Мы благодарны за финансовый вклад в разработку линии луча CEMHTI (Орлеан, Франция, ANR-13-BS08-0012-01) и Labex OSUG@2020 (Гренобль, Франция, ANR-10-LABX-0056). Проект FAME-UHD финансово поддерживается французским «grand emprunt» EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), консорциумом CEA-CNRS CRG и институтом INSU CNRS. Мы благодарны за все вклады во время экспериментов, особенно всех людей, работающих над BM30B и BM16. Авторы признают Европейскую установку синхротронного излучения для обеспечения времени пучка синхротронного излучения. Мы также признаем проект PHYTOMET ANR для финансовой поддержки (ANR-16-CE01-0008) и проект SEDMAC для финансовой поддержки (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

1. Подготовка гранул раковых клеток PC-3 и OVCAR-3 человека к видообразованию селена
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол адаптирован из Weekley et al.10. Все этапы должны проводиться под колпаком клеточной культуры в условиях и ограничениях уровня биобезопасности 2, с использ?...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Этот протокол использовался для изучения химической формы селена и железа в биологических образцах с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии. Основное внимание уделяется криоподготовке и хранению биологических образцов и эталонных соединений, а также измерениям HERFD-XAS.
<...

Изучение клеточных биотрансформаций эссенциальных или токсичных элементов требует методов видообразования с высокой чувствительностью и должно свести к минимуму этапы подготовки образцов, которые часто склонны к модификации химических веществ.
Физиологические элементы, такие как селен и железо, как известно, особенно трудно видообразование из-за их сложного химического состава, различных стабильностей видов селена или железа и их низкой концентрации в диапазоне ppm (мг / кг) или даже ниже ppm. Таким образом, изучение видообразования этих элементов С помощью XAS может быть чрезвычайно сложным. Синхротронный XAS и особенно флуоресцентный XAS с высоким энергетическим разрешением (HERFD-XAS), который допускает очень низкое отношение сигнал/фон1, доступны на синхротронных источниках для видообразования сильно разбавленных элементов в сложных биологических матрицах 2,3. Обычные измерения флуоресценции-XAS могут быть выполнены с использованием твердотельного детектора с энергетическим разрешением (SSD) с полосой пропускания энергии ~ 150-250 эВ, на лучевой линии CRG-FAME в Европейской установке синхротронного излучения (ESRF)4, в то время как для измерений HERFD-XAS требуется спектрометр кристаллического анализатора (CAS) с полосой пропускания энергии ~ 1-3 эВ, на лучевой линии CRG-FAME-UHD на ESRF2 . Флуоресцентные фотоны различаются по отношению к их энергии с помощью электронных или оптических процессов соответственно.
Криоподготовка образца необходима для сохранения структур и поддержания композиционной химической целостности, что позволяет проводить анализ вблизи биологического нативного состояния5. Кроме того, анализы, выполняемые при криогенных температурах до 10 К с использованием криогенного охлаждения жидкого гелия (LN2), позволяют радиационному повреждению замедлить и сохранить элементарное видообразование для XAS. Хотя в некоторых обзорах методов XAS, применяемых к биологическим образцам, сообщается о необходимости подготовки и анализа образцов в криогенных условиях (например, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), ни один из них четко не описывает соответствующий подробный протокол. В данной публикации описан способ криопрепарации раковых клеток и планктонных микроорганизмов для HERFD-XAS видообразования Se8 и Fe9 при криогенной температуре.
Надлежащая практика подготовки образцов и окружающей среды во время современных измерений XAS-спектроскопии требует 1) настройки; 2) процедура анализа, максимально ограничивающая последствия радиационного повреждения; и 3) образец (или эталонное соединение модели) как можно более однородный по отношению к размеру пучка рентгеновских фотонов. Первый пункт учитывается при выполнении сбора при низкой температуре, с использованием жидкого криостата гелия. Второй пункт решается путем выполнения каждого захвата на свежем участке образца путем перемещения его относительно луча. Наконец, учитывая третье условие, образцы (гранулы) и референции (порошки) кондиционируются в прессованных объемных гранулах, чтобы максимально ограничить пористость и неоднородность и избежать шероховатости по отношению к размеру пучка на поверхности исследуемого рентгеновского образца. Мы объясняем, как протокол решает все эти вопросы.
Мы использовали клеточную линию предстательной железы человека PC-3 (высокий метастатический потенциал) и клеточную линию яичников OVCAR-3 (на которую приходится до 70% всех случаев рака яичников) для исследования антипролиферативных свойств по отношению к раковым клеткам наночастиц селена (Se-NPs) и Phaeodactylum tricornutum diatom в качестве модельного вида для исследования секвестрации железа в фитопланктоне.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

