Agradecemos las contribuciones financieras al desarrollo de la línea de haz por parte de CEMHTI (Orleans, Francia, ANR-13-BS08-0012-01) y Labex OSUG@2020 (Grenoble, Francia, ANR-10-LABX-0056). El proyecto FAME-UHD cuenta con el apoyo financiero del "grand emprunt" francés EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), el consorcio CEA-CNRS CRG y el instituto INSU CNRS. Estamos agradecidos de todas las contribuciones durante los experimentos, especialmente a todas las personas que trabajan en BM30B y BM16. Los autores reconocen la Instalación Europea de Radiación sincrotrón para la provisión de tiempo de haz de radiación sincrotrón. También reconocemos el proyecto PHYTOMET ANR por apoyo financiero (ANR-16-CE01-0008) y el proyecto SEDMAC por apoyo financiero (INCA-Plan cáncer-ASC16019CS).

1. Preparación de los gránulos de células cancerosas PC-3 y OVCAR-3 humanas para la especiación de selenio
NOTA: El siguiente protocolo está adaptado de Weekley et al.10. Todos los pasos deben llevarse a cabo bajo una capucha de cultivo celular bajo condiciones y restricciones de nivel de bioseguridad 2, utilizando técnicas asépticas.
<ol><li>Cuente las células usando una cámara de conteo de células de Malassez. Sembrar 150.000-200.000 células por matraz pa...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Este protocolo se utilizó para estudiar la forma química del selenio y el hierro en muestras biológicas mediante espectroscopia de absorción de rayos X. Se centra en la criopreparación y almacenamiento de muestras biológicas y compuestos de referencia, así como en las mediciones HERFD-XAS.
Criopreparación y almacenamiento La criopreparación de los pellets de muestra biológica a granel permite preservar la integridad química de las especies presentes en las muestr...

El estudio de las biotransformaciones celulares de elementos esenciales o tóxicos requiere técnicas de especiación con alta sensibilidad y debe minimizar los pasos de preparación de muestras que a menudo son propensos a la modificación de especies químicas.
Se sabe que los elementos fisiológicos como el selenio y el hierro son particularmente difíciles de especificar debido a su química compleja, varias estabilidades de las especies de selenio o hierro, y su baja concentración en el rango de ppm (mg / kg) o incluso sub-ppm. Por lo tanto, el estudio de la especiación de estos elementos por XAS puede ser extremadamente desafiante. El sincrotrón XAS y especialmente la fluorescencia de alta resolución de energía detectada XAS (HERFD-XAS), que permite una relación señal-fondo muy baja1, están disponibles en fuentes de sincrotrón para especiar elementos altamente diluidos en matrices biológicas complejas 2,3. Las mediciones convencionales de fluorescencia-XAS se pueden realizar utilizando un detector de estado sólido (SSD) de energía resuelta con un ancho de banda de energía ~ 150–250 eV, en la línea de haz CRG-FAME en la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF)4, mientras que las mediciones HERFD-XAS necesitan un espectrómetro analizador de cristal (CAS), con un ancho de banda de energía ~ 1–3 eV, en la línea de haz CRG-FAME-UHD en el ESRF2 . Los fotones de fluorescencia son discriminados con respecto a su energía con procesos electrónicos u ópticos respectivamente.
La criopreparación de la muestra es esencial para preservar las estructuras y mantener la integridad química de la composición, lo que permite un análisis cercano al estado biológico nativo5. Además, los análisis realizados a temperaturas criogénicas tan bajas como 10 K utilizando enfriamiento criogénico de helio líquido (LN2), permiten que el daño por radiación disminuya la velocidad y preserve la especiación elemental para XAS. Aunque algunas revisiones sobre técnicas XAS aplicadas a muestras biológicas informan de la necesidad de preparar y analizar muestras en condiciones criogénicas (por ejemplo, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), ninguna de ellas describe claramente el protocolo detallado relacionado. En esta publicación, se describe un método para la criopreparación de células cancerosas y microorganismos de plancton para la especiación HERFD-XAS de Se8 y Fe9 a temperatura criogénica.
Las buenas prácticas para la preparación de muestras y el entorno durante las mediciones de espectroscopia XAS de última generación requieren 1) una configuración; 2) un procedimiento de análisis que limite al máximo los efectos del daño por radiación; y 3) una muestra (o referencia de compuesto modelo) lo más homogénea posible con respecto al tamaño del haz de fotones de rayos X. El primer elemento se tiene en cuenta realizando la adquisición a baja temperatura, utilizando un criostato de helio líquido. El segundo ítem se trata realizando cada adquisición en una zona fresca de la muestra moviéndola con respecto a la viga. Finalmente, considerando la tercera condición, las muestras (pellets) y las referencias (polvos) se acondicionan en pellets prensados a granel para limitar al máximo las porosidades e inhomogeneidades, y para evitar la rugosidad con respecto al tamaño del haz en la superficie de la muestra sonda de rayos X. Explicamos cómo el protocolo trata todos estos puntos.
Utilizamos la línea celular de próstata humana PC-3 (alto potencial metastásico) y la línea celular ovárica OVCAR-3 (que representa hasta el 70% de todos los casos de cáncer de ovario) para investigar las propiedades antiproliferativas hacia las células cancerosas de las nanopartículas de selenio (Se-NPs), y la diatomea Phaeodactylum tricornutum como especie modelo para investigar el secuestro de hierro en fitoplancton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

