CEMHTI (Orleans, Fransa, ANR-13-BS08-0012-01) ve Labex OSUG@2020 (Grenoble, Fransa, ANR-10-LABX-0056) tarafından ışın hattı gelişimine yapılan finansal katkılar için minnettarız. FAME-UHD projesi, Fransız "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG konsorsiyumu ve INSU CNRS Enstitüsü tarafından finansal olarak desteklenmektedir. Deneyler sırasındaki tüm katkılardan, özellikle BM30B ve BM16 üzerinde çalışan tüm kişilere minnettarız. Yazarlar, senkrotron radyasyon ışın süresinin sağlanması için Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi'ni kabul etmektedir. Ayrıca finansal destek için PHYTOMET ANR projesini (ANR-16-CE01-0008) ve finansal destek için SEDMAC projesini (INCA-Plan kanser-ASC16019CS) kabul ediyoruz.

1. Selenyum türleşmesi için insan PC-3 ve OVCAR-3 kanser hücresi peletlerinin hazırlanması
NOT: Aşağıdaki protokol Weekley et al.10'dan uyarlanmıştır. Tüm adımlar, aseptik teknikler kullanılarak, biyogüvenlik seviye 2 koşulları ve kısıtlamaları altında bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Malassez hücre sayma odasını kullanarak hücreleri sayın. PC-3 hücre hattı için şişe başına 150.000-200.000 h?...

<ol>
	<li>Llorens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+energy+resolution+five-crystal+spectrometer+for+high+quality+fluorescence+and+absorption+measurements+on+an+x-ray+absorption+spectroscopy+beamline.">High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline.</a> Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Energy+Resolution+Fluorescence+Detected+X-ray+Absorption+Spectroscopy:+a+new+powerful+structural+tool+in+environmental+biogeochemistry+sciences.">High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences.</a> Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Proux, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAME:+a+new+beamline+for+X-ray+absorption+investigations+of+very-diluted+systems+of+environmental,+material+and+biological+interests.">FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests.</a> Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).</li><li>Sarret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Synchrotron-Based+techniques+to+Elucidate+Metal+Uptake+and+Metabolism+in+Plants.">Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants.</a> Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).</li><li>Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+element+speciation+analysis+of+biomedical+samples+using+synchrotron-based+techniques.">Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques.</a> Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).</li><li>Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China Available from: <a target="_blank" href="https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7">https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7</a> (2018)</li><li>Weekley, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speciation+of+Seleno-amino+Acids+by+Human+Cancer+Cells:+X-ray+Absorption+and+Fluorescence+Methods.">Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods.</a> Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).</li><li>Sutak, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+iron+uptake+mechanisms+in+marine+microalgae:+Iron+binding+at+the+cell+surface+is+a+critical+step.">A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step.</a> Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).</li><li>Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+constructing+an+international+XAFS+database.">The challenge of constructing an international XAFS database.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).</li><li>SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure Available from: <a target="_blank" href="https://www.sshade.eu/">https://www.sshade.eu/</a> (2018)</li><li>Bissardon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-ppm+high+energy+resolution+fluorescence+detected+X-ray+absorption+spectroscopy+of+selenium+in+articular+cartilage.">Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage.</a> Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).</li><li>Ravel, B., Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATHENA,+ARTEMIS,+HEPHAESTUS:+data+analysis+for+X-ray+absorption+spectroscopy+using+IFEFFIT.">ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).</li><li>Webb, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIXpack:+a+graphical+user+interface+for+XAS+analysis+using+IFEFFIT.">SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT.</a> Physica Scripta. 115, 1011 (2005).</li><li>Klementiev, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VIPER+for+Windows.">VIPER for Windows.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).</li><li>Newville, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+of+XAFS.">Fundamental of XAFS.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 33-74 (2014).</li><li>Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+Absorption+Near-Edge+Structure+(XANES)+Spectroscopy.">X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy.</a> Reviews in Mineralogy &amp; Geochemistry. 78, 75-138 (2014).</li><li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial.">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li><li>Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME Available from: <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019)</li><li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li></ol>

Bu protokol, X-ışını absorpsiyon spektroskopisi ile biyolojik örneklerde selenyum ve demirin kimyasal formunu incelemek için kullanılmıştır. Biyolojik numunelerin ve referans bileşiklerin kriyo-hazırlanması ve depolanmasının yanı sıra HERFD-XAS ölçümlerine odaklanmaktadır.
Kriyo-hazırlama ve depolama Toplu biyolojik numune peletlerinin kriyo-hazırlanması, numunelerde bulunan türlerin kimyasal bütünlüğünün korunmasını sağlar. Bu çok önemli...

