Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

ويود المؤلفون أن ينوهوا ببرنامج زمالة الزراعة والأغذية التابع لرئيس وزراء غرب أستراليا (وزارة الوظائف والسياحة والعلوم والابتكار، وحكومة غرب أستراليا) وزميل رئيس الوزراء، البروفيسور سيمون كوك (مركز الزراعة الرقمية، جامعة كورتين وجامعة مردوخ). تم دعم التجارب الميدانية وجمع عينات الحبوب من قبل حكومة برنامج الإتاوات للمناطق في غرب أستراليا. نحن نعترف غرانتلي ستاينر وروبير الفرنسية لمساهماتهم في التجارب الميدانية. يتم الاعتراف بالمنصات الحيوية الأسترالية الممولة من NCRIS لتمويل المعدات.

هذه الطريقة مناسبة ل30 عينة (حوالي 150 بذور لكل عينة). واستخدمت هنا ثلاثة نسخ بيولوجية من عشرة أصناف مختلفة من القمح المزروع ة في الحقول.
1. إعداد الحبوب
<ol><li>استرداد العينات (الحبوب الكاملة) من تخزين -80 درجة مئوية. ملاحظة: يوصى بتجفيف البذور بعد وقت قصير من الحصاد إذا تم جمع عين...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

هنا ، نقدم طريقة metabolomics غير المستهدفة المستندة إلى LC-MS لتحليل حبوب القمح. وتجمع هذه الطريقة بين أربعة أوضاع للاقتناء (المرحلة المعكوسة والمرحلة المعكوسة للدهون والتأيّن الموجب والسالب) في وضعين بإدخال مرحلة متنقلة ثالثة في تدرج المرحلة المعكوس. وأسفر النهج المشترك عن نحو 500 من السمات ذات ?...