Изучение элементов с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии (ХАС) представляет особый интерес при изучении роли металлов в биологических системах. Пробоподготовка является ключевой и часто сложной процедурой, особенно для биологических образцов. Хотя методы рентгеновского видообразования широко используются, подробный протокол еще не был распространен среди пользователей этого метода. Кроме того, модификация химического состояния вызывает беспокойство, и криотехнологии рекомендуются для анализа биологических образцов в их почти нативном гидратированном состоянии, чтобы обеспечить максимальное сохранение химической целостности клеток или тканей. Здесь мы предлагаем протокол клеточной подготовки, основанный на крио-сохраненных образцах. Это проявляется в флуоресцентном рентгеновском спектроскопическом исследовании селена в раковых клетках с высоким разрешением флуоресценции и исследовании железа в фитопланктоне. Этот протокол может быть использован с другими биологическими образцами и другими рентгеновскими методами, которые могут быть повреждены облучением.

Основными целями этих препаратов были исследование взаимодействия между наночастицами селена (Se-NPs) и раковыми клетками, а также связывания и связывания железа в фитопланктоне.
Спектры HERFD-XANES селена в исходном состоянии (BSA Se-NPs) и в клетках, инкубированных в питательной с?...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Этот протокол представляет собой подробную процедуру подготовки биологических криосамплей для экспериментов с рентгеновской абсорбционной спектроскопией на основе синхротронов. Мы описываем все шаги, необходимые для оптимизации пробоподготовки и криоконсервации, с примерами протокола с раковыми и фитопланктонными клетками. Этот метод обеспечивает универсальный стандарт криоподготовки образцов.

