。
最先端のXAS分光法測定中のサンプル調製と環境のための良い習慣は、1)セットアップを必要とします。2)放射線障害の影響を可能な限り制限する分析手順。3)試料(またはモデル化合物参照)をX線光子ビームサイズに対してできるだけ均質にする。第1の項目は、液体ヘリウムクライオスタットを用いて低温で取得を行うことによって考慮される。第2の項目は、梁に対してそれを移動させることによってサンプルの新鮮な領域に対して各取得を行うことによって対処される。最後に、第3の条件を考慮すると、サンプル(ペレット)および参照(粉末)は、気孔率および不均一性を可能な限り制限し、X線プローブされたサンプル表面上のビームサイズに対する粗さを避けるために、プレスバルクペレットにコンディショニングされる。プロトコルがこれらすべての点をどのように処理するかを説明します。
ヒト前立腺細胞株PC-3(転移能が高い)と卵巣細胞株OVCAR-3(卵巣がん症例全体の最大70%を占める)を用いて、セレンナノ粒子(Se-NP)のがん細胞に対する抗増殖特性を調べ、モデル種として Phaeodactylum tricornutum Diatom をモデル種として、植物プランクトン中の鉄隔離を調べました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

X線吸収分光法(XAS)による元素の研究は、生物学的システムにおける金属の役割を研究する際に特に興味深い。サンプル調製は、特に生物学的サンプルにとって、重要でしばしば複雑な手順です。X線スペシエーション技術は広く使用されているが、詳細なプロトコルはまだこの技術のユーザに普及していない。さらに、化学状態の改変が懸念されており、細胞または組織の化学的完全性の最大の保存を提供するために、生物学的サンプルをほぼ天然の水和状態で分析するために、クライオベースの技術が推奨されます。ここでは、凍結保存試料に基づく細胞調製プロトコールを提案する。これは、癌細胞におけるセレンの高エネルギー分解能蛍光検出X線吸収分光法研究および植物プランクトン中の鉄の研究において実証されている。このプロトコルは、他の生物学的サンプルおよび照射によって損傷を受ける可能性のある他のX線技術と共に使用することができる。

これらの調製物の主な目的は、セレンナノ粒子(Se-NP)と癌細胞との間の相互作用、ならびに植物プランクトンにおける鉄結合および隔離を調査することであった。
初期状態(BSA Se-NPs)および栄養培地中でインキュベートした細胞(24時間インキュベーション後のBSA Se-NPs)におけるセレンのHERFD-XANESスペクトルを図10に示す。その結果、初期のSe-NP中のセレ?...

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Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

このプロトコルは、シンクロトロンベースのX線吸収分光法実験のために生物学的クライオサンプルを調製するための詳細な手順を提示する。サンプル調製と凍結保存を最適化するために必要なすべてのステップを、がん細胞と植物プランクトン細胞を用いたプロトコルの例で説明します。この方法は、サンプルクライオ調製の普遍的な標準を提供します。

