Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch das Kernbudget des p53lab (BMSI, A*STAR) und des JCO VIP Grants (A*STAR) unterstützt.

HEK293 Zelllinie wurde für das Protokoll verwendet und wurde in Dulbecco modifizierte Adler Medium ergänzt mit 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-Glutamin, und 100 U/mL Penicillin/Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5%CO2 in einer befeuchteten Umgebung kultiviert.
1. Quantitative Bewertung der komplexen Störung des eIF4F über eIF4E:eIF4G604-646 Complementation Assay
<ol><li>Zellkultur und transiente Transfektion von eIF4E:eIF4G604-646 Ko...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. 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S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Die in diesem Artikel beschriebene Methode nutzt einen luziferase-basierten Komplementierungstest zur quantitativen Überwachung der komplexen EIF4F-Montage durch direkte Messung der eIF4G-eIF4E-Interaktion in lebenden Zellen. Wir haben Einzelheiten für die Verwendung des eIF4E-eIF4G-Komplementierungssystems zur Verfügung gestellt und auch gezeigt, dass das System bei der Messung der medikamentös induzierten 4EBP1-vermittelten Dissoziation der eIF4E-eIF4G-Interaktion16extrem genau ist. Um den D...

Die Kontrolle der Genexpression spielt eine zentrale Rolle bei der korrekten Ausführung zellulärer Programme wie Wachstumsproliferation und Differenzierung. Ein regulatorischer Kontrollmechanismus kann entweder auf der Ebene der Gentranskription oder auf der Ebene der mRNA-Translation ausgeübt werden. In den letzten zehn Jahren ist es immer offensichtlicher geworden, dass die translationale Kontrolle durch Modulation des Initiationsprozesses und nicht durch die späteren Schritte der Dehnung und Beendigung die Synthese bestimmter Teilmengen von Proteinen, die eine breite Palette biologischer Funktionen spielen, fein regulieren kann.
Erhöhte Übersetzung von mRNAs, die am Überleben beteiligt sind, antiautophagische und anti-apoptotische Reaktionen wurden in mehrere Krebsarten verwickelt und wurden auch ursächlich mit der abnormen Aktivierung oder dem Ausdruck von Translationsinitiationsfaktoren in Verbindung gebracht1.
Der eIF4F-Komplex ist ein Master-Regulator der Übersetzungsinitiierung. Durch die Bindung der Cap-Struktur am 5' Ende von mRNAs treibt eIF4F die anfängliche mRNA-ribossome Rekrutierung voran und erhöht damit die mRNA-Translationseffizienz von schwach übersetzten eukaryotischen mRNAs2. EIF4F vermittelte Übersetzung von krebsbedingten mRNAs wurde für viele Krebsmodelle berichtet, die eine abnorme Aktivierung von RAS/MAPK- oder AKT/TOR-Signalwegen beherbergen, was darauf hindeutet, dass Krebszellen eIF4F hochregulieren, um ihre eigene proneoplastische Aktivität zu steigern. Die Störung dieser Einspeiseschleife durch Hemmung der eIF4F-Komplexbildung ist damit eine sehr vielversprechende therapeutische Strategie3,4.
Der eIF4F-Komplex besteht aus (i) eIF4E, der kappenbindenden Untereinheit von eIF4F, die mit der Cap-Struktur der 5' UTR von mRNA interagiert, (ii) eIF4A, dem RNA-Helicase und (iii) eIF4G, dem Gerüstprotein, das sowohl mit eIF4A als auch mit eIF4E interagiert und schließlich die 40S-Riboso-Subunit5rekrutiert. EIF4G-Assoziation mit eIF4E ist der preisbegrenzende Schritt für die Montage funktioneller eIF4F-Komplexe und wird durch die eIF4E-bindenden Proteine (4EBPs, Mitglieder 1, 2 und 3)negativ reguliert. Durch den Wettbewerb mit eIF4G-Bindung an eIF4E über eine Schnittstelle, die aus kanonischen und nicht-kanonischen eIF4E-Bindungssequenzen7,8,9 (Region aa 604-646 auf Human eIF4E) besteht, reduziert 4EBP den Pool von eIF4E, der aktiv an der Übersetzung und Der Verhinderung von eIF4F-Komplexbildung beteiligt ist. Das Zusammenspiel dieser Protein-Protein-Wechselwirkungen wird hauptsächlich durch das Säugetierziel der rapamycin (mTOR)-vermittelten Phosphorylierung von 4EBP reguliert. Bei mitogenen Reizen phosphorisiert mTOR die Mitglieder der 4E-BP-Proteinfamilie direkt, verringert ihre Verbindung mit eIF4E und fördert damit die EIF4E-eIF4G-Interaktion und die Bildung funktioneller eIF4F-Komplexe10.
Trotz der großen Anstrengungen bei der Entwicklung von Verbindungen, die auf die komplexe Integrität von eIF4F abzielen, hat das Fehlen von Assays zur Messung der direkten Störung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen die Suche nach zellulären aktiven Schlagverbindungen eingeschränkt. Wir haben einen Luziferase-Assay auf Basis eines Coelenterazin-Analogas (z. B. Nanoluc-basierter Komplementierungs-Assay) angewendet, um den Status der eIF4F-Integrität durch die eIF4E-eIF4G-Interaktion in Echtzeit zu überwachen. Das Luziferase-Komplementierungsproteinsystem besteht aus einem 18 kDa-Proteinfragment (SubA) und 11 Aminosäure-Peptidfragment (SubB), das für minimale Selbstassoziation und Stabilität optimiert ist11. Einmal als Fusionsprodukt mit dem menschlichen EIF4E und der eIF4E-Interaktionsdomäne aus dem menschlichen eiF4G1 (aa 604-646) ausgedrückt, werden die beiden interagierenden Proteine das SubA- und SubB-Fragment in die Nähe voneinander bringen und die Bildung der aktiven Luziferase induzieren, die in Gegenwart eines zelldurchlässigen Substrats schließlich ein helles Leuchtsignal erzeugen wird (Abbildung 1). Wir haben an anderer Stelle über den Bau und die Validierung des EIF4E:eIF4G604-646 Ergänzungssystems16berichtet.
Hier beschreiben wir, wie das komplementäre System eIF4E:eIF4G604-646 (auf Anfrage erhältlich) angewendet werden kann, um 4EBP1-vermittelte eIF4E-eIF4G-Störungen in lebenden Zellen genau zu messen. Darüber hinaus zeigen wir seinen Nutzen, indem wir die Wirkung mehrerer mTOR-Inhibitoren messen, die sich derzeit in klinischen Studien als potenzielle Krebstherapeutika befinden12. Da Off-Target-Effekte oft die medikamentöse Aktivität verschleiern, beschreiben wir auch, wie die Vielseitigkeit der EIF4E:eIF4G604-646 Systemmessung mit orthogonalen Messungen der zellulären Lebensfähigkeit erweitert werden kann, um diese zu berücksichtigen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Die Bildung des eIF4F-Komplexes hat sich als der wichtigste nachgeschaltete Knoten für die Konvergenz von Signalsignalen erwiesen, die häufig beim Menschen onkoogene Aktivierung erfahren. eIF4F ist ein Cap-Bindungskomplex, der an der mRNA-ribossomeRekrutierungsphase der TranslationInitiation beteiligt ist. In vielen zellulären und präklinischen Krebsarten führt die Deregulierung von eIF4F zu einer verstärkten Übersetzung spezifischer mRNA-Teilmengen, die an der Proliferation und dem Überleben von Krebs beteiligt sind. eIF4F ist ein heterotrimerkomplex, der aus der Kappenbindungs-Untereinheit eIF4E, dem Helicase eIF4A und der Gerüstuntereinheit eIF4G gebaut wurde. Entscheidend für die Montage aktiver eIF4F-Komplexe ist die Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen eIF4E- und eIF4G-Proteinen. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der eIF4F-Assembly, das den Status der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen überwacht. Der eIF4e:4G zellbasierte Protein-Protein-Interaktionstest ermöglicht auch eine genaue und zuverlässige Bewertung medikamentös induzierter Veränderungen in der komplexen Integrität von eIF4F. Wir stellen uns vor, dass diese Methode zur Überprüfung der Aktivität kommerziell erhältlicher Verbindungen oder zum weiteren Screening neuartiger Verbindungen oder Modalitäten angewendet werden kann, die die Bildung des eIF4F-Komplexes effizient stören.

