Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo orçamento central do p53lab (BMSI, A*STAR) e da concessão VIP JCO (A*STAR).

A linha celular HEK293 foi utilizada para o protocolo e foi cultivada no Medium De Águia Modificada de Dulbecco, suplementada com soro bovino fetal de 10%, 2 mM L-glutamina e 100 penicilina/estreptomicina U/mL. As células foram cultivadas a 37 °C com 5% de CO2 em um ambiente umidificado.
1. Avaliação quantitativa da interrupção do complexo eIF4F via ensaio de complementação eIF4E:eIF4G604-646
<ol><li>Ensaio de complementação de cultura celular e transfecção...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. 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S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

O método descrito neste artigo utiliza um ensaio de complementação baseado em luciferase para monitorar quantitativamente o conjunto complexo eIF4F através da medição direta da interação eIF4G-eIF4E em células vivas. Fornecemos detalhes para o uso do sistema de complementação eIF4E-eIF4G e também mostramos que o sistema é extremamente preciso na medição da dissociação mediada por medicamentos 4EBP1 da interação eIF4E-eIF4G16. Para facilitar o throughput deste ensaio, a configura...

O controle da expressão genética desempenha um papel fundamental na correta execução de programas celulares, como a proliferação do crescimento e a diferenciação. Um mecanismo de controle regulatório pode ser exercido tanto no nível da transcrição genética quanto no nível da tradução mRNA. Na última década, tornou-se cada vez mais evidente que o controle translacional pela modulação do processo de iniciação em vez das etapas posteriores de alongamento e término pode regular finamente a síntese de subconjuntos específicos de proteínas que desempenham uma ampla gama de funções biológicas.
O aumento da tradução das mRNAs envolvidas na sobrevivência, respostas anti-autofágicas e anti-apoptóticas foram implicadas em vários cânceres e também foram causadores mente ligadas à ativação aberrante ou à expressão dos fatores de iniciação da tradução1.
O complexo eIF4F é um regulador mestre da iniciação da tradução. Ao vincular a estrutura da tampa no final de 5' dos mRNAs, o eIF4F está impulsionando o recrutamento inicial mRNA-ribossomo e, por sua vez, aumentando a eficiência de tradução mRNA de mRNAs eucarióticas mal traduzidas2. A tradução mediada eIF4F de mRNAs relacionadas ao câncer tem sido relatada para muitos modelos de câncer que abrigam ativação aberrante de vias RAS/MAPK ou AKT/TOR, sugerindo que as células cancerígenas reregulam o eIF4F para impulsionar sua própria atividade pró-neoplásica. A interrupção deste loop de avanço alimentar inibindo a formação complexa eIF4F é, portanto, uma estratégia terapêutica muito promissora3,4.
O complexo eIF4F consiste em (i) eIF4E, a subunidade de ligação de tampa do eIF4F que interage com a estrutura da tampa encontrada no UTR de 5' de mRNA, (ii) eIF4A, o RNA helicase e (iii) eIF4G, a proteína do andaime que interage com o eIF4A e o eIF4E e que eventualmente recruta a subunidade ribossômica 40S5. a associação eIF4G com o eIF4E é o passo limitante de taxas para a montagem de complexos funcionais eIF4F e é regulada negativamente pelas proteínas de ligação eIF4E (4EBPs, membros 1, 2 e 3))6. Competindo com a vinculação eIF4G ao eIF4E através de uma interface que consiste em sequências de ligação eIF4E canônicas e canônicas7,8,9 (região que abrange aa 604-646 em eIF4E humano), o 4EBP reduz o pool de eIF4E ativamente envolvido na tradução e prevenção da formação do complexo eIF4F. A interação entre proteínas e proteínas é regulada principalmente pelo alvo mamífero da fosforilação mediada pela rapamicina (mTOR) de 4EBP. Após estímulos mitogênicos, o mTOR fosforila diretamente os membros da família de proteínas 4E-BP, diminuindo sua associação com o eIF4E e, assim, promovendo a interação eIF4E-eIF4G e a formação de complexos funcionais eIF4F10.
Apesar do grande esforço no desenvolvimento de compostos voltados para a integridade complexa eIF4F, a falta de ensaios que medem a interrupção direta da interação eIF4E-eIF4G em células vivas limitou a busca por compostos ativos celulares. Aplicamos um ensaio de luciferase baseado em um analógico coelenterazina (por exemplo, ensaio de complementação baseado em nanoluc) para monitorar em tempo real o status da integridade eIF4F através da interação eIF4E-eIF4G. O sistema de proteína de complementação da luciferase consiste em um fragmento de proteína de 18 kDa (SubA) e 11 fragmentos de peptídeos de aminoácidos (SubB) otimizados para auto-associação mínima e estabilidade11. Uma vez expressos como um produto de fusão com o eIF4E de comprimento total humano e o domínio de interação eIF4E do eiF4G1 humano (aa 604-646), as duas proteínas interativas trarão o fragmento SubA e SubB para uma proximidade entre si e induzirão a formação da luciferase ativa que, na presença de um substrato permeável celular, eventualmente gerará um sinal luminoso brilhante (Figura 1). Reportamos em outros lugares a construção e validação do sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 16.
Aqui, descrevemos como o sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646 (disponível mediante solicitação) pode ser aplicado para medir com precisão a interrupção eIF4E-eIF4G mediada em células vivas. Além disso, demonstramos sua utilidade medindo os efeitos de vários inibidores de mTOR que estão atualmente sob testes clínicos como potenciais medicamentos terapêuticos de câncer12. Como os efeitos fora do alvo muitas vezes mascaram atividade específica de drogas, também descrevemos como a versatilidade da medição do sistema eIF4E:eIF4G604-646 pode ser estendida com medições ortogonais de viabilidade celular para levar isso em conta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