Esansiyel veya toksik elementlerin hücresel biyotransformasyonlarının incelenmesi, yüksek hassasiyetli türleşme teknikleri gerektirir ve genellikle kimyasal türlerin modifikasyonuna eğilimli numune hazırlama adımlarını en aza indirmelidir.
Selenyum ve demir gibi fizyolojik elementlerin, karmaşık kimyaları, selenyum veya demir türlerinin çeşitli stabiliteleri ve ppm (mg / kg) veya hatta sub-ppm aralığındaki düşük konsantrasyonları nedeniyle türleşmesinin özellikle zor olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, bu elementlerin XAS tarafından türleşmesinin incelenmesi son derece zor olabilir. Senkrotron XAS ve özellikle çok düşük bir sinyal-arka plan oranı1'e izin veren yüksek enerji çözünürlüklü floresan algılanan XAS (HERFD-XAS), karmaşık biyolojik matrislerde yüksek oranda seyreltilmiş elementleri türleştirmek için senkrotron kaynaklarında mevcuttur 2,3. Geleneksel floresan-XAS ölçümleri, Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi'ndeki (ESRF)4'teki CRG-FAME ışın hattında, enerji bant genişliği ~150–250 eV'ye sahip enerji çözümlü bir katı hal dedektörü (SSD) kullanılarak gerçekleştirilebilirken, HERFD-XAS ölçümleri ESRF2'deki CRG-FAME-UHD ışın hattında ~1–3 eV enerji bant genişliğine sahip bir kristal analizör spektrometresine (CAS) ihtiyaç duyar. . Floresan fotonlar, sırasıyla elektronik veya optik işlemlerle enerjilerine göre ayırt edilir.
Numune kriyo-preparatı, yapıları korumak ve bileşimsel kimyasal bütünlüğü korumak için gereklidir, böylece biyolojik doğal duruma yakın analizlere izin verir5. Ayrıca, sıvı helyum kriyojenik soğutma (LN2) kullanılarak 10 K'ya kadar düşük kriyojenik sıcaklıklarda yapılan analizler, radyasyon hasarının XAS için temel türleşmeyi yavaşlatmasına ve korumasına izin verir. Biyolojik örneklere uygulanan XAS teknikleri üzerine yapılan bazı incelemeler, kriyojenik koşullarda numune hazırlama ve analiz etme gerekliliğini bildirse de (örneğin, Sarret ve ark.6, Porcaro ve ark.7), hiçbiri ilgili ayrıntılı protokolü açıkça tanımlamamaktadır. Bu yayında, kriyojenik sıcaklıkta Se8 ve Fe9'un HERFD-XAS türleşmesi için kanser hücrelerinin ve plankton mikroorganizmalarının kriyo-hazırlanması için bir yöntem tanımlanmıştır.
Son teknoloji XAS spektroskopisi ölçümleri sırasında numune hazırlama ve çevre için iyi uygulama 1) bir kurulum gerektirir; 2) radyasyon hasarının etkilerini mümkün olduğunca sınırlayan bir analiz prosedürü; ve 3) X-ışını fotonlarının ışın boyutuna göre mümkün olduğunca homojen bir numune (veya model bileşik referansı). İlk madde, bir sıvı helyum kriyostat kullanarak, düşük bir sıcaklıkta elde etme işlemi gerçekleştirilerek dikkate alınır. İkinci madde, numunenin taze bir alanı üzerinde her bir kazanımın, kirişe göre hareket ettirilerek gerçekleştirilmesiyle ele alınır. Son olarak, üçüncü koşul göz önüne alındığında, gözeneklilikleri ve homojensizlikleri mümkün olduğunca sınırlamak ve X-ışını problu numune yüzeyindeki kiriş boyutuna göre pürüzlülüğü önlemek için numuneler (peletler) ve referanslar (tozlar) preslenmiş dökme peletlerde şartlandırılır. Protokolün tüm bu noktalarla nasıl başa çıktığını açıklıyoruz.
İnsan prostat hücre hattı PC-3 (yüksek metastatik potansiyel) ve yumurtalık hücre hattı OVCAR-3'ü (tüm yumurtalık kanseri vakalarının% 70'ini oluşturur) selenyum nanopartiküllerinin (Se-NP'ler) kanser hücrelerine yönelik antiproliferatif özellikleri araştırmak için kullandık ve fitoplanktonda demir tutumunu araştırmak için model bir tür olarak Phaeodactylum tricornutum diatom.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2175px;" width="2174">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:352px;">Ammonium nitrate</td>
			<td style="width:208px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:389px;">A3795</td>
			<td style="width:1225px;">NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anaerobic chamber</td>
			<td>Coy Laboratory, USA</td>
			<td></td>
			<td>equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boron nitride powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">255475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell counting chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neubauer or Malassez</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell scraper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14190-094</td>
			<td>Without Calcium, Magnesium, Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.5 mL and 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>15 mL and 50 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ferric citrate Fe/citrate = 1/20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3388</td>
			<td>aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A31604-02</td>
			<td>Performance Plus, certified One Shot format, US origin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z707503</td>
			<td>TPP 150 cm2 area</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>Sanyo MLR-352</td>
			<td>at 20 &#176;C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>1 g/L of milliQ water HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High grade serous, OVCAR-3</td>
			<td>ATCC, Rockville, MD</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubator at 37&#176;C, humidified atmosphere with 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516</td>
			<td>10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Manual hydraulic press</td>
			<td>Specac, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Marine diatom Phaeodactylum tricornutum</td>
			<td>Roscoff culture collection</td>
			<td>RCC69</td>
			<td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Morpholinepropanesulfonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td>MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Optical microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PC-3</td>
			<td>ECCAC, Salisbury, UK</td>
			<td align="right">90112714</td>
			<td>Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pipette-boy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plankton culture products, Mf medium: Sea salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9883</td>
			<td>40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic tweezers</td>
			<td>Oxford Instrument</td>
			<td>AGT 5230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>A10491-01</td>
			<td>Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>Se50-BS-1</td>
			<td>BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL</td>
			<td>NANOCS Company, USA</td>
			<td>11. Se50-CS-1</td>
			<td>Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4&#176;C in the dark, protected from the light.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium metasilicate pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">71746</td>
			<td>Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium nitrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5022</td>
			<td>NaNO3, 75 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td>NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flasks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trace metal stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypan Blue Solution (0.4%)</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td align="right">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vitamin stock</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12</td>
			<td>1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath 37&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological samples preparation for speciation at cryogenic temperature using high-resolution  x-ray absorption spectroscopy

