Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el presupuesto básico del p53lab (BMSI, A*STAR) y la subvención VIP de JCO (A*STAR).

La línea celular HEK293 se utilizó para el protocolo y fue cultivada en el Medio águila modificada de Dulbecco complementado con 10% suero bovino fetal, 2 mM L-glutamina, y 100 penicilina U/mL/ estreptomicina. Las células se cultivaban a 37 °C con un 5% de CO2 en un ambiente humidificado.
1. Evaluación cuantitativa de la interrupción compleja del fei4F a través de eIF4E:eIF4G604-646 ensayo de complementación
<ol><li>Cultivo celular y transfección transitoria d...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

El método descrito en este artículo utiliza un ensayo de complementación basado en luciferasa para monitorear cuantitativamente el montaje complejo eIF4F a través de la medición directa de la interacción eIF4G-eIF4E en células vivas. Hemos proporcionado detalles para el uso del sistema de complementación eIF4E-eIF4G y también hemos demostrado que el sistema es extremadamente preciso en la medición de la disociación mediada por 4EBP1 inducida por fármacos de la interacción eIF4E-eIF4G16</sup...

El control de la expresión génica desempeña un papel fundamental en la correcta ejecución de programas celulares como la proliferación del crecimiento y la diferenciación. Se puede ejercer un mecanismo de control reglamentario ya sea a nivel de transcripción genética o a nivel de traducción de ARNm. En la última década, se ha hecho cada vez más evidente que el control traslacional mediante la modulación del proceso de iniciación en lugar de los pasos posteriores de alargamiento y terminación puede regular finamente la síntesis de subconjuntos específicos de proteínas que desempeñan una amplia gama de funciones biológicas.
El aumento de la traducción de los MRNAs implicados en la supervivencia, las respuestas anti-autofágicas y anti-apoptóticas se ha implicado en varios tipos de cáncer y también se ha relacionado causalmente con la activación aberrante o con la expresión excesiva de los factores de iniciación a la traducción1.
El complejo eIF4F es un regulador maestro de la iniciación de la traducción. Al enlazar la estructura de la tapa en el extremo de 5' de losRNAs, eIF4F está impulsando la contratación inicial de ARNm-ribosoma y, a su vez, aumentando la eficiencia de traducción de ARNm de ARNM eucariota débilmente traducida2. Se ha notificado una traducción mediada por eIF4F de los mRNAs relacionados con el cáncer para muchos modelos de cáncer que albergan la activación aberrante de las vías RAS/MAPK o AKT/TOR, lo que sugiere que las células cancerosas upregulan eIF4F para impulsar su propia actividad pro-neoplástica. La interrupción de este bucle avance mediante la inhibición de la formación compleja eIF4F es por lo tanto una estrategia terapéutica muy prometedora3,4.
El complejo eIF4F consiste en (i) eIF4E, la subunidad de unión a la tapa de eIF4F que interactúa con la estructura de la tapa que se encuentra en el 5' UTR de ARNm, (ii) eIF4A, la helicasa de ARN y (iii) eIF4G, la proteína andamio que interactúa tanto con eIF4A como con eIF4E y que finalmente recluta el 40S ribosomal subu5nit. La asociación eIF4G con eIF4E es el paso limitante de velocidad para el montaje de complejos funcionales eIF4F y está regulada negativamente por las proteínas de unión eIF4E (4EBPs, miembros 1, 2 y 3))6. Al competir con el enlace eIF4G a eIF4E a través de una interfaz que consiste en secuencias de enlace eIF4E canónicas y no canónicas7,8,9 (región que abarca aa 604-646 en eIF4E humano), 4EBP reduce el grupo de eIF4E involucrado activamente en la traducción y prevención de la formación compleja eIF4F. La interacción entre estas interacciones proteína-proteína está regulada principalmente por el objetivo de los mamíferos de la fosforilación mediada por la rapamicina (mTOR) de 4EBP. Tras los estímulos mitogénicos, mTOR fosforila directamente a los miembros de la familia proteica 4E-BP, disminuyendo su asociación con eIF4E y, por lo tanto, promoviendo la interacción eIF4E-eIF4G y la formación de complejos funcionales eIF4F10.
