Somos gratos pelas contribuições financeiras para o desenvolvimento da linha de travesso pelo CEMHTI (Orleans, França, ANR-13-BS08-0012-01) e Labex OSUG@2020 (Grenoble, França, ANR-10-LABX-0056). O projeto FAME-UHD é apoiado financeiramente pelo "grande emprunt" francês EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), pelo consórcio CEA-CNRS CRG e pelo instituto INSU CNRS. Agradecemos todas as contribuições durante os experimentos, especialmente todas as pessoas que trabalham no BM30B e BM16. Os autores reconhecem o Centro Europeu de Radiação Síncrotron para o fornecimento de tempo de radiação síncrotron. Também reconhecemos o projeto PHYTOMET ANR para apoio financeiro (ANR-16-CE01-0008) e o projeto SEDMAC para apoio financeiro (INCA-Plan câncer-ASC16019CS).

1. Preparação das pelotas humanas de células cancerígenas PC-3 e OVCAR-3 para especiação de selênio
NOTA: O seguinte protocolo é adaptado de Weekley et al.10. Todas as etapas devem ser realizadas sob uma capa de cultura celular sob condições e restrições de nível 2 de biossegurança, utilizando técnicas assépticas.
<ol><li>Conte as células usando uma câmara de contagem de células Malassez. Semente 150.000-200.000 células por frasco para a linha celu...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Este protocolo foi utilizado para estudar a forma química de selênio e ferro em amostras biológicas por espectroscopia de absorção de raios-X. Concentra-se na crio-preparação e armazenamento de amostras biológicas e compostos de referência, bem como nas medições HERFD-XAS.
Crio-preparação e armazenamento A crio-preparação das pelotas de amostra biológica a granel permite a preservação da integridade química das espécies presentes nas amostras. Isso é cr...

O estudo das biotransformações celulares de elementos essenciais ou tóxicos requer técnicas de especiação com alta sensibilidade e deve minimizar as etapas de preparação da amostra que muitas vezes são propensas à modificação de espécies químicas.
Elementos fisiológicos como selênio e ferro são conhecidos por serem particularmente difíceis de especiar devido à sua química complexa, várias stabilidades das espécies de selênio ou ferro, e sua baixa concentração na faixa ppm (mg/kg) ou mesmo sub-ppm. Assim, o estudo da especiação desses elementos pelo XAS pode ser extremamente desafiador. O Síncrotron XAS e especialmente a fluorescência de alta resolução de energia detectada xas (HERFD-XAS), que permite uma relação sinal-fundo muito baixa1, estão disponíveis em fontes síncrotrons para especiar elementos altamente diluídos em matrizes biológicas complexas 2,3. As medidas convencionais de fluorescência-XAS podem ser realizadas usando um detector de estado sólido resolvido com energia (SSD) com uma largura de banda de energia ~150-250 eV, na linha de feixe CRG-FAME no European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, enquanto as medidas HERFD-XAS precisam de um espectrômetro de analisador de cristal (CAS), com uma largura de banda de energia ~1-3 eV, na linha de feixe CRG-FAME-UHD no ESRF2 . Os fótons de fluorescência são discriminados em relação à sua energia com processos eletrônicos ou ópticos, respectivamente.
A crio-preparação amostral é essencial para preservar estruturas e manter a integridade química composicional, permitindo assim análises próximas ao estado nativo biológico5. Além disso, análises realizadas a temperaturas criogênicas tão baixas quanto 10 K usando resfriamento criogênico de hélio líquido (LN2), permitem que os danos causados pela radiação diminuam e preservem a especiação elementar para XAS. Embora algumas revisões sobre técnicas de XAS aplicadas a amostras biológicas informem a necessidade de preparar e analisar amostras em condições criogênicas (por exemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), nenhuma delas descreve claramente o protocolo detalhado relacionado. Nesta publicação, um método de crio-preparação de células cancerosas e microrganismos de plâncton é descrito para a especiação HERFD-XAS de Se8 e Fe9 à temperatura criogênica.
Boas práticas para preparação e ambiente de amostras durante as medições de espectroscopia XAS de última geração requerem 1) uma configuração; 2) procedimento de análise que limite ao máximo os efeitos dos danos causados pela radiação; e 3) uma amostra (ou referência composta modelo) o mais homogênea possível em relação ao tamanho do feixe de fótons de raios-X. O primeiro item é levado em conta realizando a aquisição a uma temperatura baixa, utilizando um criostat de hélio líquido. O segundo item é tratado realizando cada aquisição em uma nova área da amostra, movendo-a com relação à viga. Por fim, considerando a terceira condição, amostras (pelotas) e referências (pós) são condicionadas em pelotas a granel prensadas, a fim de limitar as porosidades e inhomogeneidades tanto quanto possível, e evitar rugosidades em relação ao tamanho do feixe na superfície da amostra sondada por raios-X. Explicamos como o protocolo lida com todos esses pontos.
Usamos a linha de células de próstata humana PC-3 (alto potencial metastático) e a linha de células ovarianas OVCAR-3 (que representa até 70% de todos os casos de câncer de ovário) para investigar as propriedades antiproliferativas em relação às células cancerosas de nanopartículas de selênio (Se-NPs) e diatom de tristórcula de Phaeodactylum como espécie modelo para investigar a sequestração de ferro em filtoplâncton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