X-ışını absorpsiyon spektroskopisi (XAS) ile elementlerin incelenmesi, metallerin biyolojik sistemlerdeki rolünü incelerken özellikle ilgi çekicidir. Numune hazırlama, özellikle biyolojik numuneler için önemli ve genellikle karmaşık bir prosedürdür. X-ışını türleştirme teknikleri yaygın olarak kullanılmasına rağmen, tekniğin kullanıcıları için henüz ayrıntılı bir protokol yayılmamıştır. Ayrıca, kimyasal durum modifikasyonu endişe vericidir ve hücrelerin veya dokuların kimyasal bütünlüğünün maksimum korunmasını sağlamak için biyolojik numuneleri neredeyse doğal hidratlanmış hallerinde analiz etmek için kriyo bazlı teknikler önerilir. Burada, kriyo-korunmuş örneklere dayanan bir hücresel hazırlama protokolü öneriyoruz. Kanser hücrelerinde selenyumun yüksek enerji çözünürlüklü floresan saptanan X-ışını absorpsiyon spektroskopisi çalışmasında ve fitoplanktonda demirin incelenmesinde gösterilmiştir. Bu protokol, diğer biyolojik örnekler ve ışınlama ile zarar görebilecek diğer X-ışını teknikleri ile birlikte kullanılabilir.