A pesar del gran esfuerzo en el desarrollo de compuestos dirigidos a la integridad compleja eIF4F, la falta de ensayos que miden la interrupción directa de la interacción eIF4E-eIF4G en las células vivas ha limitado la búsqueda de compuestos de golpe activo celular. Hemos aplicado un ensayo luciferasa basado en un análogo de coelenterazina (por ejemplo, ensayo de complementación basado en Nanoluc) para monitorear en tiempo real el estado de integridad de eIF4F a través de la interacción eIF4E-eIF4G. El sistema de proteínas de complementación luciferasa consiste en un fragmento de proteína de 18 kDa (SubA) y 11 fragmentos de péptido de aminoácidos (SubB) optimizados para una mínima auto-asociación y estabilidad11. Una vez expresado como un producto de fusión con el eIF4E de longitud completa humana y el dominio de interacción eIF4E del eiF4G1 humano (aa 604-646), las dos proteínas que interactúan acercarán el fragmento SubA y SubB entre sí e inducirán la formación de la luciferasa activa que, en presencia de un sustrato permeable celular, eventualmente generará una señal luminiscente brillante(Figura 1). Hemos informado en otros lugares de la construcción y validación del sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 16.
Aquí, describimos cómo el sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646 (disponible bajo petición) se puede aplicar para medir con precisión la interrupción eIF4E-eIF4G mediada por 4EBP1 en las células vivas. Además, demostramos su utilidad midiendo los efectos de varios inhibidores de mTOR que actualmente están bajo ensayos clínicos como posibles fármacos terapéuticos contra el cáncer12. Debido a que los efectos fuera del objetivo a menudo enmascaran la actividad específica de drogas, también describimos cómo la versatilidad de la medición del sistema eIF4E:eIF4G604-646 se puede ampliar con mediciones ortogonales de viabilidad celular para tenerlas en cuenta.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Se ha demostrado que la formación del complejo eIF4F es el nodo descendente clave para la convergencia de vías de señalización que a menudo se someten a activación oncogénica en humanos. eIF4F es un complejo de unión a la tapa que participa en la fase de reclutamiento del ARNm-ribosoma de iniciación de traducción. En muchos modelos celulares y preclínicos de cáncer, la desregulación del eIF4F conduce a una mayor traducción de subconjuntos específicos de ARNm que están involucrados en la proliferación y supervivencia del cáncer. eIF4F es un complejo hetero-trimérico construido a partir de la subunidad de unión a la tapa eIF4E, el eIF4A helicaso y el subunit de andamios eIF4G. Fundamental para el montaje de complejos activos eIF4F es la interacción proteína-proteína entre las proteínas eIF4E y eIF4G. En este artículo, describimos un protocolo para medir el ensamblado eIF4F que supervisa el estado de la interacción eIF4E-eIF4G en celdas vivas. El ensayo de interacción proteína-proteína basado en células eIF4e:4G también permite evaluar con precisión y fiabilidad los cambios inducidos por fármacos en la integridad compleja del fei4F. Vislumbramos que este método puede aplicarse para verificar la actividad de compuestos disponibles comercialmente o para un mayor cribado de nuevos compuestos o modalidades que interrumpan eficientemente la formación del complejo eIF4F.

Con el fin de validar la sensibilidad del sistema de complementación eIF4E:eIF4G604-646, se evaluó la inhibición mediada de 4EBP1 del conjunto complejo eIF4F mediante inhibidores de mTOR. Al inhibir la fosforilación dependiente de la quinasa mTORC1 de la familia de proteínas 4EBP, la inhibición del mTOR mejora la asociación 4EBP1 a eIF4E y, por lo tanto, el desmontaje eIF4F15. Se probaron dos clases de inhibidor mecanicísticamente diferente de la...

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Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Aquí, presentamos un protocolo para medir la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas que permitiría al usuario evaluar la perturbación inducida por fármacos de dinámicas complejas eIF4F en formatos de cribado.

Monitorización del conjunto eIF4F midiendo la interacción eIF4E-eIF4G en células vivas

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

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