Подготовка биологических образцов к видообразованию при криогенной температуре с использованием рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Этот протокол был стандартизирован для клеточных образцов, что позволяет сравнивать эксперименты, проводимые в разных местах синхротрона. Основным преимуществом данной методики является простой и понятный рабочий процесс, который позволяет быстро и надежно сохранять химическую интеграцию образца. Люди, не знакомые с этим методом, могут бороться с гранулированием замороженных итерированных клеток и быстрой загрузкой клеточных гранул в порядок криосамплей.Точное и быстрое разъединение образцов при криогенной температуре имеет решающее значение. Таким образом, визуальная демонстрация необходима для понимания того, как выполнять технику. Чтобы подготовить гранулы клеток клеточной линии рака предстательной железы и яичников человека к видообразованию селена, засейте соответствующее количество клеток из каждой клеточной линии в три колбы Т-75 для каждого условия в соответствующей среде клеточной культуры в ламинарной проточной вытяжке и поместите колбы в инкубатор культуры клеток с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до тех пор, пока клетки не станут на 80% сливающимися.Чтобы подвергнуть раковые клетки обработке селеном, сначала обжарьте ультразвуком свежеприготовленные растворы наночастиц на ультразвуковой водяной бане в течение 30 минут при комнатной температуре, прежде чем последовательно разбавлять раствор наночастиц селена в полной клеточной культуральной среде до соответствующих рабочих концентраций. В ламинарной вытяжке аккуратно промыть клетки два раза пятью миллилитрами 37 градусов Цельсия PBS за стирку и используйте стерильную 25-миллилитровую пипетку, чтобы аккуратно добавить 15 миллилитров селеновой обработки, представляющей интерес, на дно колбы. Закройте крышки, не полностью запечатывая колбу, и поместите колбы горизонтально в инкубатор культуры клеток на 24 часа.Чтобы приготовить гранулы клеток после промывки и пополнения питательной среды, используйте один клеточный скребок на колбу, чтобы аккуратно отсоединить клетки. Используйте среду для промывки любых клеток, прилипших к колбе, в супернатант и сбора диссоциированных клеток путем центрифугирования. Промывайте гранулы два раза в пяти миллилитрах PBS на пробирку за промывку, чтобы удалить все оставшиеся следы обработки и повторно суспендировать клетки в одном миллилитре PBS.Переместите ячейки в полипропиленовую трубку объемом 1,5 миллилитра и соберите ячейки с помощью другого центрифугирования. Затем используйте пипетку объемом 200 микролитров, чтобы аккуратно удалить весь супернатант и погрузить нижнюю часть каждой 1,5-миллилитровой трубки в жидкий азот до уровня гранулы ячейки. Сразу после замораживания переложите трубки в жидкий азотный дьюар для длительного хранения.Для спектроскопии поглощения рентгеновского излучения высокого разрешения оптимизируйте все кристаллы спектрометра кристаллического анализатора в условиях Брэгга по отношению к интересующей энергии линии флуоресценции и используйте эталон, для которого, как известно, энергетическое положение края поглощения калибрует падающую энергию монохроматического пучка. Перенесите держатель образца в жидкий криостат гелия для биологических образцов и установите криостат на 10 градусов Кельвина, затем закройте экспериментальную хижину, следуя правилам синхротронной безопасности, и начните анализ. Здесь репрезентативные спектры рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения селена в исходном состоянии и в клетках, инкубированных в питательную среду, демонстрируют, что селен в исходных наночастицах селена присутствовал как в виде нуля селена, так и в виде целлюлитоподобных форм.Однако после взаимодействия с клетками PC3 селен в основном присутствовал в клетках в виде нулевого селена, демонстрируя изменение видов селена в клетках. Для железа эталонные спектры рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения демонстрируют различные положения краев в зависимости от степени окисления железа, при этом восстановленные виды железа смещаются к низким энергетическим значениям. Два последовательных спектра, собранных в одном и том же положении гранулы диатомовых водорослей, были похожи, что указывает на то, что повреждение пучка было ограничено между двумя приобретениями при использовании криостата гелия при 10 Кельвинах.Кроме того, спектры из разных положений гранулы диатомовых водорослей были идентичными, демонстрируя, что гранула образца однородна и что спектры могут быть усреднены для получения лучшего спектра отношения сигнал/шум. Наиболее важными этапами являются подготовка дилдтуиона наночастиц, гранулирование при криогенной температуре и подготовка стандартных эталонных образцов. Эта процедура может быть применена к другим объемным аналитическим методам, таким как ICP-MS или HPLC-ICP-MS или другим несинхротронным спектроскопическим методам, которые могут быть выполнены при криогенной температуре.Другие научные вопросы могут быть изучены с использованием этой процедуры, особенно в области биогеологии, биохимии и наук об окружающей среде или токсикологических исследований. Соединения селена и наночастицы селена могут быть столь же трудными для вашего здоровья и должны обрабатываться в специальном химическом капюшоне с использованием перчаток, очков и маски для лица.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Нецелевые Метаболомики из биологических источников Использование UltraPerformance жидкостной хроматографии высокого разрешения масс-спектрометрии (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

Получение углеродных нанолистов при комнатной температуре

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rapid Высокая пропускная способность Виды Идентификация ботанического материала с использованием прямого анализа в реальном времени с высоким разрешением масс-спектрометрии

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Количественная оценка рентгеновской флуоресценции данных с использованием карты

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Полное внутреннее отражение абсорбционная спектроскопия (Тирас) для обнаружения сольватированного электронов в плазме жидкость интерфейс

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic чипы для In Situ кристалл рентгеновской дифракции и на месте Динамическое рассеяние света для последовательного кристаллографии

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Основные металлические поглощения в грамотрицательных бактерий: рентгеновская флюоресценция, радиоизотопов и клеточной фракционирования

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Элементаль чувствительных обнаружение химии в батареи через мягкие рентгеновской спектроскопии поглощения и резонансных неупругого рентгеновского рассеяния

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...