Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av kjernebudsjettet fra p53lab (BMSI, A *STAR) og JCO VIP grant (A *STAR).

HEK293 cellelinje ble brukt til protokollen og ble dyrket i Dulbeccos Modified Eagle Medium supplert med 10% Fetal Bovine Serum, 2 mM L-glutamin og 100 U / ml penicillin / streptomycin. Celler ble dyrket ved 37 °C med 5 % CO2 i et fuktig miljø.
1. Kvantitativ vurdering av eIF4F-komplekse forstyrrelser via eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonsanalyse
<ol><li>Cellekultur og forbigående transfeksjon av eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonsanalyse<ol>
<li>Bruk nyt...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Metoden beskrevet i denne artikkelen bruker en luciferase-basert komplementeringsanalyse for kvantitativt å overvåke eIF4F kompleks montering gjennom direkte måling av eIF4G-eIF4E interaksjon i levende celler. Vi har gitt detaljer for bruk av eIF4E-eIF4G komplementeringssystem, og vi har også vist at systemet er ekstremt nøyaktig i måling av legemiddelindusert 4EBP1-mediert dissosiasjon av eIF4E-eIF4G interaksjon16. For å lette gjennomstrømningen av denne analysen, er det eksperimentelle o...

Kontroll av genuttrykk spiller en sentral rolle i riktig utførelse av cellulære programmer som vekstproliferasjon og differensiering. En regulatorisk kontrollmekanisme kan utøves enten på nivået av gentranskripsjon eller på nivået av mRNA-oversettelse. I løpet av det siste tiåret har det blitt stadig tydeligere at translasjonskontroll ved modulering av initieringsprosessen i stedet for de senere trinnene for forlengelse og oppsigelse kan regulere syntesen av spesifikke undergrupper av proteiner som spiller et bredt spekter av biologiske funksjoner.
Økt oversettelse av mRNAer involvert i overlevelse, anti-autofagiske og anti-apoptotiske responser har blitt involvert i flere kreftformer og har også vært årsaksmessig knyttet til enten avvikende aktivering eller over uttrykk for oversettelse initieringsfaktorer1.
eIF4F-komplekset er en hovedregulator for oversettelsesstart. Ved å binde cap-strukturen på 5' enden av mRNAs, eIF4F kjører innledende mRNA-ribosome rekruttering og i sin tur øke mRNA oversettelse effektivitet av svakt oversatt eukaryotic mRNAs2. eIF4F mediert oversettelse av kreftrelaterte mRNAer er rapportert for mange kreftmodeller som har avvikende aktivering av RAS/MAPK- eller AKT/TOR-veier, noe som tyder på at kreftceller oppregulerer eIF4F for å øke sin egen pro-neoplastiske aktivitet. Forstyrrelse av denne feed-forward sløyfen ved å hemme eIF4F kompleks dannelse er dermed en svært lovende terapeutisk strategi3,4.
eIF4F-komplekset består av (i) eIF4E, cap-bindende underenhet av eIF4F som samhandler med hettestrukturen som finnes ved 5' UTR av mRNA, (ii) eIF4A, RNA-helikase og (iii) eIF4G, stillasproteinet som samhandler med både eIF4A og eIF4E og som til slutt rekrutterer 40S ribosomal subenhet5. eIF4G-tilknytning til eIF4E er det hastighetsbegrensende trinnet for montering av funksjonelle eIF4F-komplekser, og det er negativt regulert av eIF4E-bindende proteiner (4EBPer, medlem 1, 2 og 3))6. Ved å konkurrere med eIF4G-binding til eIF4E gjennom et grensesnitt som består av kanoniske og ikke-kanoniske eIF4E-bindingssekvenser7,8,9 (region som spenner over aa 604-646 på human eIF4E), reduserer 4EBP utvalget av eIF4E som er aktivt involvert i oversettelse og forhindrer eIF4F-kompleks dannelse. Samspill mellom disse proteinproteininteraksjonene er hovedsakelig regulert av pattedyrmålet for rapamycin (mTOR)-mediert fosforylering av 4EBP. Ved mitogene stimuli, mTOR direkte fosforylater medlemmene av 4E-BP proteinfamilien, reduserer deres tilknytning til eIF4E og dermed fremmer eIF4E-eIF4G interaksjon og dannelse av funksjonelle eIF4F komplekser10.
Til tross for den store innsatsen i å utvikle forbindelser rettet mot eIF4F kompleks integritet, har mangelen på analyser som måler direkte forstyrrelse av eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler begrenset søket etter cellulære aktive treffforbindelser. Vi har brukt en luciferaseanalyse basert på en coelenterazin-analog (f.eks. Nanoluc-basert komplementasjonsanalyse) for å overvåke statusen til eIF4F-integriteten i sanntid gjennom eIF4E-eIF4G-interaksjonen. Luciferase komplementering protein system består av en 18 kDa protein fragment (SubA) og 11 aminosyre peptid fragment (SubB) optimalisert for minimal selv-assosiasjon og stabilitet11. Når det uttrykkes som et fusjonsprodukt med eIF4E i full lengde og eIF4E-interaksjonsdomenet fra humant eiF4G1 (aa 604-646), vil de to interagerende proteinene bringe SubA- og SubB-fragmentet i nærheten av hverandre og vil indusere dannelsen av den aktive luciferase som i nærvær av et cellegjennomtrengelig substrat til slutt vil generere et sterkt lysende signal (Figur 1). Vi har rapportert andre steder bygging og validering av eIF4E: eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Her beskriver vi hvordan eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonssystem (tilgjengelig på forespørsel) kan brukes til å måle nøyaktig 4EBP1-mediert eIF4E-eIF4G-forstyrrelse i levende celler. I tillegg demonstrerer vi nytten ved å måle effekten av flere mTOR-hemmere som for tiden er under kliniske studier som potensielle kreftterapeutiske legemidler12. Fordi off-target effekter ofte maskerer narkotikaspesifikk aktivitet, beskriver vi også hvordan allsidigheten til eIF4E:eIF4G604-646 systemmåling kan utvides med ortogonale målinger av cellulær levedyktighet for å ta hensyn til disse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Dannelse av eIF4F-komplekset har vist seg å være nøkkelen nedstrøms node for konvergens av signalveier som ofte gjennomgår onkogen aktivering hos mennesker. eIF4F er et cap-bindende kompleks involvert i mRNA-ribosomet rekrutteringsfasen av oversettelsesinitiering. I mange cellulære og prekliniske kreftmodeller fører dereguleringen av eIF4F til økt oversettelse av spesifikke mRNA-undergrupper som er involvert i kreftproliferasjon og overlevelse. eIF4F er et hetero-trimerisk kompleks bygget av den cap-bindende underenheten eIF4E, helicase eIF4A og stillasunderenheten eIF4G. Kritisk for montering av aktive eIF4F-komplekser er proteinproteininteraksjonen mellom eIF4E- og eIF4G-proteiner. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll for å måle eIF4F-montering som overvåker statusen til eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler. Den eIF4e:4G cellebaserte proteinproteininteraksjonsanalysen gjør det også mulig å vurdere legemiddelinduserte endringer i eIF4F-kompleks integritet nøyaktig og pålitelig. Vi ser for oss at denne metoden kan brukes til å verifisere aktiviteten til kommersielt tilgjengelige forbindelser eller for videre screening av nye forbindelser eller modaliteter som effektivt forstyrrer dannelsen av eIF4F-komplekset.

