Name: monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells
Uploaded: 2020-05-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Bu çalışma p53lab (BMSI, A*STAR) ve JCO VIP hibesinden (A*STAR) çekirdek bütçe ile desteklendi.

HEK293 hücre hattı protokol için kullanıldı ve Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta'sında kültürlendi. Hücreler nemlendirilmiş bir ortamda %5 CO2 ile 37 °C'de kültürlendi.
1. eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı test yoluyla eIF4F karmaşık bozulmanın nicel değerlendirmesi
<ol><li>Hücre kültürü ve eIF4E geçici transfeksiyon:eIF4G604-646 tamamlayıcı ...

<ol>
	<li>Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+cancer.">Translational control in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).</li><li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mechanism+of+translational+control.">Molecular Mechanism of translational control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).</li><li>Bhat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+translation+machinery+in+cancer.">Targeting the translation machinery in cancer.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).</li><li>Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+eIF4F+translation+initiation+complex:+a+critical+nexus+for+cancer+development.">Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development.</a> Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).</li><li>Montanaro, L., Pandolfi, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+mRNA+translation+in+oncogenesis:+the+role+of+eIF4E.">Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E.</a> Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).</li><li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=eIF4E:+A+retrospective.">eIF4E: A retrospective.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).</li><li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap-dependent+translation+initiation+in+eukaryotes+is+regulated+by+a+molecular+mimic+of+eIF4G.">Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G.</a> Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).</li><li>Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+function+of+the+second+eIF4E-binding+region+in+N-terminal+domain+of+eIF4G:+comparison+with+eIF4E-binding+protein.">Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).</li><li>Gr&#252;ner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Structures+of+eIF4E-eIF4G+Complexes+Reveal+an+Extended+Interface+to+Regulate+Translation+Initiation.">The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation.</a> Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).</li><li>Gingras, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+phosphorylation+of+the+translation+inhibitor+4E-BP1.">Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1.</a> Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).</li><li>Dixon, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells.">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li><li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR+kinase+inhibitors+as+potential+cancer+therapeutic+drugs.">mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs.</a> Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. , (2001).</li><li>Sekiyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+the+dual+activity+of+4EGI-1:+Dissociating+eIF4G+from+eIF4E+but+stabilizing+the+binding+of+unphosphorylated+4E-BP1.">Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).</li><li>Muller, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4E-BP+restrains+eIF4E+phosphorylation.">4E-BP restrains eIF4E phosphorylation.</a> Translation. 1 (2), e25819 (2013).</li><li>Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+flux+in+signalling+pathways+through+measurements+of+4EBP1-mediated+eIF4F+complex+assembly.">Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly.</a> BMC Biology. (1), 40 (2019).</li><li>Ran, X., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+protein-protein+interactions+(PPIs):+An+analysis+of+scaffold+choices+and+buried+surface+area.">Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).</li></ol>

Bu makalede açıklanan yöntem, canlı hücrelerde eIF4G-eIF4E etkileşiminin doğrudan ölçümü yoluyla eIF4F karmaşık montajını nicel olarak izlemek için luciferaz tabanlı bir tamamlayıcılık tahlili kullanır. EIF4E-eIF4G kompleasyon sisteminin kullanımı için ayrıntıları sağladık ve ayrıca sistemin eIF4E-eIF4G etkileşiminin ilaç kaynaklı 4EBP1 aracılı ayrışması ölçümlemede son derece doğru olduğunu gösterdik16. Bu tahlilin verimini kolaylaştırmak için, bu ma...