Bu preparatların temel amacı, selenyum nanopartikülleri (Se-NP'ler) ve kanser hücreleri arasındaki etkileşimi ve fitoplanktonlarda demir bağlama ve sekestrasyonunu araştırmaktı.
Selenyumun başlangıç halindeki (BSA Se-NP'ler) ve besleyici ortamda inkübe edilen hücrelerdeki (24 saatlik inkübasyondan sonra BSA Se-NP'ler) HERFD-XANES spektrumları Şekil 10'da gösterilmiştir. Sonuçlar, ilk Se-NP'lerdeki selenyumun hem Se (0) hem de selenit benzeri f...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy at JoVE.com

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

Bu protokol, senkrotron tabanlı X-ışını absorpsiyon spektroskopisi deneyleri için biyolojik kriyoörnekler hazırlamak için ayrıntılı bir prosedür sunar. Numune hazırlama ve kriyoprezervasyonu optimize etmek için gereken tüm adımları, kanser ve fitoplankton hücreleri ile protokol örnekleri ile açıklıyoruz. Bu yöntem, evrensel bir numune kriyo-hazırlama standardı sağlar.

Yüksek Çözünürlüklü X-Işını Absorpsiyon Spektroskopisi Kullanılarak Kriyojenik Sıcaklıkta Türleşme için Biyolojik Numunelerin Hazırlanması

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...

Bu protokol, hücresel örnekler için standartlaştırılmıştır ve farklı senkrotron konumlarında çalışan deneylerin karşılaştırılmasına izin verilmiştir. Bu tekniğin temel avantajı, numunenin kimyasal entegrasyonunun hızlı ve güvenilir bir şekilde korunmasını sağlayan basit ve anlaşılır bir iş akışıdır. Bu teknikte yeni olan bireyler, dondurulmuş yinelenmiş hücrelerin peletlenmesi ve hücresel peletin kriyonumune düzenine hızlı yüklenmesi ile mücadele edebilir.Kriyojenik sıcaklıkta bir numunenin bağlantısının kesin ve hızlı bir şekilde kesilmesi çok önemlidir. Bu nedenle, görsel bir gösterim, tekniğin nasıl uygulanacağını anlamak için çok önemlidir. Selenyum türleşmesi için insan prostat ve yumurtalık kanseri hücre hattı hücre peletlerini hazırlamak için, her hücre hattından uygun sayıda hücreyi, laminer bir akış başlığında uygun hücre kültürü ortamında koşul başına üç T-75 şişesine tohumlayın ve şişeleri% 80 birleşene kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Kanser hücrelerini selenyum tedavisine maruz bırakmak için, selenyum nanopartikül çözeltisini tam hücre kültürü ortamında uygun çalışma konsantrasyonlarına seri olarak seyreltmeden önce, önce oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir ultrason su banyosunda taze hazırlanmış nanopartikül stok çözeltilerini sonikleştirin. Laminer akış başlığında, hücreleri yıkama başına beş mililitre 37 santigrat derece PBS ile iki kez nazikçe yıkayın ve şişenin dibine 15 mililitre selenyum muamelesinin 15 mililitresini dikkatlice eklemek için steril bir 25 mililitre pipet kullanın. Şişeyi tamamen kapatmadan kapakları kapatın ve şişeleri 24 saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne yatay olarak yerleştirin.Kültür ortamını yıkadıktan ve yeniledikten sonra hücre peletlerini hazırlamak için, hücreleri nazikçe ayırmak için şişe başına bir hücre kazıyıcı kullanın. Şişeye yapışmış hücreleri süpernatantın içine yıkamak ve ayrışmış hücreleri santrifüjleme yoluyla toplamak için orta kullanın. Tedavinin kalan tüm izlerini gidermek ve hücreleri bir mililitre PBS'de yeniden askıya almak için peletleri yıkama başına tüp başına beş mililitre PBS'de iki kez yıkayın.Hücreleri 1.5 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın ve hücreleri başka bir santrifüjleme ile toplayın. Ardından, tüm süpernatantı nazikçe çıkarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve her 1,5 mililitrelik tüpün alt kısmını hücre peleti seviyesine kadar sıvı azota batırın. Dondurulduktan hemen sonra, tüpleri uzun süreli depolama için sıvı azot dewarına aktarın.Yüksek çözünürlüklü x-ışını absorpsiyon spektroskopisi için, Bragg koşullarındaki kristal analizörü spektrometresindeki tüm kristalleri, ilgilenilen floresan hattı enerjisine göre optimize edin ve gelen monokromatik ışın enerjisini kalibre etmek için absorpsiyon kenarının enerji konumunun bilindiği bir referans kullanın. Numune tutucuyu biyolojik numuneler için sıvı helyum kriyostata aktarın ve kriyostatı 10 derece Kelvin'e ayarlayın, ardından senkrotron güvenlik kurallarını izleyerek deneysel kulübeyi kapatın ve analize başlayın. Burada, selenyumun başlangıç durumundaki ve besleyici ortama inkübe edilen hücrelerdeki temsili yüksek çözünürlüklü x-ışını absorpsiyon spektroskopisi spektrumları, ilk selenyum nanopartiküllerindeki selenyumun hem selenyum sıfır hem de selülit benzeri formlar olarak mevcut olduğunu göstermektedir.Bununla birlikte, PC3 hücreleri ile etkileşimlerden sonra, selenyum esas olarak hücrelerde selenyum sıfır olarak mevcuttu ve bu da hücrelerdeki selenyum türlerinin değiştiğini gösterdi. Demir için, yüksek çözünürlüklü x-ışını absorpsiyon spektroskopisi referans spektrumları, demir oksidasyon durumuna bağlı olarak farklı kenar konumları sergiler ve azaltılmış demir türleri düşük enerji değerlerine kaydırılır. Bir diatom peletinin aynı pozisyonunda toplanan iki ardışık spektrum benzerdi, bu da 10 Kelvin'de bir helyum kriyostat kullanıldığında ışın hasarının iki kazanım arasında sınırlı olduğunu gösteriyordu.Ayrıca, diyatom peletinin farklı konumlarından gelen spektrumlar aynıydı, bu da numune peletinin homojen olduğunu ve spektrumların daha iyi bir sinyal-gürültü oranı spektrumu elde etmek için ortalamasının alınabileceğini gösterdi. En kritik adımlar, nanopartikül diltüyonunun hazırlanması, kriyojenik sıcaklıkta peletleme ve standart referans numunelerin hazırlanmasıdır. Bu prosedür, ICP-MS veya HPLC-ICP-MS gibi diğer toplu analitik tekniklere veya kriyojenik sıcaklıkta gerçekleştirilebilen diğer senkrotron olmayan spektroskopik tekniklere uygulanabilir.Diğer bilimsel sorular, özellikle biyojeoloji, biyokimya ve çevre bilimleri veya toksikoloji araştırmaları alanlarında bu prosedür kullanılarak araştırılabilir. Selenyum bileşikleri ve selenyum nanopartikülleri sağlığınız için zor olabilir ve eldivenler, gözlükler ve yüz maskesi kullanılarak özel bir kimyasal başlıkta manipüle edilmelidir.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Kimyasal Fiksasyon X-ışını Floresans Görüntüleme Değme Hücreleri hazırlanması

