Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
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Ces travaux ont été appuyés par le budget de base du p53lab (BMSI, A*STAR) et de la subvention VIP de l’ACO (A*STAR).

La lignée cellulaire HEK293 a été utilisée pour le protocole et a été cultivé dans le milieu modifié de l’aigle de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine et 100 U/mL de pénicilline/streptocotomycine. Les cellules ont été cultivés à 37 °C avec 5% de CO2 dans un environnement humidifié.
1. Évaluation quantitative des perturbations complexes eIF4F via eIF4E:eIF4G604-646 test de complémentarité
<ol><li>Culture cellulaire...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

La méthode décrite dans cet article utilise un test de complémentarité basé sur la luciferase pour surveiller quantitativement l’assemblage complexe eIF4F par mesure directe de l’interaction eIF4G-eIF4E dans les cellules vivantes. Nous avons fourni des détails pour l’utilisation du système de complémentarité eIF4E-eIF4G et nous avons également montré que le système est extrêmement précis dans la mesure de la dissociation médicamenteuse induite par 4EBP1 de l’interaction eIF4E-eIF4G<sup class="xref"...

Le contrôle de l’expression des gènes joue un rôle central dans l’exécution correcte des programmes cellulaires tels que la prolifération de la croissance et la différenciation. Un mécanisme de contrôle réglementaire peut être exercé soit au niveau de la transcription des gènes, soit au niveau de la traduction de l’ARNm. Au cours de la dernière décennie, il est devenu de plus en plus évident que le contrôle translationnel par modulation du processus d’initiation plutôt que par les étapes ultérieures de l’allongement et de l’arrêt peut réguler finement la synthèse de sous-ensembles spécifiques de protéines qui jouent un large éventail de fonctions biologiques.
Une traduction accrue des ARNN impliqués dans la survie, les réponses anti-autophagiques et antipoptotiques ont été impliquées dans plusieurs cancers et ont également été causativement liées à l’activation aberrante ou à la sur-expression des facteurs d’initiation à latraduction 1.
Le complexe eIF4F est un régulateur principal de l’initiation à la traduction. En liant la structure du plafond à la fin de 5' des ARNM, eIF4F conduit le recrutement initial d’ARNm-ribosome et augmente à son tour l’efficacité de traduction de l’ARNm de mRNAs eucaryotesfaiblement traduits 2. La traduction médiatisée eIF4F des ARNM liés au cancer a été signalée pour de nombreux modèles de cancer abritant l’activation aberrante des voies RAS/MAPK ou AKT/TOR, ce qui suggère que les cellules cancéreuses upregulate eIF4F pour stimuler leur propre activité pro-néoplastique. La perturbation de cette boucle d’alimentation vers l’avant en inhibant la formation complexe eIF4F est donc une stratégie thérapeutiquetrès prometteuse 3,4.
Le complexe eIF4F se compose de (i) eIF4E, le sous-unité liant le bouchon de l’eIF4F qui interagit avec la structure du bouchon trouvée à l’UTR de 5' de l’ARNm, (ii) eIF4A, l’hélicase arn et (iii) eIF4G, la protéine échafaudage qui interagit à la fois avec eIF4A et eIF4E et qui recrute finalement le subunit ribosomal 40S5. l’association eIF4G avec eIF4E est l’étape limitant les taux pour l’assemblage de complexes fonctionnels eIF4F et elle est négativement réglementée par les protéines liantes eIF4E (4EBPs, membres 1, 2 et 3))6. En concurrence avec la liaison eIF4G à l’eIF4E par le biais d’une interface composée de séquences de liaison eIF4E canoniques et non canoniques7,8,9 (région couvrant aa 604-646 sur eIF4E humain), 4EBP réduit le pool d’eIF4E activement impliqué dans la traduction et la prévention de la formation complexe eIF4F. L’interaction de ces interactions protéine-protéine est principalement régulée par la cible mammifère de la phosphorylation 201ée de 4EBP par la rapamycine (mTOR). Sur les stimuli mitogéniques, mTOR phosphorylate directement les membres de la famille des protéines 4E-BP, diminuant leur association avec eIF4E et, par conséquent, favorisant l’interaction eIF4E-eIF4G et la formation de complexes fonctionnels eIF4F10.
Malgré le grand effort dans le développement de composés ciblant l’intégrité complexe eIF4F, l’absence d’analyses mesurant la perturbation directe de l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes a limité la recherche de composés cellulaires actifs touchés. Nous avons appliqué un test de luciferase basé sur un analogue de coelenterazine (par exemple, analyse de complémentarité basée sur Nanoluc) pour surveiller en temps réel l’état de l’intégrité eIF4F grâce à l’interaction eIF4E-eIF4G. Le système de protéine de complémentarité de luciferase se compose d’un fragment de protéine de 18 kDa (SubA) et de 11 fragments de peptide d’acide aminé (SubB) optimisés pour l’auto-association minimale et lastabilité 11. Une fois exprimées comme un produit de fusion avec l’eIF4E pleine longueur humaine et le domaine d’interaction eIF4E de l’eiF4G1 humain (aa 604-646), les deux protéines en interaction amèneront le fragment suba et subb à proximité les unes des autres et induiront la formation de la luciferase active qui, en présence d’un substrat perméable à cellules, finira par générer un signal lumineux luminescent (Figure 1). Nous avons signalé ailleurs la construction et la validation du système de complémentarité eIF4E:eIF4G604-646 16.
Ici, nous décrivons comment le système de complémentarité eIF4E:eIF4G604-646 (disponible sur demande) peut être appliqué pour mesurer avec précision les perturbations eIF4E-eIF4G 4EBP1-201 dans les cellules vivantes. En outre, nous démontrons son utilité en mesurant les effets de plusieurs inhibiteurs de mTOR qui sont actuellement en cours d’essais cliniques en tant que médicaments thérapeutiques potentiels contre le cancer12. Étant donné que les effets hors cible masquent souvent l’activité spécifique aux médicaments, nous décrivons également comment la polyvalence de la mesure du système eIF4E:eIF4G604-646 peut être étendue avec des mesures orthogonales de la viabilité cellulaire pour en tenir compte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

