Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

이 작품은 p53lab (BMSI, A * STAR)과 JCO VIP 보조금 (A * STAR)의 핵심 예산에 의해 지원되었습니다.

HEK293 세포주 프로토콜에 사용되었고 덜벡코의 수정된 이글 배지에서 10% 태아 소 혈청, 2mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신으로 보충하였다. 세포는 가습 환경에서 5% CO2로 37°C에서 배양되었다.
1. eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석등을 통한 eIF4F 복잡한 중단에 대한 정량적 평가
<ol><li>eIF4E:eIF4G604-646 보완 분석의 세포 배양 및 일시적인 연분<ol>
<li>모...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

본 문서에 설명된 방법은 라이브 셀에서 eIF4G-eIF4E 상호작용의 직접 측정을 통해 eIF4F 복합 조립을 정량적으로 모니터링하기 위해 루시파라제 계 보완 분석법을 활용한다. eIF4E-eIF4G 보완 시스템의 사용에 대한 세부 정보를 제공하고 있으며, 또한 eIF4E-eIF4G 상호작용16의약물 유발 4EBP1 매개 해리를 측정하는 데 시스템이 매우 정확하다는 것을 보여주었습니다. 이 분석의 처리량을 용?...

유전자 발현의 제어는 성장 증식 및 분화와 같은 세포 프로그램의 올바른 실행에 중추적 인 역할을한다. 조절 제어 메커니즘은 유전자 전사 수준 또는 mRNA 번역 수준에서 발휘될 수 있다. 지난 10 년 동안, 그것은 점점 더 분명 해지고 있다 개시 과정의 변조에 의해 번역 제어 보다는 오히려 신장 및 종료의 후반 단계 보다는 생물학적 기능의 넓은 범위를 재생 하는 단백질의 특정 하위 집합의 합성을 미세 하 게 조절할 수 있습니다.
생존에 관여하는 mRNA의 증가된 번역, 반자율적 및 반세포 반응은 여러 암에 연루되어 왔으며 또한 비정상적인 활성화 또는 번역 개시 요인1의발현에 인과 관계가 있다.
eIF4F 컴플렉스는 번역 개시의 마스터 레귤레이터입니다. mRNAs의 5'끝에 캡 구조를 결합함으로써, eIF4F는 초기 mRNA-리보솜 모집을 구동하고 차례로 약하게 번역 진핵 mRNA2의mRNA 번역 효율을 증가시키고 있다. eIF4F는 RAS/MAPK 또는 AKT/TOR 경로의 비정상적인 활성화를 수용하는 많은 암 모델에 대해 암 관련 mRNAs의 번역을 중재하여 암세포가 eIF4F를 조절하여 자체 신생물 활성을 강화하는 것을 시사합니다. eIF4F 복합형성을 억제하여 이 피드 포워드 루프의 중단은 매우 유망한 치료 전략3,4이다.
eIF4F 복합체는 (i) eIF4E, mRNA의 5' UTR에서 발견되는 캡 결합 서브유닛, (ii) eIF4A, RNA 헬리케이스 및 (iii) eIF4G, eIF4A 와 상호 작용하는 비계 단백질로 구성되며 결국40개의서브보를 모집한다. eIF4E와 eIF4G 연결은 기능성 eIF4F 복합체의 조립을 위한 속도 제한 단계이며 eIF4E 결합 단백질(4EBP, 멤버 1, 2 및 3)에 의해 부정적으로 조절된다6. 4EBP는 표준 및 비정식 eIF4E 바인딩 시퀀스7,8,9(인간 eIF4E에 대한 aa 604-646에 걸친 영역)로 구성된 인터페이스를 통해 eIF4E에 eIF4E 결합을 결합하여 eIF4E 복합 형성을 적극적으로 방지하는 eIF4E의 풀을 감소시킵니다. 이러한 단백질 단백질 상호 작용의 상호 작용은 주로 4EBP의 라파마이신 (mTOR)의 포유 동물 표적에 의해 조절된다. 미토제닉 자극시, mTOR은 4E-BP 단백질 제품군의 구성원을 직접 인광하여 eIF4E와의 연관성을 감소시키고, 이에 따라 eIF4E-eIF4G 상호 작용 및 기능성 eIF4F 복합체의 형성을 촉진한다10.
eIF4F 복잡한 무결성을 대상으로 하는 화합물 개발에 큰 노력에도 불구하고, 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용의 직접적인 중단을 측정하는 아세약의 부족은 세포 활성 히트 화합물에 대한 검색을 제한했다. 우리는 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 통해 eIF4F 무결성의 상태를 실시간으로 모니터링하기 위해 coelenterazine 아날로그 (예를 들어, 나노 루크 기반 보완 분석)에 따라 루시파라제 분석체를 적용했습니다. 루시파아제 보완 단백질 시스템은 최소 자기 연결 및안정성(11)에최적화된 18kDa 단백질 단편(SubA)과 11개의 아미노산 펩타이드 단편(SubB)으로 구성된다. 인간 전체 길이 eIF4E 및 eIF4E 상호작용 도메인을 인간 eiF4G1(aa 604-646)으로부터 융합 제품으로 발현하면, 두 개의 상호 작용 단백질은 SubA 및 SubB 단편을 서로 가까이에 가져오고, 세포 침투성 기판의 존재가 결국 1개의 발광을 생성하게된다는활성 루시파아제의 형성을 유도할 것이다. 우리는 다른 곳에서 eIF4E:eIF4G604-646 보완 시스템16의시공 및 검증을 보고했다.
여기서는 eIF4E:eIF4G604-646 상호 보완 시스템(요청 시 사용 가능)을 사용하여 라이브 셀에서 4EBP1 매개 eIF4E-eIF4G 중단을 정확하게 측정할 수 있는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 잠재적인 암 치료 약으로 현재 임상 시험을 받고 있는 몇몇 mTOR 억제제의 효력을 측정해서 그것의 유용성을입증합니다 12. 오프 타겟 효과는 종종 약물 관련 활동을 마스크하기 때문에, 우리는 또한 eIF4E:eIF4G604-646 시스템 측정의 다재다능성을 고려하기 위해 세포 생존성의 직교 측정으로 확장 될 수있는 방법을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