El estudio de elementos con espectroscopia de absorción de rayos X (XAS) es de particular interés cuando se estudia el papel de los metales en los sistemas biológicos. La preparación de muestras es un procedimiento clave y a menudo complejo, particularmente para muestras biológicas. Aunque las técnicas de especiación de rayos X son ampliamente utilizadas, aún no se ha difundido ningún protocolo detallado para los usuarios de la técnica. Además, la modificación del estado químico es motivo de preocupación, y se recomiendan técnicas basadas en crioterapia para analizar las muestras biológicas en su estado hidratado casi nativo para proporcionar la máxima preservación de la integridad química de las células o tejidos. Aquí, proponemos un protocolo de preparación celular basado en muestras criopreservadas. Se demuestra en un estudio de espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución de fluorescencia detectada de selenio en células cancerosas y un estudio de hierro en fitoplancton. Este protocolo se puede utilizar con otras muestras biológicas y otras técnicas de rayos X que pueden dañarse por irradiación.

Los principales objetivos de estas preparaciones fueron investigar la interacción entre las nanopartículas de selenio (Se-NP) y las células cancerosas, y la unión y secuestro de hierro en el fitoplancton.
Los espectros HERFD-XANES del selenio en estado inicial (BSA Se-NPs) y en células incubadas en medio nutritivo (BSA Se-NPs después de 24 h de incubación) se muestran en la Figura 10. Los resultados mostraron que el selenio en los Se-NP iniciales estaba pre...

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Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Este protocolo presenta un procedimiento detallado para preparar criomuestras biológicas para experimentos de espectroscopia de absorción de rayos X basados en sincrotrón. Describimos todos los pasos necesarios para optimizar la preparación y criopreservación de muestras con ejemplos del protocolo con células de cáncer y fitoplancton. Este método proporciona un estándar universal de criopreparación de muestras.

