Vi er takknemlige for økonomiske bidrag til beamline-utviklingen av CEMHTI (Orleans, Frankrike, ANR-13-BS08-0012-01) og Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrike, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-prosjektet støttes økonomisk av den franske "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet og INSU CNRS-instituttet. Vi er takknemlige for alle bidragene under eksperimentene, spesielt alle personene som jobber med BM30B og BM16. Forfatterne anerkjenner det europeiske synkrotronstrålingsanlegget for levering av synkrotronstrålingstråletid. Vi anerkjenner også PHYTOMET ANR-prosjekt for økonomisk støtte (ANR-16-CE01-0008) og SEDMAC-prosjekt for økonomisk støtte (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

1. Fremstilling av den menneskelige PC-3 og OVCAR-3 kreftcellepellets for selen spesiering
MERK: Følgende protokoll er tilpasset fra Weekley et al.10. Alle trinn må utføres under en cellekultur hette under biosikkerhet nivå 2 forhold og restriksjoner, ved hjelp av aseptiske teknikker.
<ol><li>Tell cellene ved hjelp av et Malassez celletellingskammer. Frø 150 000–200 000 celler per kolbe for PC-3-cellelinjen og 300 000 celler for cellelinjen OVCAR-3.</li>
	<li>F...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Denne protokollen ble brukt til å studere den kjemiske formen for selen og jern i biologiske prøver ved røntgenabsorpsjonsspektroskopi. Den fokuserer på kryo-forberedelse og lagring av biologiske prøver og referanser forbindelser, samt på HERFD-XAS målinger.
Kryo-forberedelse og lagring Kryo-preparatet av de store biologiske prøvepellets tillater bevaring av den kjemiske integriteten til artene som er tilstede i prøvene. Dette er avgjørende, fordi det er observert...

Studien av cellulære biotransformasjoner av essensielle eller giftige elementer krever spesieringsteknikker med høy følsomhet og bør minimere prøveprepareringstrinn som ofte er utsatt for modifikasjon av kjemiske arter.
Fysiologiske elementer som selen og jern er kjent for å være spesielt vanskelig å spekulere på grunn av deres komplekse kjemi, ulike stabiliteter av selen eller jernarter, og deres lave konsentrasjon i ppm (mg / kg) eller til og med sub-ppm-serien. Dermed kan studiet av spesiering av disse elementene av XAS være ekstremt utfordrende. Synchrotron XAS og spesielt høy energioppløsning fluorescens oppdaget XAS (HERFD-XAS), som tillater et svært lavt signal-til-bakgrunn-forhold1, er tilgjengelige ved synkrotronkilder for å spekulere høyt fortynnede elementer i komplekse biologiske matriser 2,3. Konvensjonelle fluorescens-XAS-målinger kan utføres ved hjelp av en energiavklart SSD-detektor (solid state detektor) med energibåndbredde ~ 150-250 eV, på CRG-FAME-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, mens HERFD-XAS-målinger trenger et krystallanalysatorspektrometer (CAS), med en energibåndbredde ~ 1-3 eV, på CRG-FAME-UHD-strålelinjen ved ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineres med hensyn til deres energi med henholdsvis elektroniske eller optiske prosesser.
Prøven cryo-forberedelse er avgjørende for å bevare strukturer og opprettholde komposisjonell kjemisk integritet, og dermed tillate analyse nær den biologiske innfødte tilstand5. Videre tillater analyser utført ved kryogeniske temperaturer så lave som 10 K ved hjelp av flytende heliumkryogen kjøling (LN2), strålingsskader å bremse og bevare elementær spesiering for XAS. Selv om noen vurderinger av XAS-teknikker som brukes på biologiske prøver rapporterer nødvendigheten av å forberede og analysere prøver under kryogeniske forhold (f.eks. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen av dem tydelig den relaterte detaljerte protokollen. I denne publikasjonen er en metode for kryo-forberedelse av kreftceller og planktonmikroorganismer beskrevet for HERFD-XAS-spesiering avSe 8 og Fe9 ved kryogen temperatur.
God praksis for prøvepreparering og miljø under toppmoderne XAS-spektroskopimålinger krever 1) et oppsett; 2) en analyseprosedyre som begrenser effekten av strålingsskader så mye som mulig; og 3) en prøve (eller modellforbindelsesreferanse) så homogen som mulig med hensyn til røntgenfotonstrålestørrelsen. Det første elementet tas i betraktning ved å utføre oppkjøpet ved lav temperatur, ved hjelp av en flytende helium cryostat. Den andre gjenstanden håndteres ved å utføre hvert oppkjøp på et nytt område av prøven ved å flytte den med hensyn til bjelken. Til slutt, med tanke på den tredje tilstanden, er prøver (pellets) og referanser (pulver) betinget i presset bulkpellets for å begrense porøsiteter og inhomogeniteter så mye som mulig, og for å unngå grovhet med hensyn til strålestørrelsen på røntgensonden. Vi forklarer hvordan protokollen omhandler alle disse punktene.
Vi brukte human prostata celle linje PC-3 (høyt metastatisk potensial) og ovariecelle linje OVCAR-3 (som står for opptil 70% av alle ovariekreft tilfeller) for å undersøke antiproliferative egenskaper mot kreftceller av selen nanopartikler (Se-NPs), og Phaeodactylum tricornutum diatom som en modellart for å undersøke jern sequestration i phytoplankton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