For å validere følsomheten til eIF4E:eIF4G604-646 komplementasjonssystem ble 4EBP1 mediert hemming av eIF4F kompleks montering vurdert ved hjelp av mTOR-hemmere. Ved å hemme mTORC1 kinase avhengig fosforylering av 4EBP proteinfamilien, forbedrer mTOR-hemming 4EBP1-tilknytning til eIF4E og derfor eIF4F demontering15. To klasser av mekanistisk forskjellige hemmere av mTOR kinases ble testet: rapaloger (f.eks. Rapamycin) som er allosteriske hemmere av mT...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Her presenterer vi en protokoll for å måle eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler som vil gjøre det mulig for brukeren å evaluere legemiddelindusert perturbasjon av eIF4F-kompleks dynamikk i screeningformater.

Overvåke eIF4F-montering ved å måle eIF4E-eIF4G-interaksjon i levende celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattende protokoll for å prøve og prosessen benmarg for å måle målbare gjenværende sykdom og Leukemic stamceller i akutt myelogen leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Fastsettelse av Protein uttrykk nivå i kulturperler celler av Immunocytochemistry på parafin-embedded celleblokker

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Påvisning og overvåking av tumor assosiert sirkulerende DNA i pasient Biofluids

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering og opplisting av sirkulerende tumor celler fra ikke-liten celle Lungekreftpasienter ved Immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analysen for å studere tumor-macrophage interaksjon

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måle sanntids narkotikarespons i organotypic tumor vev skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Overvåking av kreftcelleinvasjon og T-celle cytotoksisitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Fluorescensmikroskopi for ATP Internalisering mediert av makropinocytose i humane tumorceller og tumor-xenograftede mus

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...