Preparación de muestras biológicas para la especiación a temperatura criogénica mediante espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Este protocolo ha sido estandarizado para especímenes celulares, lo que permite la comparación de experimentos que se ejecutan en diferentes ubicaciones de sincrotrón. La principal ventaja de esta técnica es un flujo de trabajo simple y directo que permite una preservación rápida y confiable de la integración química de la muestra. Las personas nuevas en esta técnica pueden tener dificultades con la peletización de células iteradas congeladas y la carga rápida de la bolita celular en el orden de criosagraba.Una desvinculación precisa y rápida de una muestra en temperatura criogénica es crítica. Como tal, una demostración visual es esencial para entender cómo realizar la técnica. Para preparar gránulos celulares de línea celular de cáncer de próstata y ovario humano para la especiación de selenio, sembra el número apropiado de células de cada línea celular en tres matraces T-75 por condición en el medio de cultivo celular apropiado en una campana de flujo laminar y coloque los matraces en una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que las células sean 80% confluentes.Para exponer las células cancerosas al tratamiento con selenio, primero sonice las soluciones madre de nanopartículas recién preparadas en un baño de agua de ultrasonido durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de diluir en serie la solución de nanopartículas de selenio en un medio de cultivo celular completo a las concentraciones de trabajo apropiadas. En la campana de flujo laminar, lave suavemente las células dos veces con cinco mililitros de PBS de 37 grados Celsius por lavado y use una pipeta estéril de 25 mililitros para agregar cuidadosamente 15 mililitros del tratamiento de selenio de interés al fondo del matraz. Cierre las tapas sin sellar completamente el matraz y colóquelos horizontalmente en la incubadora de cultivo celular durante 24 horas.Para preparar los gránulos celulares después de lavar y reponer el medio de cultivo, use un raspador de células por matraz para separar suavemente las células. Use medio para enjuagar cualquier célula pegada al matraz en el sobrenadante y recoger las células disociadas por centrifugación. Lave los gránulos dos veces en cinco mililitros de PBS por tubo por lavado para eliminar todos los rastros restantes del tratamiento y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS.Transfiera las células a un tubo de polipropileno de 1,5 mililitros y recoja las células con otra centrifugación. Luego use una pipeta de 200 microlitros para eliminar suavemente todo el sobrenadante y sumergir la parte inferior de cada tubo de 1.5 mililitros en nitrógeno líquido al nivel del gránulo celular. Inmediatamente después de la congelación, transfiera los tubos a un dewar de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.Para la espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución, optimice todos los cristales del espectrómetro del analizador de cristales en condiciones bragg con respecto a la energía de interés de la línea de fluorescencia y utilice una referencia para la cual se conoce la posición de energía del borde de absorción para calibrar la energía del haz monocromático incidente. Transfiera el soporte de la muestra a un criostato de helio líquido para muestras biológicas y ajuste el criostato a 10 grados Kelvin, luego cierre la cabina experimental siguiendo las reglas de seguridad del sincrotrón y comience el análisis. Aquí, los espectros representativos de espectroscopía de absorción de rayos X de alta resolución del selenio en el estado inicial y en las células incubadas en medio nutritivo demuestran que el selenio en las nanopartículas iniciales de selenio estaba presente como selenio cero y formas similares a la celulitis.Sin embargo, después de las interacciones con las células PC3, el selenio estaba presente principalmente en las células como selenio cero, lo que demuestra un cambio de las especies de selenio dentro de las células. Para el hierro, los espectros de referencia de espectroscopia de absorción de rayos X de alta resolución exhiben posiciones de borde distintas dependiendo del estado de oxidación del hierro, con especies reducidas de hierro desplazadas a valores de baja energía. Dos espectros sucesivos recogidos en la misma posición de un gránulo de diatomeas fueron similares, lo que indica que el daño del haz estaba limitado entre dos adquisiciones cuando se usaba un criostato de helio a 10 Kelvin.Además, los espectros de diferentes posiciones del pellet de diatomeas fueron idénticos, lo que demuestra que el pellet de muestra era homogéneo y que los espectros podían promediarse para obtener un mejor espectro de relación señal-ruido. Los pasos más críticos son la preparación de la dilución de nanopartículas, la peletización a temperatura criogénica y la preparación de las muestras de referencia estándar. Este procedimiento se puede aplicar a otras técnicas analíticas a granel, como ICP-MS o HPLC-ICP-MS u otras técnicas espectroscópicas no sincrotrón capaces de realizarse de forma criogénica.Otras cuestiones científicas se pueden explorar utilizando este procedimiento, particularmente en los campos de la biogeología, la bioquímica y las ciencias ambientales o la investigación toxicológica. Los compuestos de selenio y las nanopartículas de selenio pueden ser tan arduos para su salud y deben manipularse en una capucha química dedicada con guantes, gafas y una máscara facial.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Investigación

Química

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X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

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Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

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