Gen ekspresyonunun kontrolü, büyüme çoğalması ve farklılaşma gibi hücresel programların doğru yürütülmesinde önemli bir rol oynar. Gen transkripsiyonu düzeyinde veya mRNA çevirisi düzeyinde bir düzenleyici kontrol mekanizması uygulanabilir. Son on yılda, daha sonraki uzama ve sonlandırma adımları yerine başlatma sürecinin modülasyonu ile çeviri kontrolünün, çok çeşitli biyolojik işlevleri oynayan belirli protein alt kümelerinin sentezini ince bir şekilde düzenleyebileceği giderek daha belirgin hale gelmiştir.
Sağkalım, anti-otofajik ve anti-apoptotik yanıtlarda yer alan mRNA'ların artan çevirisi birkaç kansere karışmıştır ve ayrıca sapkın aktivasyon veya çeviri başlatma faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile nedensel olarak bağlantılıdır1.
eIF4F kompleksi, çeviri başlatmanın ana düzenleyicisidir. mRNA'ların 5' ucundaki kapak yapısını bağlayarak, eIF4F ilk mRNA-ribozom alımını yönlendiriyor ve buna karşılık zayıf çevrilmiş ökaryotikmRNA'larınmRNA çeviri verimliliğini artırıyor 2 . Kansere bağlı mRNA'ların eIF4F aracılı çevirisi, RAS / MAPK veya AKT / TOR yollarının anormal aktivasyonunu barındıran birçok kanser modeli için bildirilmiştir, bu da kanser hücrelerinin kendi neoplastik aktivitelerini artırmak için eIF4F'yi yükselttiğini göstermektedir. EIF4F karmaşık oluşumunu engelleyerek bu ilerleme döngüsünün bozulması, böylece çok umut verici bir terapötik stratejidir3,4.
eIF4F kompleksi (i) eIF4E, mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase ve (iii) eIF4G'nin 5' UTR'sinde bulunan kapak yapısıyla etkileşime giren eIF4F'nin kapak bağlama alt birliği, hem eIF4A hem de eIF4E ile etkileşime giren ve sonunda 40S ribozomal alt birliği5'iişe alan iskele proteini. eIF4E ile eIF4G ilişkisi fonksiyonel eIF4F komplekslerinin montajı için hız sınırlayıcı adımdır ve eIF4E bağlayıcı proteinler (4EBP'ler, üyeler 1, 2 ve 3)) tarafından olumsuz düzenlenir6. 4EBP, kurallı ve kurallı olmayan eIF4E bağlama dizileri7, 8,9'dan (insan eIF4E'de aa 604-646'yı kapsayan bölge) oluşan bir arayüz aracılığıyla eIF4E'ye eIF4G bağlama ile rekabet ederek, çeviride aktif olarak yer alan eIF4E havuzunu azaltır ve eIF4F karmaşık oluşumunu önler. Bu protein-protein etkileşimlerinin etkileşimi esas olarak 4EBP'nin rapamycin (mTOR) aracılı fosforilasyonunun memeli hedefi tarafından düzenlenir. Mitojenik uyaranlar üzerine, mTOR doğrudan 4E-BP protein ailesinin üyelerini fosforilize eder, eIF4E ile ilişkilerini azaltır ve böylece eIF4E-eIF4G etkileşimini ve fonksiyonel eIF4F komplekslerinin oluşumunu teşvikeder 10.
EIF4F karmaşık bütünlüğünü hedefleyen bileşikler geliştirmedeki büyük çabaya rağmen, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin doğrudan bozulmasını ölçen tahlillerin olmaması hücresel aktif isabet bileşiklerinin aranmasını sınırlamıştır. EIF4E-eIF4G etkileşimi yoluyla eIF4F bütünlüğünün durumunu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir koelenterazin analoga (örneğin, Nanolüc tabanlı kompleasyon tahlili) dayanan bir luciferaz tahlil uyguladık. Luciferaz kompleasyon protein sistemi, minimum kendi kendine ilişki ve stabilite için optimize edilmiş 18 kDa protein parçası (SubA) ve 11 amino asit peptit parçasından (SubB) oluşur11. Bir kez insan tam uzunlukta eIF4E ve insan eiF4G1 (aa 604-646) eIF4E etkileşim etki alanı ile bir füzyon ürünü olarak ifade edildikten sonra, iki etkileşim proteini SubA ve SubB parçasını birbirlerinin yakınına getirecek ve aktif luciferaz oluşumunu teşvik edecektir, bir hücre geçirgen substratı varlığında, sonunda parlak bir parlaklık sinyali üretecektir (Şekil 1). EIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin16.
Burada, canlı hücrelerde 4EBP1 aracılı eIF4E-eIF4G bozulmasını doğru bir şekilde ölçmek için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı sisteminin (istek üzerine kullanılabilir) nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Ek olarak, şu anda klinik çalışmalar altında olan birkaç mTOR inhibitörünün etkilerini potansiyel kanser terapötik ilaçlar olarak ölçerek faydasını gösteriyoruz12. Hedef dışı etkiler genellikle ilaca özgü aktiviteyi maskelediğinden, eIF4E:eIF4G604-646 sistem ölçümünün çok yönlülüğünün, bunları dikkate almak için hücresel canlılığın ortogonal ölçümleriyle nasıl genişletilebileceğini de açıklıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293FT cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R70007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate 96 well, F-Bottom</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>655083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell titer Glo 2.0</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>G9241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>not applcable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4662050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUGENE6</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>E2692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L3000015" target="_blank">L3000015</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoBiT PPI Starter Systems</td>
			<td>PROMEGA</td>
			<td>N2014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11058021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>not appicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>AC-155S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring eif4f assembly by measuring eif4e-eif4g interaction in live cells

