Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af kernebudgettet fra p53lab (BMSI, A * STAR) og JCO VIP-tilskuddet (A * STAR).

HEK293 celle linje blev brugt til protokollen og blev dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium suppleret med 10% Føtal Kvæg Serum, 2 mM L-glutamin, og 100 U / mL penicillin / streptomycin. Cellerne blev dyrket ved 37 °C med 5% CO2 i et befugtet miljø.
1. Kvantitativ vurdering af eIF4F-komplekse forstyrrelser via eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalyse
<ol><li>Cellekultur og forbigående transfekt af eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalyse<ol>
<li>B...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Den metode, der er beskrevet i denne artikel, anvender en luciferasebaseret komplementeringsanalyse til kvantitativ overvågning af eIF4F-kompleks samling gennem direkte måling af eIF4G-eIF4E-interaktion i levende celler. Vi har givet oplysninger om brugen af eIF4E-eIF4G-komplementeringssystem, og vi har også vist, at systemet er ekstremt nøjagtigt til måling af lægemiddelinduceret 4EBP1-medieret dissociation af eIF4E-eIF4G-interaktion16. For at lette gennemstrømningen af denne analyse er de...

Kontrol af genekspression spiller en central rolle i den korrekte udførelse af cellulære programmer såsom vækstspredning og differentiering. Der kan udøves en reguleringskontrolmekanisme enten med hensyn til gentransskription eller med hensyn til mRNA-oversættelse. I det sidste årti er det blevet mere og mere tydeligt, at translationel kontrol ved graduering af indledningsprocessen snarere end de senere trin i forlængelse og afslutning fint kan regulere syntesen af specifikke delmængder af proteiner, der spiller en bred vifte af biologiske funktioner.
Øget oversættelse af mRNA'er, der er involveret i overlevelse, anti-autofagiske og antiapptotiske reaktioner, har været impliceret i flere kræftformer og er også blevet årsagssammenhæng med enten afvigende aktivering eller over ekspression af oversættelsesinitieringsfaktorer1.
eIF4F-komplekset er en overordnet regulator for oversættelsesinitiering. Ved at binde cap-strukturen på 5 'slutningen af mRNA'er, eIF4F driver indledende mRNA-ribosome rekruttering og til gengæld øge mRNA oversættelse effektivitet svagt oversat eukaryote mRNA2. eIF4F medieret oversættelse af kræft-relaterede mRNA'er er blevet rapporteret for mange kræftmodeller huser afvigende aktivering af RAS / MAPK eller AKT / TOR veje, tyder på, at kræftceller opregulere eIF4F at øge deres egen pro-neoplastiske aktivitet. Forstyrrelse af denne fremføringssløjfe ved at hæmme eIF4F-kompleksdannelse er derved en meget lovende terapeutisk strategi3,4.
eIF4F-komplekset består af (i) eIF4E, den cap-bindende underenhed af eIF4F, der interagerer med den cap struktur findes på 5 'UTR af mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase og (iii) eIF4G, stilladset protein, der interagerer med både eIF4A og eIF4E, og som i sidste ende rekrutter 40S ribosomal underenhed5. eIF4G-tilknytning til eIF4E er det hastighedsbegrænsende trin for samling af funktionelle eIF4F-komplekser, og det reguleres negativt af eIF4E-bindingsproteinerne (4MP'er, medlemmer 1, 2 og 3))6. Ved at konkurrere med eIF4G-binding til eIF4E via en grænseflade, der består af kanoniske og ikke-kanoniske eIF4E-bindingssekvenser7,8,9 (region, der spænder over aa 604-646 på human eIF4E), reducerer 4EBP puljen af eIF4E, der er aktivt involveret i oversættelse og forebyggelse af eIF4F-kompleks dannelse. Samspillet mellem disse proteinproteininteraktioner reguleres hovedsageligt af pattedyrsmålet for rapamycin (mTOR)-medieret fosforylering af 4EBP. Ved mitogen stimuli fosforerer mTOR direkte medlemmerne af 4E-BP-proteinfamilien, reducerer deres tilknytning til eIF4E og fremmer dermed eIF4E-eIF4G-interaktion og dannelse af funktionelle eIF4F-komplekser10.
På trods af den store indsats for at udvikle forbindelser rettet mod eIF4F kompleks integritet, har manglen på assays måle direkte afbrydelse af eIF4E-eIF4G interaktion i levende celler begrænset søgningen efter cellulære aktive hit forbindelser. Vi har anvendt en luciferase assay baseret på en coelenterazine analog (f.eks Nanoluc-baserede komplementering assay) til at overvåge i realtid status for eIF4F integritet gennem eIF4E-eIF4G interaktion. Luciferase komplementeringsproteinsystemet består af et 18 kDa proteinfragment (SubA) og 11 aminosyre peptidfragment (SubB), der er optimeret til minimal selvtilknytning og stabilitet11. Når de udtrykkes som et fusionsprodukt med den menneskelige eIF4E-længde og eIF4E-interaktionsdomænet fra human eiF4G1 (aa 604-646), vil de to interagerende proteiner bringe SubA- og SubB-fragmentet tæt på hinanden og fremkalde dannelsen af det aktive luciferase, der i nærværelse af en cellepermeabel substrat i sidste ende vil generere et lyst selvlysende signal (figur 1). Vi har andre steder rapporteret om konstruktion og validering af eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Her beskriver vi, hvordan eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystemet (tilgængeligt efter anmodning) kan anvendes til nøjagtigt at måle 4EBP1-medieret eIF4E-eIF4G-forstyrrelse i levende celler. Derudover demonstrerer vi dens nytte ved at måle virkningerne af flere mTOR-hæmmere, der i øjeblikket er under kliniske forsøg som potentielle kræftterapeutiske lægemidler12. Da off-target-effekter ofte maskerer stofspecifik aktivitet, beskriver vi også, hvordan alsidigheden af eIF4E:eIF4G604-646-systemmålingen kan udvides med ortogonale målinger af cellulær levedygtighed for at tage højde for disse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Dannelsen af eIF4F-komplekset har vist sig at være den vigtigste downstream-node for konvergensen af signalveje, der ofte udsættes for onkogen aktivering hos mennesker. eIF4F er et cap-bindingskompleks, der er involveret i den mRNA-ribosome rekrutteringsfase, hvor oversættelsen påbegyndes. I mange cellulære og prækliniske kræftmodeller fører dereguleringen af eIF4F til øget oversættelse af specifikke mRNA-delsæt, der er involveret i kræftspredning og overlevelse. eIF4F er et hetero-trimerisk kompleks bygget af den kapselbindende underenhed eIF4E, helicase eIF4A og stilladsunderenheden eIF4G. Afgørende for samling af aktive eIF4F-komplekser er proteinproteininteraktionen mellem eIF4E- og eIF4G-proteiner. I denne artikel beskriver vi en protokol til måling af eIF4F-assembly, der overvåger status for eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler. Den eIF4e:4G celle-baserede protein-protein interaktion assay giver også mulighed for narkotika induceret ændringer i eIF4F komplekse integritet, der skal vurderes præcist og pålideligt. Vi forestiller os, at denne metode kan anvendes til at verificere aktiviteten af kommercielt tilgængelige forbindelser eller til yderligere screening af nye forbindelser eller modaliteter, der effektivt forstyrrer dannelsen af eIF4F-kompleks.