O estudo de elementos com espectroscopia de absorção de raios-X (XAS) é de particular interesse ao estudar o papel dos metais em sistemas biológicos. A preparação da amostra é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para amostras biológicas. Embora as técnicas de especiação de raios-X sejam amplamente utilizadas, nenhum protocolo detalhado ainda foi divulgado para os usuários da técnica. Além disso, a modificação do estado químico é preocupante, e técnicas baseadas em crio-claro são recomendadas para analisar as amostras biológicas em seu estado hidratado quase nativo para fornecer a máxima preservação da integridade química das células ou tecidos. Aqui, propomos um protocolo de preparação celular baseado em amostras crio-preservadas. É demonstrado em uma fluorescência detectada por fluorescência de alta resolução de raios-X estudo de espectroscopia de selênio em células cancerosas e um estudo de ferro em fitoplâncton. Este protocolo pode ser usado com outras amostras biológicas e outras técnicas de raio-X que podem ser danificadas por irradiação.

Os principais objetivos dessas preparações foram investigar a interação entre nanopartículas de selênio (Se-NPs) e células cancerosas, e ligação de ferro e sequestro no fitoplâncton.
Os espectros HERFD-XANES do selênio no estado inicial (BSA Se-NPs) e em células incubadas em meio nutritivo (BSA Se-NPs após a incubação de 24 h) são mostrados na Figura 10. Os resultados mostraram que o selênio nos Se-NPs iniciais estava presente tanto como formas se...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.