eIF4F kompleksinin oluşumu, insanlarda sıklıkla onkojenik aktivasyona uğrayan sinyal yollarının yakınsaması için anahtar aşağı akış düğümü olarak gösterilmiştir. eIF4F, çeviri başlatmanın mRNA-ribozom işe alım aşamasında yer alan bir kapak bağlama kompleksidir. Birçok hücresel ve klinik öncesi kanser modelinde, eIF4F'nin deregülasyonu, kanserin çoğalması ve sağkalımında rol oynayan spesifik mRNA alt kümelerinin çevirisinin artmasına yol açar. eIF4F, kapak bağlama alt birliği eIF4E, helicase eIF4A ve iskele alt birliği eIF4G'den inşa edilmiş hetero-trimerik bir komplekstir. Aktif eIF4F komplekslerinin montajı için kritik olan eIF4E ve eIF4G proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimidir. Bu makalede, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin durumunu izleyen eIF4F derlemesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. eIF4e:4G hücre bazlı protein-protein etkileşimi tahlili, eIF4F karmaşık bütünlüğündeki ilaç kaynaklı değişikliklerin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini de sağlar. Bu yöntemin ticari olarak mevcut bileşiklerin aktivitesini doğrulamak veya eIF4F kompleksinin oluşumunu verimli bir şekilde bozan yeni bileşiklerin veya modalitelerin daha fazla taranması için uygulanabileceğini öngörüyoruz.

eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin hassasiyetini doğrulamak için mTOR inhibitörleri kullanılarak eIF4F kompleks montajının 4EBP1 aracılı inhibisyonu değerlendirildi. 4EBP protein ailesinin mTORC1 kinaz bağımlı fosforilasyonunu inhibe ederek, mTOR inhibisyonu eIF4E'ye 4EBP1 ilişkisini geliştirir ve bu nedenle eIF4F sökme15. MTOR kinazlarının mekanistik olarak farklı inhibitörünün iki sınıfı test edilmiştir: mTORC1'in allost...

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells at JoVE.com

Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells

Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde eIF4E-eIF4G Etkileşimi Ölçülerek eIF4F Montajlarını İzleme

Formation of the eIF4F complex has been shown to be the key downstream node for the convergence of signalling pathways that often undergo&#160;oncogenic ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Determination of Protein Expression Level in Cultured Cells by Immunocytochemistry on Paraffin-embedded Cell Blocks

Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Immunofluorescent staining is currently the method of choice for determination of protein expression levels in cell-culture systems when morphological ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Bir küresel öldürme tahlil araba T hücreleri tarafından

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Detection and Monitoring of Tumor Associated Circulating DNA in Patient Biofluids

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Complications associated with upfront and repeat surgical tissue sampling present the need for minimally invasive platforms capable of molecular ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Organotipik Tümör Doku Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İlaç Yanıtının Ölçülmesi

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Fluorescence Microscopy for ATP Internalization Mediated by Macropinocytosis in Human Tumor Cells and Tumor-xenografted Mice

İnsan Tümör Hücrelerinde ve Tümör-ksinografted Farelerde Makropinositoz Aracılı ATP İçselleştirme için Floresan Mikroskopi

Adenosine triphosphate (ATP), including extracellular ATP (eATP), has been shown to play significant roles in various aspects of tumorigenesis, such as ...