For at validere følsomheden af eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystemet blev 4EBP1 medieret hæmning af eIF4F kompleks samling vurderet ved hjælp af mTOR-hæmmere. Ved at hæmme mTORC1 kinaseafhængig fosforylering af 4EBP-proteinfamilien øger mTOR-hæmning 4EBP1-tilknytningen til eIF4E og derfor eIF4F demontering15. To klasser af mekanistisk forskellige hæmmere af mTOR kinases blev testet: rapalogs (f.eks Rapamycin), der er allosteriske hæmmere ...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Her præsenterer vi en protokol til måling af eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler, der vil gøre det muligt for brugeren at evaluere lægemiddelinduceret forstyrrer af eIF4F-kompleks dynamik i screeningsformater.

Overvågning af eIF4F-samling ved måling af eIF4E-eIF4G-interaktion i levende celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokol til prøven og proces knoglemarven til at måle målbare Residual sygdom og Leukemic stamceller i akut Myeloid leukæmi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestemmelse af Protein udtryk niveau i kulturperler celler ved immuncytokemi på Paraffin-embedded celle blokke

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En klumpformet drab Assay af bil T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Påvisning og overvågning af tumor associeret cirkulerende DNA i patientens Biofluider

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og optælling af cirkulerende tumor celler fra ikke-småcellet lunge cancer patienter ved immunofluorescens

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analyse for at studere tumor-makrofag interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måling Real-time Drug Response i organotypic tumorvæv skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Overvågning af kræftcelleinvasion og T-cellecytotoksicitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

FluorescensMikroskopi til ATP Internalization medieret af makropinocytose i menneskelige tumorceller og tumor-xenografted mus

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...