ويمكن أن يتيح فهم التفاعلات بين الجينات والبيئة والممارسات الإدارية في الزراعة التنبؤ والإدارة الأكثر دقة لغلة المنتجات وجودتها. تتأثر الأيض النباتية بعوامل مثل الجينوم والبيئة (المناخ وهطول الأمطار وما إلى ذلك) ، وفي البيئة الزراعية ، تتم إدارة المحاصيل (أي استخدام الأسمدة ومبيدات الفطريات وما إلى ذلك). على عكس الجينوم ، يتأثر metabolome بكل هذه العوامل ، وبالتالي توفر بيانات metabolomics بصمة كيميائية حيوية لهذه التفاعلات في وقت معين. عادة ما يكون هناك واحد من هدفين لدراسة تستند إلى metabolomics: أولاً ، لتحقيق فهم أعمق للكيمياء الحيوية للكائن الحي والمساعدة في شرح آلية الاستجابة للاضطراب (الإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي) فيما يتعلق بعلم وظائف الأعضاء ؛ أولاً ، تحقيق فهم أعمق للكيمياء الحيوية للكائن الحي والمساعدة في شرح آلية الاستجابة للاضطراب (الإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي) فيما يتعلق بعلم وظائف الأعضاء . وثانيا، لربط المؤشرات الحيوية مع الاضطرابات قيد الدراسة. وفي كلتا الحالتين، فإن نتيجة الحصول على هذه المعرفة هي استراتيجية إدارية أكثر دقة لتحقيق هدف تحسين حجم الغلة ونوعيتها.
ومن المتوقع أن يحتوي الميتابولوم النباتي على الآلاف1 من الجزيئات الصغيرة ذات الخصائص الفيزيائية الكيميائية المتنوعة. حاليا، لا يمكن لمنصات metabolomics (قياس الطيف الكتلي في الغالب والطيف المغناطيسي النووي) التقاط metabolome بأكمله في تحليل واحد. تطوير مثل هذه التقنيات (إعداد العينة، استخراج المستقلب والتحليل)، والتي توفر تغطية كبيرة من metabolome ممكن في غضون تشغيل تحليلي واحد، هو هدف رئيسي للباحثين metabolomics. وقد جمعت التحليلات السابقة غير المستهدفة لحبوب القمح بين البيانات المستمدة من عمليات فصل لوني متعددة وأقطاب اكتساب و/أو أجهزة لزيادة تغطية الميتابولم. غير أن ذلك تطلب إعداد عينات واقتنائها بشكل منفصل لكل طريقة. فعلى سبيل المثال، أعد كل من Beleggia et al.2 عينة مشتقة لتحليل التحليل GC-MS للتحليلات القطبية بالإضافة إلى تحليل GC-MS للتحليلات غير القطبية. واستخدم "داس" وآخرونأساليب "GC- وLC-MS" لتحسين التغطية في تحليلاتهم؛ غير أن هذا النهج سيتطلب عموما ً إعداد عينات منفصلة على النحو المبين أعلاه فضلاً عن منصتين تحليليتين مستقلتين. التحليلات السابقة لحبوب القمح باستخدام GC-MS22،3،,4 و LC-MS3،,5منصات قد أسفرت عن 50 إلى 412 (55 محددة) ميزات لGC-MS، 409 لGC-MS مجتمعة وLC-MS وعدة آلاف لتحليل الدهون LC-MS5. من خلال الجمع بين ما لا يقل عن وضعين في تحليل واحد ، يمكن الحفاظ على تغطية metabolome الموسعة ، مما يزيد من ثراء التفسير البيولوجي مع توفير في الوقت والتكلفة على حد سواء.
للسماح بالانفصال الفعال لمجموعة واسعة من أنواع الدهون عن طريق اللوني عكس المرحلة، والمنهجيات الحديثة الدهون تستخدم عادة نسبة عالية من الإيزوبروبانول في المذيبات elution6،وتوفير وسائل الراحة لفئات الدهون التي قد تكون خلاف ذلك دون حل من قبل الكروماتوغرافيا. لفصل الدهون كفاءة، مرحلة متنقلة بدءا هو أيضا أعلى بكثير في التكوين العضوي7 من الأساليب الكروماتوغرافية المرحلة النموذجية عكس، والتي تنظر في فئات أخرى من الجزيئات. التركيب العضوي العالي في بداية التدرج يجعل هذه الأساليب أقل ملاءمة للعديد من الفئات الأخرى من الجزيئات. وعلى الأخص، يستخدم اللون اللوني السائل للمرحلة المعكوسة تدرجًا ثنائيًا مذيبًا ، بدءًا من تكوين مائي في الغالب وزيادة في المحتوى العضوي مع زيادة قوة اللونية. ولتحقيق هذه الغاية، سعينا إلى الجمع بين النهجين لتحقيق الفصل بين كل من الفئات الدهنية وغير الدهنية من الأيض ضمن تحليل واحد.
هنا، نقدم طريقة كروماتوغرافية تستخدم مرحلة متنقلة ثالثة وتمكن من مرحلة تقليدية معكوسة مشتركة وطريقة كروماتوغرافية مناسبة للدهون باستخدام إعداد عينة واحدة وعمود تحليلي واحد. لقد اعتمدنا العديد من تدابير مراقبة الجودة وخطوات تصفية البيانات التي تم تنفيذها سابقًا في دراسات metabolomics السريرية في الغالب. وهذه النُهج مفيدة في تحديد السمات القوية ذات الاستنساخ التقني العالي والأهمية البيولوجية وتستبعد تلك التي لا تستوفي هذه المعايير. على سبيل المثال، نحن نصف تكرار تحليل عينة مراقبة الجودة المجمعة8،QC التصحيح9،تصفية البيانات9،,10 ونسب الميزات المفقودة11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

ويمكن أن يتيح فهم التفاعلات بين الجينات والبيئة والإدارة في الممارسة الزراعية التنبؤ والإدارة الأكثر دقة لغلة المنتجات وجودتها. توفر بيانات Metabolomics قراءة لهذه التفاعلات في لحظة معينة من الزمن وغنية بالمعلومات عن حالة الكائن الحي الكيميائية الحيوية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الأيض الفردية أو لوحات من الأيض كعلامات حيوية دقيقة للتنبؤ والجودة والإدارة. ومن المتوقع أن يحتوي الميتابولوم النباتي على آلاف الجزيئات الصغيرة ذات الخصائص الفيزيائية الكيميائية المتنوعة التي توفر فرصة للحصول على نظرة حيوية كيميائية في الصفات الفسيولوجية واكتشاف العلامات الحيوية. لاستغلال هذا ، والهدف الرئيسي للباحثين metabolomics هو التقاط أكبر قدر ممكن من التنوع الفيزيائي الكيميائي في تحليل واحد. هنا نقدم طريقة قياس الطيف اللوني السائل القائم على الكتلة غير المستهدفة لتحليل حبوب القمح المزروعة في الحقل. تستخدم الطريقة مدير المذيبات الرباعية اللوني السائل لإدخال مرحلة متنقلة ثالثة وتجمع بين تدرج المرحلة المعكوسة التقليدية مع تدرج الدهون القابلة للاستبدال. يتم وصف إعداد الحبوب واستخراج المستقلب والتحليل الآلي وسير عمل معالجة البيانات بالتفصيل. ولوحظت دقة جيدة للكتلة وقابلية استنساخ الإشارة، وأسفرت الطريقة عن حوالي 500 من السمات ذات الصلة بيولوجياً لكل وضع تأيّن. علاوة على ذلك ، تم تحديد المستقلب وإشارات ميزة الدهون المختلفة بشكل كبير بين أصناف القمح.