eIF4F 복합체의 형성은 종종 인간에서 온코겐성 활성화를 겪는 신호 경로의 수렴을 위한 핵심 다운스트림 노드로 나타났습니다. eIF4F는 변환 개시의 mRNA-리보솜 모집 단계에 관여하는 캡 결합 복합체이다. 암의 많은 세포 및 전임상 모델에서 eIF4F의 규제 완화는 암 증식 및 생존에 관여하는 특정 mRNA 하위 집합의 증가된 번역으로 이어집니다. eIF4F는 캡 결합 서브유닛 eIF4E, 헬리케이스 eIF4A 및 스캐폴딩 서브유닛 eIF4G로부터 제작된 이종트리메릭 복합체이다. 활성 eIF4F 복합체의 조립에 중요한 것은 eIF4E와 eIF4G 단백질 간의 단백질 단백질 상호 작용이다. 이 문서에서는 라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용 상태를 모니터링하는 eIF4F 어셈블리를 측정하는 프로토콜을 설명합니다. eIF4e:4G 세포 기반 단백질 단백질 상호 작용 분석법은 또한 eIF4F 복합 무결성의 약물 유도된 변화가 정확하고 안정적으로 평가될 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법이 시판되는 화합물의 활성을 확인하거나 eIF4F 복합체의 형성을 효율적으로 방해하는 새로운 화합물 또는 양식의 추가 스크리닝을 위해 적용될 수 있다고 구상합니다.

eIF4E:eIF4G604-646 보편시스템의 감도를 검증하기 위해, eIF4F 복합 조립체의 4EBP1 중재 억제는 mTOR 억제제를 사용하여 평가되었다. 4EBP 단백질 제품군의 mTORC1 키나아제 의존형 인산화를 억제함으로써, mTOR 억제는 eIF4E에 4EBP1 연결을 강화하여, 따라서 eIF4F 분해15. mTOR 키나아제의 기계적으로 다른 억제제의 두 종류는 시험되었다: 라팔로그 (예를 들어, 라?...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

여기서, 우리는 사용자가 선별 형식으로 eIF4F 복잡한 역학의 약물 유도 된 동요를 평가 할 수 있도록 살아있는 세포에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하는 프로토콜을 제시한다.

라이브 셀에서 eIF4E-eIF4G 상호 작용을 측정하여 eIF4F 어셈블리 모니터링

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

샘플을 측정 하는 측정 가능한 잔여 질환과 급성 골수성 백혈병에 Leukemic 줄기 세포에 대 한 프로세스 골 포괄적인 프로토콜

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

연구

암 연구학

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry 파라핀 끼워 넣어진 셀 블록에 의해 경작된 한 세포에 단백질 표정 수준 결정

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

환자 생체 유체에서 종양 관련 순환 DNA의 검출 및 모니터링

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

종양 대식 세포 상호 작용을 연구 하는 시험관 내 분석

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

인간 종양 세포 및 종양-xenografted 마우스에 있는 매크로 피노세포증에 의해 중재된 ATP 내재화를 위한 형광 현미경 검사법

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...