La formation du complexe eIF4F s’est montrée être le nœud clé en aval pour la convergence des voies de signalisation qui subissent souvent une activation oncogène chez l’homme. eIF4F est un complexe de fixation de bouchons impliqué dans la phase de recrutement de l’ARNm-ribosome de l’initiation à la traduction. Dans de nombreux modèles cellulaires et précliniques de cancers, la déréglementation de l’eIF4F conduit à une traduction accrue de sous-ensembles spécifiques d’ARNm impliqués dans la prolifération et la survie du cancer. eIF4F est un complexe hétéro-trimeric construit à partir du sous-unité de fixation de bouchon eIF4E, de l’héliase eIF4A et du sous-unité d’échafaudage eIF4G. L’interaction protéine-protéine entre les protéines eIF4E et les protéines eIF4G est essentielle pour l’assemblage de complexes eIF4F actifs. Dans cet article, nous décrivons un protocole pour mesurer l’assemblage eIF4F qui surveille l’état de l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes. L’analyse d’interaction protéine-protéine à base de cellules eIF4e:4G permet également d’évaluer avec précision et fiabilité les changements induits par les médicaments dans l’intégrité du complexe eIF4F. Nous envisageons que cette méthode puisse être appliquée pour vérifier l’activité des composés disponibles dans le commerce ou pour le dépistage plus avant de nouveaux composés ou modalités qui perturbent efficacement la formation du complexe eIF4F.

Afin de valider la sensibilité du système de complémentarité eIF4E:eIF4G604-646, l’inhibition 4EBP1 de l’assemblage complexe eIF4F a été évaluée à l’aide d’inhibiteurs mTOR. En inhibant la phosphorylation dépendante de la kinase mTORC1 de la famille des protéines 4EBP, l’inhibition du mTOR améliore l’association 4EBP1 à l’eIF4E et, par conséquent, le démontage eIF4F15. Deux classes d’inhibiteurs mécanistes différents des ...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Ici, nous présentons un protocole pour mesurer l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes qui permettrait à l’utilisateur d’évaluer la perturbation induite par les médicaments de la dynamique complexe eIF4F dans les formats de dépistage.

Surveillance de l’assemblage eIF4F en mesurant l’interaction eIF4E-eIF4G dans les cellules vivantes

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

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