Vi är tacksamma för ekonomiska bidrag till strålrörsutvecklingen av CEMHTI (Orleans, Frankrike, ANR-13-BS08-0012-01) och Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrike, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-projektet stöds ekonomiskt av det franska "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet och INSU CNRS-institutet. Vi är tacksamma för alla bidrag under experimenten, särskilt alla personer som arbetar med BM30B och BM16. Författarna erkänner european synchrotron radiation facility för tillhandahållande av synkrotronstrålningsstråletid. Vi erkänner också PHYTOMET ANR-projektet för ekonomiskt stöd (ANR-16-CE01-0008) och SEDMAC-projektet för ekonomiskt stöd (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

1. Beredning av humana PC-3 och OVCAR-3 cancercellspellets för selenspeciering
OBS: Följande protokoll är anpassat från Weekley et al.10. Alla steg måste utföras under en cellodlingshuv under biosäkerhetsnivå 2-förhållanden och begränsningar, med hjälp av aseptiska tekniker.
<ol><li>Räkna cellerna med hjälp av en Malassez cellräkningskammare. Frö 150 000–200 000 celler per kolv för PC-3-cellinjen och 300 000 celler för OVCAR-3-cellinjen.</li>
	<li>...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Detta protokoll användes för att studera den kemiska formen av selen och järn i biologiska prover genom röntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserar på kryoberedning och lagring av biologiska prover och referensföreningar, liksom på HERFD-XAS-mätningarna.
Kryoberedning och lagring Kryoberedningen av det biologiska bulkprovpelletset möjliggör bevarande av den kemiska integriteten hos de arter som finns i proverna. Detta är avgörande, eftersom artbildningsförän...

Studien av cellulära biotransformationer av väsentliga eller giftiga element kräver specieringstekniker med hög känslighet och bör minimera provberedningssteg som ofta är benägna att modifiera kemiska arter.
Fysiologiska element som selen och järn är kända för att vara särskilt svåra att specificera på grund av deras komplexa kemi, olika förmågor hos selen- eller järnarterna och deras låga koncentration i ppm (mg / kg) eller till och med under ppm-intervallet. Således kan studien av speciering av dessa element av XAS vara extremt utmanande. Synkrotron XAS och särskilt hög energiupplöst fluorescensdetekterat XAS (HERFD-XAS), som möjliggör ett mycket lågt signal-till-bakgrundsförhållande1, finns tillgängliga vid synkrotronkällor för att specificera mycket utspädda element i komplexa biologiska matriser 2,3. Konventionella fluorescens-XAS-mätningar kan utföras med hjälp av en energiupplöst solid state-detektor (SSD) med en energibandbredd ~ 150–250 eV, på CRG-FAME-strålröret vid European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, medan HERFD-XAS-mätningar behöver en kristallanalysatorspektrometer (CAS), med en energibandbredd ~ 1–3 eV, på CRG-FAME-UHD-strålröret vid ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineras med avseende på sin energi med elektroniska respektive optiska processer.
Provet kryoberedning är viktigt för att bevara strukturer och upprätthålla sammansättningskemisk integritet, vilket möjliggör analys nära det biologiska ursprungstillståndet5. Dessutom tillåter analyser som utförs vid kryogena temperaturer så låga som 10 K med flytande heliumkryogen kylning (LN2) strålningsskador att sakta ner och bevara elementär speciering för XAS. Även om vissa recensioner av XAS-tekniker som tillämpas på biologiska prover rapporterar nödvändigheten av att förbereda och analysera prover under kryogena förhållanden (t.ex. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen av dem tydligt det relaterade detaljerade protokollet. I denna publikation beskrivs en metod för kryoberedning av cancerceller och planktonmikroorganismer för HERFD-XAS-speciering av Se8 och Fe9 vid kryogen temperatur.
God praxis för provberedning och miljö under toppmoderna XAS-spektroskopimätningar kräver 1) en installation; 2) ett analysförfarande som begränsar effekterna av strålskador så mycket som möjligt; och 3) ett prov (eller modellföreningsreferens) så homogent som möjligt med avseende på röntgenfotonstrålens strålstorlek. Det första objektet beaktas genom att utföra förvärvet vid låg temperatur med användning av en flytande heliumkryostat. Den andra posten behandlas genom att utföra varje förvärv på ett nytt område av provet genom att flytta det med avseende på strålen. Slutligen, med tanke på det tredje villkoret, konditioneras prover (pellets) och referenser (pulver) i pressade bulkpellets för att begränsa porositeter och inhomogeniteter så mycket som möjligt och för att undvika grovhet med avseende på strålstorleken på röntgensondprovytan. Vi förklarar hur protokollet behandlar alla dessa punkter.
Vi använde human prostata cellinje PC-3 (hög metastatisk potential) och äggstockscelllinje OVCAR-3 (som står för upp till 70% av alla äggstockscancerfall) för att undersöka de antiproliferativa egenskaperna mot cancerceller hos selennanopartiklar (Se-NP) och Phaeodactylum tricornutum diatom som modellart för att undersöka järnbindning i fytoplankton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