Um die Empfindlichkeit des Komplementierungssystems eIF4E:eIF4G604-646 zu validieren, wurde die 4EBP1-vermittelte Hemmung der eIF4F-Komplexbaugruppe mit mTOR-Inhibitoren bewertet. Durch hemmende mTORC1-Kinase-abhängige Phosphorylierung der 4EBP-Proteinfamilie verbessert die mTOR-Hemmung die 4EBP1-Assoziation mit eIF4E und damit eIF4F-Demontage15. Es wurden zwei Klassen mechanistisch unterschiedlicher MTOR-Kinasen getestet: Rapalogs (z.B. Rapamycin), die...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen vor, das es dem Anwender ermöglichen würde, die medikamentöse Störung der komplexen EIF4F-Dynamik in Screening-Formaten zu bewerten.

Überwachung der eIF4F-Montage durch Messung der eIF4E-eIF4G-Interaktion in lebenden Zellen

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Umfassendes Protokoll zur Probe und Prozess des Knochenmarks zur Messung von messbaren Resterkrankung und leukämischen Stammzellen in der akuten myeloischen Leukämie

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Forschung

Krebsforschung

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestimmung der Proteinexpressionsgrad in kultivierten Zellen von Immunocytochemistry auf Paraffin-eingebetteten Zellenblöcken

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Ein Sphäroid Tötung Assay von Auto-T-Zellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Nachweis und Überwachung von tumorassoziierter zirkulierender DNA in Biofluiden von Patienten

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Halbautomatische PD-L1-Charakterisierung und Aufzählung zirkulierender Tumorzellen von nicht-kleinen Lungenkrebspatienten durch Immunfluoreszenz

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In Vitro-Assay zur Untersuchung der Tumor-Makrophage-Interaktion

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro-Bewertung der onkogenen Transformation in menschlichen Mammaepithelzellen

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Fluoreszenzmikroskopie für ATP-Internalisierung, vermittelt durch Makropinozytose in menschlichen Tumorzellen und tumor-xenografierten Mäusen

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...