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Preparation of Carbon Nanosheets at Room Temperature

Oda sıcaklığında karbon Nanosheets hazırlanması

Amphiphilic molecules equipped with a reactive, carbon-rich "oligoyne" segment consisting of conjugated carbon-carbon triple bonds self-assemble into ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Gerçek Zamanlı Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometresi Doğrudan Analizi Kullanılarak Botanik Malzeme Hızlı Yüksek verim Türler Kimlik

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

HARİTALAR kullanarak x-ışını Floresans veri miktarının

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy (TIRAS) for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Total Internal Reflection Absorption Spectroscopy TIRAS for the Detection of Solvated Electrons at a Plasma-liquid Interface

Toplam iç yansıma soğurma spektroskopisi (TIRAS) Solvated elektron vasıl bir plazma-sıvı arayüzey tespiti için

The total internal reflection absorption spectroscopy (TIRAS) method presented in this article uses an inexpensive diode laser to detect solvated ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

Ayagin Gram-negatif bakterilerde temel Metal alımı: x-ışını Floresans, Radioisotopes ve hücre ayırma

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Pil ile yumuşak x-ışını soğurma spektroskopisi ve rezonans esnek olmayan x-ışını saçılması kimyada Elemental duyarlı tespiti

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Microcrystals yüksek viskozite ekstrüzyon için zaman karar vermek seri halinde Femtosecond kristalografisi x-ışını lazerleri iyileştirilmesi

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...