Preparação de amostras biológicas para especiação em temperatura criogênica usando espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Este protocolo foi padronizado para espécimes celulares, permitindo a comparação de experimentos em diferentes locais síncrotrons. A principal vantagem dessa técnica é um fluxo de trabalho simples e simples que permite uma preservação rápida e confiável da integração química da amostra. Indivíduos novos nessa técnica podem lutar com a pelota de células iteradas congeladas e o carregamento rápido da pelota celular na ordem criosample.Um desvinculação preciso e rápido de uma amostra em temperatura criogênica é crítico. Como tal, uma demonstração visual é essencial para entender como executar a técnica. Para preparar as pelotas de células de células de câncer de próstata e ovário para a especiação de selênio, semeou o número apropriado de células de cada linha celular em três frascos T-75 por condição no meio de cultura celular apropriada em uma capa de fluxo laminar e colocar os frascos em 37 graus Celsius e incubadora de cultura celular de 5% de dióxido de carbono até que as células sejam 80% confluentes.Para expor as células cancerígenas ao tratamento de selênio, primeiro sonicato soluções de estoque de nanopartículas recém-preparadas em um banho de água de ultrassom por 30 minutos à temperatura ambiente antes de diluir em série a solução de nanopartículas de selênio em meio de cultura celular completa para as concentrações de trabalho apropriadas. Na coifa de fluxo laminar, lave suavemente as células duas vezes com cinco mililitros de 37 graus Celsius PBS por lavagem e use uma pipeta estéril de 25 mililitros para adicionar cuidadosamente 15 mililitros do tratamento de selênio de interesse ao fundo do frasco. Feche as tampas sem selar completamente o frasco e coloque os frascos horizontalmente na incubadora de cultura celular por 24 horas.Para preparar as pelotas celulares após a lavagem e reposição do meio de cultura, use um raspador de célula por frasco para desprender suavemente as células. Use o meio para lavar todas as células presas ao frasco no sobrenante e coletar as células dissociadas por centrifugação. Lave as pelotas duas vezes em cinco mililitros de PBS por tubo por lavagem para remover todos os vestígios restantes do tratamento e resuspensar as células em um mililitro de PBS.Transfira as células para um tubo de polipropileno de 1,5 mililitro e colete as células com outra centrifugação. Em seguida, use uma pipeta de 200 microliter para remover suavemente todo o supernatante e mergulhar a parte inferior de cada tubo de 1,5 mililitro em nitrogênio líquido ao nível da pelota celular. Imediatamente após o congelamento, transfira os tubos para uma de guerra de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.Para espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução, otimize todos os cristais do espectrômetro do analisador de cristal em condições de Bragg em relação à energia de interesse da linha de fluorescência e use uma referência para a qual a posição energética da borda de absorção é conhecida por calibrar a energia do feixe monocromático incidente. Transfira o titular da amostra para um criosta de hélio líquido para amostras biológicas e defina o criostat para 10 graus Kelvin, em seguida, feche a cabana experimental seguindo as regras de segurança síncrotron, e comece a análise. Aqui, espectroscopia de espectroscopia de absorção de raios-X representativos de alta resolução do selênio no estado inicial e em células incubadas a meio nutritivo demonstram que o selênio nas nanopartículas iniciais de selênio estava presente tanto como selenium zero quanto celulite.Após interações com as células PC3, no entanto, o selênio estava presente principalmente nas células como selênio zero, demonstrando uma mudança de espécies de selênio dentro das células. Para o ferro, espectroscopia de absorção de raios-X de alta resolução apresentam posições distintas dependendo do estado de oxidação do ferro, com espécies reduzidas de ferro deslocadas para baixos valores energéticos. Dois espectros sucessivos coletados na mesma posição de uma pelota diatoma foram semelhantes, indicando que o dano do feixe foi limitado entre duas aquisições ao usar um criosta de hélio em 10 Kelvin.Além disso, espectros de diferentes posições da pelota diatom eram idênticos, demonstrando que a pelota amostral era homogênea e que os espectros poderiam ser mediados para obter um espectro melhor de relação sinal-ruído. Os passos mais críticos são a preparação da diltuição de nanopartículas, a dotização à temperatura criogênica e a preparação das amostras de referência padrão. Este procedimento pode ser aplicado a outras técnicas analíticas em massa, como ICP-MS ou HPLC-ICP-MS ou outras técnicas espectroscópicas não síncrotrons capazes de serem realizadas de forma criogênica.Outras questões científicas podem ser exploradas utilizando esse procedimento, particularmente nos campos da biogeologia, da bioquímica, das ciências ambientais ou da pesquisa toxicológica. Compostos de selênio e nanopartículas de selênio podem ser tão árduos para sua saúde e devem ser manipulados em um capuz químico dedicado usando luvas, óculos e uma máscara facial.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolomics irrelevantes de fontes biológicas Usando UltraPerformance cromatografia líquida de alta resolução Espectrometria de Massa (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Química

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Preparando células aderentes para fluorescência de raios-X Imagem por Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

Preparação de Nanofolhas de Carbono à Temperatura Ambiente

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rápida de alta capacidade: Identificação de Espécies de material botânico Usando Direct Análise em Tempo Real alta resolução Espectrometria de Massa

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Quantificação dos dados de fluorescência de raios-x usando mapas

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Espectroscopia de absorção de reflexão interna total (TIRAS) para a detecção de Solvated elétrons em uma Interface Plasma-líquido

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Chips microfluídicos por difração de raio x de cristal In Situ e In Situ Difusão dinâmica da luz de cristalografia de Serial

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Captação de Metal essencial em bactérias Gram-negativas: fluorescência, radioisótopos, um raio-x e fracionamento da pilha

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-sensíveis à deteção da química em baterias através de espectroscopia de absorção de raios-x moles e espalhamento inelástico de raios-x ressonante

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Melhorando a extrusão de alta viscosidade de microcristais de tempo-resolvido Serial Femtosecond cristalografia em Lasers de raio-x

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...