Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av kärnbudgeten från p53lab (BMSI, A *STAR) och JCO VIP-bidraget (A *STAR).

HEK293 cellinje användes för protokollet och odlades i Dulbeccos modifierade eagle medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum, 2 mM L-glutamin och 100 U/mL penicillin/streptomycin. Cellerna odlades vid 37 °C med 5% CO2 i en fuktad miljö.
1. Kvantitativ bedömning av eIF4F-komplexa störningar via eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalys
<ol><li>Cellkultur och övergående transfektion av eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringsanalys<ol>
<li>Använd...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Metoden som beskrivs i denna artikel använder en luciferase-baserad komplementeringsanalys för att kvantitativt övervaka eIF4F-komplex montering genom direkt mätning av eIF4G-eIF4E-interaktion i levande celler. Vi har lämnat detaljer för användning av eIF4E-eIF4G komplementeringssystem och vi har också visat att systemet är extremt exakt vid mätning av läkemedelsinducerad 4EBP1-medierad dissociation av eIF4E-eIF4G interaktion16. För att underlätta genomströmningen av denna analys har...

Kontroll av genuttryck spelar en central roll i korrekt utförande av cellulära program såsom tillväxt spridning och differentiering. En reglerande kontrollmekanism kan utövas antingen på genkriberingsnivå eller på nivån för mRNA-översättning. Under det senaste decenniet har det blivit alltmer uppenbart att translationell kontroll genom modulering av initieringsprocessen snarare än de senare stegen av förlängning och avslutning fint kan reglera syntesen av specifika delmängder av proteiner som spelar ett brett spektrum av biologiska funktioner.
Ökad översättning av mRNAs som är involverade i överlevnad, anti-autophagic och anti-apoptotic svar har varit inblandade i flera cancerformer och har också varit kausativt kopplade till antingen avvikande aktivering eller över uttryck för översättning inledandefaktorer 1.
EIF4F-komplexet är en huvudregulator för översättningsinitiering. Genom att binda kap-strukturen i 5' änden av mRNAs, eIF4F driver inledande mRNA-ribosom rekrytering och i sin tur öka mRNA översättning effektivitet av svagt översatta eukaryotic mRNAs2. eIF4F-förmedlad översättning av cancerrelaterade mRNAs har rapporterats för många cancermodeller som hyser avvikande aktivering av RAS/ MAPK eller AKT / TOR-vägar, vilket tyder på att cancerceller uppreglerar eIF4F för att öka sin egen pro-neoplastiska aktivitet. Störning av denna feed-forward loop genom att hämma eIF4F komplexa bildandet är därmed en mycket lovande terapeutisk strategi3,4.
EIF4F-komplexet består av i) eIF4E, Den kapbindande underenheten i eIF4F som interagerar med den takstruktur som finns vid mRNA:s 5' UTR, ii) eIF4A, RNA-helicase och iii) eIF4G, ställningsproteinet som interagerar med både eIF4A och eIF4E och som så småningom rekryterar 40S ribosomalunderenhet5. eIF4G-associering med eIF4E är det hastighetsbegränsande steget för montering av funktionella eIF4F-komplex och det regleras negativt av eIF4E-bindande proteiner (4EBPs, medlemmar 1, 2 och 3))6. Genom att konkurrera med eIF4G-bindning till eIF4E genom ett gränssnitt som består av kanoniska och icke-kanoniska eIF4E-bindningssekvenser7,8,9 (region som sträcker sig över aa 604-646 på human eIF4E), minskar 4EBP poolen av eIF4E som aktivt deltar i översättning och förhindrar eIF4F-komplexbildning. Samspelet mellan dessa proteinproteininteraktioner regleras huvudsakligen av däggdjursmålet rapamycin (mTOR)-medierad fosforylering av 4EBP. Vid mitogena stimuli fosforylerar mTOR direkt medlemmarna i proteinfamiljen 4E-BP, minskar deras koppling till eIF4E och därigenom främjar eIF4E-eIF4G-interaktion och bildandet av funktionella eIF4F-komplex10.
Trots den stora ansträngningen att utveckla föreningar riktade mot eIF4F komplexa integritet, bristen på analyser som mäter direkta störningar av eIF4E-eIF4G interaktion i levande celler har begränsat sökandet efter cellulära aktiva hit föreningar. Vi har tillämpat en luciferasanalys baserad på en coelenterazinanalog (t.ex. Nanoluc-baserad komplementeringsanalys) för att i realtid övervaka statusen för eIF4F-integritet genom eIF4E-eIF4G-interaktionen. Luciferase komplementering protein systemet består av en 18 kDa protein fragment (SubA) och 11 aminosyra peptid fragment (SubB) optimeras för minimal självanslutning och stabilitet11. En gång uttryckt som en fusionsprodukt med den mänskliga fulllängds eIF4E och eIF4E-interaktionsdomänen från human eiF4G1 (aa 604-646) kommer de två interagerande proteinerna att föra SubA- och SubB-fragmentet i närheten av varandra och kommer att inducera bildandet av den aktiva luciferasen som, i närvaro av ett cellpermeabelt substrat, så småningom kommer att generera en ljus luminescent signal (figur 1). Vi har på annat håll rapporterat om konstruktion och validering av eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem16.
Här beskriver vi hur eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem (tillgängligt på begäran) kan tillämpas för att korrekt mäta 4EBP1-medierad eIF4E-eIF4G-störning i levande celler. Dessutom visar vi dess nytta genom att mäta effekterna av flera mTOR-hämmare som för närvarande är under kliniska prövningar som potentiella cancerterapeutiska läkemedel12. Eftersom effekter utanför målet ofta maskerar läkemedelsspecifik aktivitet beskriver vi också hur mångsidigheten hos systemmätningen eIF4E:eIF4G604-646 kan utökas med ortogonala mätningar av cellulär livskraft för att ta hänsyn till dessa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