يتأثر الميتابولم النباتي بمزيج من الجينوم والبيئة ، بالإضافة إلى ذلك في بيئة زراعية ، نظام إدارة المحاصيل. نحن نثبت أن الاختلافات الجينية بين أصناف القمح يمكن ملاحظتها على مستوى المستقلب ، هنا ، مع أكثر من 500 مركب مقيس تظهر تركيزات مختلفة بشكل كبير بين الأصناف في الحبوب و...

Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

يتم تقديم طريقة للتحليل غير المستهدف لاستقلاب حبوب القمح والدهون. ويتضمن البروتوكول طريقة استخراج المستقلب الأسيتونتريل وعكس مرحلة منهجية قياس الطيف اللوني الشامل السائل، مع اكتساب في أوضاع التأيّن الكهربائي الإيجابية والسلبية.

تحليل الموجات الاختزالية السائلة غير المستهدفة - قياس الطيف الشامل - Metabolomics من حبوب القمح

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

ويتأثر هذا المستقلب بعوامل مثل البيئة الوراثية وممارسات الإدارة. ويمكن أن يسمح فهم التفاعلات بين هذه العوامل بالتنبؤ والإدارة الأكثر دقة لغلة المنتج وجودته. ومن خلال دمج مرحلة متنقلة ثالثة، بدلاً من الطورين التقليديين، تتيح هذه التقنية فصل وكشف مجموعة أوسع من الأيضات.يمكن تطبيق نواتج الأيض على أي مجال من مجالات علم الأحياء. أولاً، تحقيق فهم أعمق للكيمياء الحيوية للكائن الحي، والمساعدة في شرح استجابتها للإجهاد اللاأحيائي أو الحيوي فيما يتعلق بعلم وظائف الأعضاء. ثانياً، ربط المؤشرات الحيوية بالانزعاج الذي يجري دراسته.كما الكحول الايزوبروبيل هو مذيب لزج، ينبغي أن يتم إدخاله بمعدل توهج منخفض، ووقت التوازن الكافي المستخدمة قبل زيادة التكوين إلى 98٪ هذه الخطوات سوف تمنع نظام الرسومات لوني من الإفراط في الضغط، والعودة خطأ، أو يحتمل أن تضر العمود التحليلي. للبدء في إعداد الحبوب، استخدم خلاط مختبر لطحن الحبوب. تشغيل الخلاط على سرعة عالية لمدة 20 ثانية ثم كرر.إزالة جرة خلاط من القاعدة. اضغط على جانب جرة الخلاط لجلب أي حبة طحين الأرض الخشنة إلى سطح العينة. يمكن التخلص من الحبوب الخشنة الأرض، أو تخزينها.نقل الحبوب الأرض ناعما من الخلاط إلى أنبوب جهاز طرد مركزي صغير البلاستيك 2 ملليلتر. في نفس يوم الاستخراج، قم بإعداد المذيبات المستخرجة، كما هو موضح في المخطوطة. بعد ذلك، تزن 200 ملليغرام من الحبوب الأرض ناعما في أنبوب جهاز طرد مركزي صغير مليلتر اثنين.إضافة 500 ميكرولترات من المذيبات استخراج إلى الحبوب في الأنبوب. وبالإضافة إلى ذلك، وإعداد فارغة بإضافة 500 ميكرولترات من المذيبات استخراج إلى أنبوب فارغ. باستخدام المهيج، تعيين في 6، 500 دورة في الدقيقة، مزيج من المذيبات والحبوب لمدة 20 ثانية.ثم، كرر لمدة 20 ثانية أخرى. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في أربع درجات مئوية و 16، 100 مرة G، لمدة خمس دقائق. نقل فائقة إلى أنبوب بلاستيكي ملليلتر اثنين والاحتفاظ بيليه.كرر عملية الاستخراج على بيليه مرتين. الجمع بين عظمى ثلاثة، مما أسفر عن حجم استخراج إجمالي من 1.5 ملليلتر تقريبا ومزيج من دوامة. لجعل عينة مجمعة من جميع مقتطفات الحبوب لاستخدامها لمراقبة الجودة، ونقل 55 ميكرولترات من كل استخراج الحبوب إلى أنبوب مليلتر دوامة.ثم، نقل 50 aliliter نقا من هذه العينة المجمعة إلى قارورة الزجاج. نقل aliquot 50 ميكرولتر من كل استخراج عينة الحبوب إلى قارورة الزجاج. كما هو موضح في المخطوطة المكتوبة، أعد الحلول التي ستكون مطلوبة لقياس الطيف الكتلي اللوني السائل.