Studiet av elementer med røntgenabsorpsjonsspektroskopi (XAS) er av spesiell interesse når man studerer metallenes rolle i biologiske systemer. Prøvepreparering er en viktig og ofte kompleks prosedyre, spesielt for biologiske prøver. Selv om røntgenspesifisieringsteknikker er mye brukt, er det ennå ikke formidlet noen detaljert protokoll for brukere av teknikken. Videre er kjemisk tilstandsmodifisering bekymringsfull, og kryobaserte teknikker anbefales å analysere de biologiske prøvene i deres nesten innfødte hydrerte tilstand for å gi maksimal bevaring av kjemisk integritet av cellene eller vevene. Her foreslår vi en cellulær forberedelsesprotokoll basert på kryo-bevarte prøver. Det er demonstrert i en høy energioppløsning fluorescens oppdaget røntgenabsorpsjon spektroskopi studie av selen i kreftceller og en studie av jern i planteplankton. Denne protokollen kan brukes med andre biologiske prøver og andre røntgenteknikker som kan bli skadet ved bestråling.

Hovedmålene med disse preparatene var å undersøke samspillet mellom selen nanopartikler (Se-NPs) og kreftceller, og jernbinding og beslagleggelse i planteplankton.
HERFD-XANES-spektra av selen i opprinnelig tilstand (BSA Se-NPs) og i celler inkubert i næringsmiddelmedium (BSA Se-NPs etter 24 h inkubasjon) er vist i figur 10. Resultatene viste at selen i de første Se-NPs var til stede som både Se(0) og selenittlignende former, mens selen i cellene ...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Denne protokollen presenterer en detaljert prosedyre for å forberede biologiske kryompler for synkrotronbaserte røntgenabsorpsjonsspektroskopieksperimenter. Vi beskriver alle trinnene som kreves for å optimalisere prøvepreparering og kryopreservering med eksempler på protokollen med kreft og planteplanktonceller. Denne metoden gir en universell standard for prøvekryo-forberedelse.

Biologiske prøver Forberedelse for spesiering ved kryogen temperatur ved bruk av høyoppløselig røntgenabsorpsjonsspektroskopi