Bildandet av eIF4F-komplexet har visat sig vara den viktigaste nedströmsnoden för konvergens av signalvägar som ofta genomgår onkogen aktivering hos människor. eIF4F är ett kap-bindande komplex som är involverat i mRNA-ribosome rekryteringsfasen av översättningsinitiering. I många cellulära och prekliniska modeller av cancer leder avregleringen av eIF4F till ökad översättning av specifika mRNA-undergrupper som är involverade i cancerspridning och överlevnad. eIF4F är ett hetero-trimeriskt komplex byggt av den kapbindande underenheten eIF4E, helicase eIF4A och byggnadsställningsunderenheten eIF4G. Avgörande för montering av aktiva eIF4F-komplex är protein-proteininteraktionen mellan eIF4E- och eIF4G-proteiner. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll för att mäta eIF4F-sammansättning som övervakar statusen för eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler. EIF4e:4G cellbaserad protein-protein interaktionsanalys gör det också möjligt att noggrant och tillförlitligt bedöma läkemedelsinducerade förändringar i eIF4F komplexa integritet. Vi föreställer oss att denna metod kan tillämpas för att verifiera aktiviteten hos kommersiellt tillgängliga föreningar eller för ytterligare screening av nya föreningar eller modaliteter som effektivt stör bildandet av eIF4F-komplex.

För att validera känsligheten hos eIF4E:eIF4G604-646 komplementeringssystem bedömdes 4EBP1-medierad hämning av eIF4F-komplex montering med hjälp av mTOR-hämmare. Genom att hämma mTORC1-kinasberoende fosforylering av 4EBP-proteinfamiljen förstärker mTOR-hämningen 4EBP1-associationen till eIF4E och därmed eIF4F demontering15. Två klasser av mekanistiskt olika hämmare av mTOR-kinaser testades: rapaloger (t.ex. Rapamycin) som är allosteriska h?...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler som skulle göra det möjligt för användaren att utvärdera läkemedelsinducerad störd eIF4F-komplex dynamik i screeningformat.

Övervakning av eIF4F-sammansättning genom mätning av eIF4E-eIF4G-interaktion i levande celler

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Omfattande protokoll till prov och processen benmärg för att mäta mätbara kvarvarande sjukdom och leukemiska stamceller i akut myeloisk leukemi

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Bestämning av Protein uttryck nivå i odlade celler genom immuncytokemi på Paraffin-inbäddat Cell block

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Detektion och övervakning av tumörassocierade cirkulerande DNA i patientens Biofluider

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatisk PD-L1 karakterisering och uppräkning av cirkulerande tumörceller från icke-småcellig Lung cancer patienter genom Immunofluorescensering

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro-analys för att studera interaktion med tumör-makrofage

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Mätning i realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumörvävnad skivor

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Övervakning Cancer Cell Invasion och T-Cell cytotoxicitet i 3D-kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Utvärdering av Oncogenic Transformation i mänskliga mammary Epitelial celler

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

Fluorescensmikroskopi för ATP-internalisering medierad av makropinocytos hos mänskliga tumörceller och tumör-xenograferade möss

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...