A formação do complexo eIF4F tem se mostrado o nó fundamental a jusante para a convergência de vias de sinalização que muitas vezes sofrem ativação oncogênica em humanos. O eIF4F é um complexo de vinculação de tampas envolvido na fase de recrutamento mRNA-ribossomo de iniciação de tradução. Em muitos modelos celulares e pré-clínicos de cânceres, a desregulamentação do eIF4F leva ao aumento da tradução de subconjuntos específicos de mRNA que estão envolvidos na proliferação e sobrevivência do câncer. eIF4F é um complexo hetero-trimérico construído a partir da subunidade de ligação de tampa eIF4E, do eIF4A helicase e da subunidade de andaimes eIF4G. Fundamental para a montagem de complexos eIF4F ativos é a interação proteína-proteína entre proteínas eIF4E e eIF4G. Neste artigo, descrevemos um protocolo para medir o conjunto eIF4F que monitora o status da interação eIF4E-eIF4G em células vivas. O ensaio de interação proteína-proteína baseado em células eIF4e:4G também permite que as alterações induzidas por medicamentos na integridade complexa eIF4F sejam avaliadas com precisão e confiabilidade. Prevemos que este método possa ser aplicado para verificar a atividade de compostos disponíveis comercialmente ou para uma triagem adicional de novos compostos ou modalidades que interrompam eficientemente a formação do complexo eIF4F.

Para validar a sensibilidade do sistema de complementação eIF4E:eIF4G604-646, a inibição mediada de 4EBP1 do conjunto complexo eIF4F foi avaliada por meio de inibidores mTOR. Ao inibir a fosforilação dependente mTORC1 quinase da família de proteínas 4EBP, a inibição do mTOR aumenta a associação 4EBP1 para eIF4E e, portanto, a desmontagem eIF4F15. Duas classes de inibidores mecanicamente diferentes de quinases mTOR foram testadas: rapalogs (po...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.

Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Pesquisa do câncer

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Determinação do nível de expressão da proteína em pilhas cultivadas por imunocitoquímica em blocos de parafina

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Um ensaio de matança Spheroid por pilhas de T do carro

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Deteção e monitoração do ADN de circulação associado do tumor em Biofluids pacientes

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

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Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Medição da resposta de drogas em tempo real em fatias de tecido tumoral organotípico

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Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

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Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

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Microscopia de Fluorescência para Internalização ATP Mediada por Macropinocistose em Células tumorais humanas e camundongos tumorais-xenorgrafados

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...