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Denne protokollen er standardisert for cellulære prøver, slik at sammenligningen av eksperimenter som kjører på forskjellige synkrotronplasseringer. Den største fordelen med denne teknikken er en enkel og grei arbeidsflyt som gir en rask og pålitelig bevaring av den kjemiske integrasjonen av prøven. Personer som er nye i denne teknikken, kan slite med de frosne itererte cellene pelleting og rask lasting av cellulær pellet i kryomple rekkefølge.En presis og rask unlink av prøver i kryogen temperatur er kritisk. Som sådan er en visuell demonstrasjon en viktig for å forstå hvordan man utfører teknikken. For å forberede human prostata og eggstokkkreft celle linje pellets for selen spesiering, frø riktig antall celler fra hver celle linje inn i tre T-75 kolber per tilstand i riktig cellekultur medium i en laminær strømning hette og plassere kolber i 37 grader Celsius og 5% karbondioksid cellekultur inkubator til cellene er 80% confluent.For å utsette kreftcellene for selenbehandling, må du først sonikere nylagde nanopartikkelbestandsløsninger i et ultralydvannbad i 30 minutter ved romtemperatur før selen nanopartikkelløsningen i serielt fortynnes i komplett cellekulturmedium til de aktuelle arbeidskonsentrasjonene. I laminær strømningshette vasker du forsiktig cellene to ganger med fem milliliter celsius PBS per vask og bruker en steril pipette på 25 milliliter for å forsiktig legge til 15 milliliter selenbehandling av interesse til bunnen av kolben. Lukk lokkene uten å forsegle kolben helt og plasser kolber horisontalt i cellekulturinkubatoren i 24 timer.For å forberede cellepellets etter vask og etterfylling av kulturmediet, bruk en celleskraper per kolbe for å løsne cellene forsiktig. Bruk medium til å skylle celler som sitter fast i kolben i supernatanten og samle de dissosierte cellene ved sentrifugering. Vask pelletsene to ganger i fem milliliter PBS per rør per vask for å fjerne alle gjenværende spor av behandlingen og resuspender cellene i en milliliter PBS.Overfør cellene til et 1,5 milliliter polypropylenrør og samle cellene med en annen sentrifugering. Bruk deretter en 200 mikroliterpipette for å forsiktig fjerne alle supernatanten og dypp den nederste delen av hvert 1,5 milliliterrør i flytende nitrogen til nivået på cellepelleten. Umiddelbart etter frysing, overfør rørene til en flytende nitrogendewar for langvarig lagring.For røntgenabsorpsjonsspektroskopi med høy oppløsning, optimaliser alle krystallene fra krystallanalysatorspektrometeret i Bragg-forhold med hensyn til fluorescenslinjeenergien av interesse og bruk en referanse som energiposisjonen til absorpsjonskanten er kjent for å kalibrere hendelsen monokromatisk stråleenergi. Overfør prøveholderen til en flytende helium cryostat for biologiske prøver og sett kryostaten til 10 grader Kelvin, lukk deretter den eksperimentelle hutch etter synkrotronsikkerhetsregler, og begynn analysen. Her viser representativ røntgenabsorpsjonsspektroskopispektra av selen i starttilstanden og i celler inkubert til næringsmiddelmiddel at selen i de første selen nanopartiklene var til stede som både selen null og cellulittlignende former.Etter interaksjoner med PC3-cellene var selen imidlertid hovedsakelig til stede i cellene som selen null, noe som viste en endring av selenarter i cellene. For jern viser røntgenabsorpsjonsspektroskopispektra med høy oppløsning distinkte kantposisjoner avhengig av jernoksidasjonstilstanden, med reduserte jernarter skiftet til lave energiverdier. To påfølgende spektra samlet på samme posisjon av en diatompellet var like, noe som indikerer at bjelkeskaden var begrenset mellom to oppkjøp ved bruk av en helium cryostat ved 10 Kelvin.Videre var spektra fra forskjellige posisjoner i diatompellet identisk, noe som viste at prøvepellet var homogent og at spektraet kunne beregnes for å oppnå et bedre signal-til-støy-forholdsspekter. De mest kritiske trinnene er forberedelsen av nanopartikkeldiltusjonen, pelletering ved kryogen temperatur og fremstilling av standard referanseprøver. Denne prosedyren kan brukes på andre bulkanalytiske teknikker, for eksempel ICP-MS eller HPLC-ICP-MS eller andre ikke-synkrotronspektroskopiske teknikker som kan utføres ved kryogen temperatur.Andre vitenskapelige spørsmål kan utforskes ved hjelp av denne prosedyren, spesielt innen biogeologi, biokjemi og miljøvitenskap eller toksikologiforskning. Selenforbindelser og selen nanopartikler kan være like vanskelige for helsen din og bør manipuleres i en dedikert kjemisk hette ved hjelp av hansker, briller og en ansiktsmaske.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Vilkårlige Metabolomics fra biologiske kilder Bruke UltraPerformance væskekromatografi-High Resolution massespektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Forbereder Adherent Cells for X-ray fluorescens Imaging ved Kjemisk Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

Utarbeidelse av Carbon Nanosheets ved romtemperatur

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rapid Høy throughput Arter Identifikasjon av Botanisk Material Bruke direkte analyse i Real Time High Resolution massespektrometri

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantifisere X-Ray fluorescens Data ved hjelp av kart

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total intern refleksjon absorpsjon spektroskopi (TIRAS) for påvisning av Solvated tenner elektroner på en Plasma-flytende-grensesnitt

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic brikker for In Situ Crystal X-ray Diffraksjon og In Situ dynamisk lysspredning for føljetong krystallografi

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Viktig metall opptak i Gram-negative bakterier: X-ray fluorescens, Radioisotopes, og cellen fraksjoneres

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-sensitive påvisning av kjemien i batterier gjennom myk X-ray absorpsjon spektroskopi og Resonant uelastisk X-ray spredning

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Forbedre høy viskositet utelukkelse av Microcrystals for tid-løst føljetong Femtosecond krystallografi på røntgenlasere

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...