高分解能X線吸収分光法を用いた極低温でのスペシエーションのための生体試料調製

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

このプロトコルは細胞標本用に標準化されており、異なるシンクロトロン位置で実行されている実験の比較を可能にします。この技術の主な利点は、サンプルの化学的統合の迅速かつ信頼性の高い保存を可能にするシンプルで簡単なワークフローです。この技術に慣れていない人は、凍結反復された細胞のペレット化と、クライオサンプルオーダーへの細胞ペレットの高速ロードに苦労するかもしれません。極低温でのサンプルの正確かつ迅速なリンク解除は非常に重要です。そのため、視覚的なデモンストレーションは、テクニックの実行方法を理解するために不可欠です。セレン種分化のためのヒト前立腺および卵巣癌細胞株細胞ペレットを調製するために、各細胞株からの適切な数の細胞を層流フード内の適切な細胞培養培地中の条件ごとに3つのT−75フラスコに播種し、細胞が80%コンフルエントになるまでフラスコを摂氏37度および5%二酸化炭素細胞培養器に入れる。癌細胞をセレン処理に曝露するために、最初に超音波ウォーターバス中で新たに調製したナノ粒子ストック溶液を室温で30分間超音波処理してから、セレンナノ粒子溶液を完全な細胞培養培地中で適切な作業濃度に連続的に希釈する。層流フード内で、洗浄ごとに5ミリリットルの37°CPBSで細胞を2回穏やかに洗浄し、滅菌25ミリリットルのピペットを使用して、フラスコの底に目的のセレン処理の15ミリリットルを慎重に加えます。フラスコを完全に密閉せずに蓋を閉め、フラスコを細胞培養インキュベーター内に水平に24時間置く。培養液を洗浄して補充した後の細胞ペレットを調製するには、フラスコごとに1つのセルスクレーパーを使用して細胞を穏やかに剥離する。培地を使用して、フラスコに付着した細胞を上清にフラッシュし、解離した細胞を遠心分離によって収集する。ペレットを1回の洗浄につきチューブあたり5ミリリットルのPBSで2回洗浄して、処理の残りの痕跡をすべて除去し、細胞を1ミリリットルのPBSに再懸濁する。細胞を1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに移し、別の遠心分離で細胞を回収する。次に、200マイクロリットルのピペットを使用してすべての上清を静かに除去し、各1.5ミリリットルチューブの底部を細胞ペレットのレベルまで液体窒素に突っ込んだ。凍結直後に、チューブを液体窒素デュワーに移して長期保存する。高分解能X線吸収分光法では、目的の蛍光線エネルギーに対してブラッグ条件で結晶分析計分光計からのすべての結晶を最適化し、吸収端のエネルギー位置が既知である基準を使用して、入射単色ビームエネルギーを較正します。試料ホルダーを生体試料用液体ヘリウムクライオスタットに移し、クライオスタットを10ケルビンに設定し、シンクロトロン安全規則に従って実験ハッチを閉じ、分析を開始する。ここで、初期状態および栄養培地にインキュベートされた細胞におけるセレンの代表的な高分解能X線吸収分光スペクトルは、初期セレンナノ粒子中のセレンがセレンゼロおよびセルライト様形態の両方として存在していたことを実証する。しかし、PC3細胞との相互作用の後、セレンは主にセレンゼロとして細胞内に存在し、細胞内のセレン種の変化を実証した。鉄の場合、高分解能X線吸収分光法参照スペクトルは、鉄の酸化状態に応じて明確なエッジ位置を示し、鉄の還元種は低いエネルギー値にシフトする。珪藻ペレットの同じ位置で収集された2つの連続したスペクトルは類似しており、10ケルビンでヘリウムクライオスタットを使用した場合、ビーム損傷が2回の取得間で制限されたことを示している。さらに、珪藻ペレットの異なる位置からのスペクトルは同一であり、サンプルペレットが均質であり、スペクトルを平均化してより良い信号対雑音比スペクトルを得ることができることを実証した。最も重要なステップは、ナノ粒子ディルチュイオンの調製、極低温でのペレット化、および標準参照サンプルの調製である。この手順は、ICP−MSもしくはHPLC−ICP−MSまたは他の非シンクロトロン分光技術などの他のバルク分析技術に適用することができ、極低温で形態を行うことができる。この手順を使用して、特に生物地質学、生化学、環境科学または毒物学研究の分野で、他の科学的疑問を探求することができます。セレン化合物とセレンナノ粒子は、あなたの健康に困難な場合があり、手袋、眼鏡、フェイスマスクを使用して専用の化学フードで操作する必要があります。

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

室温における炭素ナノシートの作製

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

リアルタイム高分解能質量分析法で直接分析を用いた植物材料の急速なハイスループット種の同定

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

X 線蛍光データ マップを使用しての定量化

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

プラズマ ・液体界面の溶媒和電子を検出するための全内部反射吸収分光法 (TIRAS)

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

シリアル結晶の結晶 x 線回折その場その場での動的光散乱のためのマイクロ流体チップ

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

グラム陰性の細菌で重要な金属吸収: 蛍光、放射性同位元素、およびセル分別

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

軟 x 線吸収分光と共鳴非弾性 x 線散乱による電池の化学元素高感度検出

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

微結晶の時間分解フェムト秒シリアル結晶学 x 線レーザーのための高粘度押出を改善

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...