Studien av grundämnen med röntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) är av särskilt intresse när man studerar metallers roll i biologiska system. Provberedning är ett viktigt och ofta komplext förfarande, särskilt för biologiska prover. Även om röntgenspecieringstekniker används i stor utsträckning har inget detaljerat protokoll ännu spridits för användare av tekniken. Vidare är kemisk tillståndsmodifiering oroande, och kryobaserade tekniker rekommenderas för att analysera de biologiska proverna i deras nästan infödda hydratiserade tillstånd för att ge maximal bevarande av cellernas eller vävnadernas kemiska integritet. Här föreslår vi ett cellulärt beredningsprotokoll baserat på kryobevarade prover. Det demonstreras i en fluorescens med hög energiupplösning upptäckt röntgenabsorptionsspektroskopistudie av selen i cancerceller och en studie av järn i fytoplankton. Detta protokoll kan användas med andra biologiska prover och andra röntgentekniker som kan skadas av bestrålning.

Huvudsyftet med dessa preparat var att undersöka interaktionen mellan selennanopartiklar (Se-NP) och cancerceller, och järnbindning och sekvestrering i växtplankton.
HERFD-XANES-spektra av selen i initialt tillstånd (BSA Se-NP) och i celler inkuberade i näringsmedium (BSA Se-NP efter 24 timmars inkubation) visas i figur 10. Resultaten visade att selen i de initiala Se-NP: erna var närvarande som både Se (0) och selenitliknande former, medan efter...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Detta protokoll presenterar ett detaljerat förfarande för att förbereda biologiska kryomplar för synkrotronbaserade röntgenabsorptionsspektroskopiexperiment. Vi beskriver alla steg som krävs för att optimera provberedning och kryokonservering med exempel på protokollet med cancer- och växtplanktonceller. Denna metod ger en universell standard för prov kryoberedning.

Biologiska prover Förberedelse för speciering vid kryogen temperatur med hjälp av högupplöst röntgenabsorptionsspektroskopi