في يوم تحليل LCMS، وإعداد 100 ملليلتر من 5٪ الأسيتونتريل، تحتوي على 200 نانوغرام لكل ملليلتر لوسين إنكيفلين. إضافة 950 ميكرولترات من هذا الحل إلى قارورة الزجاج التي تحتوي على 50 ميكرولتر aliquot من استخراج الحبوب. اخلط المحتويات في القارورة عن طريق الدوامة.أولاً، قم بإعداد معايرة الصكوك كما هو موضح في المخطوطة ودليل المستخدم لدى الشركة المصنعة. بعد ذلك، تطهير ومسح نظام السوائل LC باستخدام المذيبات الصف LCMS، بما في ذلك المرحلة المتنقلة والمذيبات غسل. اكويتبات نظام LC باستخدام طريقة LC بدء الظروف، وضمان أن ضغط العمود قد استقرت.قم بإعداد جدول تسلسل الأدوات. حقن فور ماتودي في بداية تسلسل العينة للتحقق من معايرة الجهاز. تحليل الفراغات المذيبة والمحض أولاً، تليها عينات مراقبة الجودة المجمعة لتكييف النظام، ثم قائمة العينات العشوائية.تشغيل نماذج مراقبة الجودة على فترات منتظمة، كما replicates الفنية. تشغيل نموذجين لمراقبة الجودة في نهاية التسلسل. أثناء تشغيل التسلسل، تحقق من جودة البيانات، بما في ذلك دقة الكتلة القياسية الداخلية وإمكانية إعادة إنتاج الإشارة.للتحقق من إعادة إنتاج الإشارة، ينبغي أن يكون الفحص البصري للأطياف المتراكبة كافياً. وأدرجت أربعة معايير داخلية في الحل المستخدم لإعداد مستخلصات الحبوب. وخلال نظام المقاييس الموحدة، لوحظت دقة الكتلة الجيدة وقابلية التكرار الفردية للمعايير الداخلية بالنسبة لأساليب التأين الإيجابية والسلبية على حد سواء.واستنادا إلى تحليل الفراغات، تم الحكم على 421 إشارة في الوضع السلبي و 835 إشارة في الوضع الإيجابي على أنها من القطع الأثرية. وكانت هذه الإشارات موجودة في الفراغات بكثافة تساوي أو تزيد على 5٪ من متوسط كثافة واحدة في عينات الحبوب. بعد إزالة القطع الأثرية ومزيد من تصفية البيانات، عاد الوضع السلبي 483 ميزات والوضع الإيجابي عاد 523 ميزات.وكان ما يقرب من 250 من المعالم ذات الصلة بيولوجيا وتختلف اختلافا كبيرا في كثافة عبر أصناف القمح. ومن المهم أن نتذكر في هذا البروتوكول تدابير مراقبة الجودة، مثل إدراج الفراغات المُعدية والمعايير الداخلية والعينات المجمَّعة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

النهج القائم على الطيف، جنبا إلى جنب السائل اللوني الكتلة لتحليل المستقلب من<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

التنميط البروتين العميق بوسم إيسوباريك وواسعة النطاق اللوني السائل والطيف الكتلي وساعدت برامج القياس الكمي

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

التحليل شبه الكمي للببتيدوغليكان بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة قياس الطيف الكتلي والمعلوماتية الحيوية

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

نهج البروتينات القائم على قياس الطيف الكتلي لتحليل مثيلة البروتين R العالمية وعالية الثقة

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

تنميط المركبات المتطايرة في فاكهة الكشمش الأسود باستخدام الاستخراج المجهري للمرحلة الصلبة في مساحة الرأس إلى جانب كروماتوغرافيا الغاز - قياس الطيف الكتلي

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...