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Detta protokoll har standardiserats för cellulära prover, vilket möjliggör jämförelse av experiment som körs på olika synkrotronplatser. Den största fördelen med denna teknik är ett enkelt och enkelt arbetsflöde som möjliggör en snabb och pålitlig bevarande av provets kemiska integration. Individer som är nya för denna teknik kan kämpa med de frusna itererade cellerna som pelleterar och den snabba laddningen av cellpelleten i kryosamletordningen.En exakt och snabb avlänkning av ett prov i kryogen temperatur är avgörande. Som sådan är en visuell demonstration en viktig faktor för att förstå hur man utför tekniken. För att förbereda human prostata och äggstockscancer cellinjepellets för selen speciering, frö lämpligt antal celler från varje cellinje i tre T-75-kolvar per tillstånd i lämpligt cellodlingsmedium i en laminär flödeshuv och placera kolvarna i 37 grader Celsius och 5% koldioxidcellodlingsinkubator tills cellerna är 80% sammanflytande.För att utsätta cancercellerna för selenbehandling, först sonikat nyberedda nanopartikel lagerlösningar i ett ultraljud vattenbad i 30 minuter vid rumstemperatur innan seriellt spädning selen nanopartikel lösning i komplett cellodling medium till lämpliga arbetskoncentrationer. Tvätta cellerna försiktigt två gånger med fem milliliter 37 grader Celsius PBS per tvätt i den laminära flödeshuven och använd en steril 25 ml pipett för att försiktigt tillsätta 15 ml av selenbehandlingen av intresse till botten av kolven. Stäng locken utan att helt försegla kolven och placera kolvarna horisontellt i cellodlingsinkubatorn i 24 timmar.För att förbereda cellpellets efter tvättning och påfyllning av odlingsmediet, använd en cellskrapa per kolv för att försiktigt lossa cellerna. Använd medium för att spola alla celler som sitter fast vid kolven i supernatanten och samla de dissocierade cellerna genom centrifugering. Tvätta pellets två gånger i fem milliliter PBS per rör per tvätt för att ta bort alla återstående spår av behandlingen och återsuspendera cellerna i en milliliter PBS.Överför cellerna till ett 1,5 ml polypropenrör och samla cellerna med en annan centrifugering. Använd sedan en 200 mikroliterpipett för att försiktigt ta bort all supernatant och kasta den nedre delen av varje 1.5 ml rör i flytande kväve till cellpelletens nivå. Omedelbart efter frysning, överför rören till en flytande kväve dewar för långvarig lagring.För högupplöst röntgenabsorptionsspektroskopi, optimera alla kristaller från kristallanalysatorspektrometern i Bragg-förhållanden med avseende på fluorescenslinjens energi av intresse och använd en referens för vilken absorptionskantens energiposition är känd för att kalibrera den infallande monokromatiska strålenergin. Överför provhållaren till en flytande heliumkryostat för biologiska prover och ställ in kryostaten till 10 grader Kelvin, stäng sedan experimenthyttan enligt synkrotronsäkerhetsreglerna och börja analysen. Här visar representativa högupplösta röntgenabsorptionsspektroskopispektra av selen i det ursprungliga tillståndet och i celler inkuberade till näringsmedium att selen i de initiala selennanopartiklarna var närvarande som både selen noll och celluliterliknande former.Efter interaktioner med PC3-cellerna var selen emellertid huvudsakligen närvarande i cellerna som selen noll, vilket visar en förändring av selenarter i cellerna. För järn uppvisar högupplösta röntgenabsorptionsspektroskopireferensspektra distinkta kantpositioner beroende på järnoxidationstillståndet, med reducerade järnarter förskjutna till låga energivärden. Två på varandra följande spektra som samlats in på samma position som en kiselalgspellets var likartade, vilket indikerar att strålskadan var begränsad mellan två förvärv vid användning av en heliumkryostat vid 10 Kelvin.Dessutom var spektra från olika positioner av kiselalgspelleten identiska, vilket visade att provpelleten var homogen och att spektra kunde beräknas i genomsnitt för att erhålla ett bättre signal-brusförhållandespektrum. De mest kritiska stegen är beredningen av nanopartikeldiiltuionen, pelletering vid kryogen temperatur och beredningen av standardreferensproverna. Denna procedur kan tillämpas på andra bulkanalystekniker, såsom ICP-MS eller HPLC-ICP-MS eller andra icke-synkrotronspektroskopiska tekniker som kan utföras från kryogen temperatur.Andra vetenskapliga frågor kan utforskas med hjälp av detta förfarande, särskilt inom biogeologi, biokemi och miljövetenskap eller toxikologisk forskning. Selenföreningar och selennanopartiklar kan vara lika svåra för din hälsa och bör manipuleras i en dedikerad kemisk huva med handskar, glasögon och ansiktsmask.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Oriktade Metabolomics från biologiska källor Använda Ultraperformance vätskekromatografi-högupplösande masspektrometri (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

Framställning av Carbon Nanosheets vid rumstemperatur

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Rapid med hög kapacitet Art Identifiering av Botanical Material med direkt analys i realtid högupplöst masspektrometri

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kvantifiera X-Ray fluorescens Data med hjälp av kartor

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Totalreflexion Absorption spektroskopi (TIRAS) för detektion av solvatiserade elektroner på en Plasma-flytande gränssnitt

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikroflödessystem marker för In Situ Crystal röntgendiffraktion och In Situ dynamiska ljusspridning för seriell Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Väsentliga metall upptag i gramnegativa bakterier: X-ray fluorescens, radioisotoper, och Cell fraktionering

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-känslig detektion av kemi i batterier genom mjuk X-ray Absorption spektroskopi och Resonant oelastisk X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Att förbättra hög viskositet extrudering av Mikrokristaller för tid-löst seriell femtosekund Crystallography på röntgen lasrar

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...