Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende West Australian Premier's Landbrug og Fødevarer Fellowship program (Department of Jobs, Turisme, Videnskab og Innovation, regeringen i Western Australia) og Premier's Fellow, professor Simon Cook (Center for digitalt landbrug, Curtin Universitet og Murdoch Universitet). Feltforsøg og kornprøve indsamling blev støttet af regeringen i Western Australia's Royalties for Regioner program. Vi anerkender Grantley Stainer og Robert French for deres bidrag til feltforsøg. Den NCRIS-finansierede Bioplatforms Australien er anerkendt for finansiering af udstyr.

Denne metode er velegnet til 30 prøver (ca. 150 frø pr. prøve). Her blev der anvendt tre biologiske replikater af ti forskellige markdyrkede hvedesorter.
1. Fremstilling af korn
<ol><li>Prøver (fuldkorn) udtages fra -80 °C opbevaring. BEMÆRK: Frysetørring af frø anbefales kort efter høst, hvis der indsamles prøver fra flere årstider. Dette minimerer eventuelle ændringer i metabolitkoncentrationen, der kan opstå efter varierende opbevaringsperioder. For at gøre dette, overfø...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

Her præsenterer vi en LC-MS-baseret ikke-målrettet metabolomics metode til analyse af hvedekorn. Metoden kombinerer fire anskaffelsestilstande (omvendt fase og lipid-modtagelig omvendt fase med positiv og negativ ionisering) i to tilstande ved at indføre en tredje mobil fase i den omvendte fasegradient. Den kombinerede metode gav ca. 500 biologisk relevante træk pr. ionpolaritet, idet ca. halvdelen af disse var væsentligt forskellige i intensitet mellem hvedesorter. Væsentlige ændringer i metabolitkoncentrationen ...

En forståelse af samspillet mellem gener, miljø og forvaltningspraksis i landbruget kunne give mulighed for en mere nøjagtig forudsigelse og forvaltning af produktudbytte og -kvalitet. Plantemetabolitter påvirkes af faktorer som genom, miljø (klima, nedbør osv.) og i et landbrugsmiljø, hvordan afgrøder forvaltes (dvs. anvendelse af gødning, fungitid osv.). I modsætning til genomet påvirkes metabolomet af alle disse faktorer, og derfor giver metabolomiske data et biokemisk fingeraftryk af disse interaktioner på et bestemt tidspunkt. Der er normalt et af to mål for en metabolom-baseret undersøgelse: for det første at opnå en dybere forståelse af organismens biokemi og hjælpe med at forklare mekanismen for reaktion på forstyrrelser (abiotisk eller biotisk stress) i forhold til fysiologi; og for det andet at knytte biomarkører til den undersøgte forstyrrelser. I begge tilfælde er resultatet af at have denne viden en mere præcis ledelsesstrategi for at nå målet om forbedret udbyttestørrelse og kvalitet.
Planten metabolom forventes at indeholde tusindvis1 af små molekyler med varierede fysisk-kemiske egenskaber. I øjeblikket kan ingen metabolomiske platforme (overvejende massespektrometri og nuklear magnetisk resonansspektroskopi) fange hele metabolomet i en enkelt analyse. Udvikling af sådanne teknikker (prøve forberedelse, metabolit ekstraktion og analyse), som giver så stor en dækning af metabolom som muligt inden for en enkelt analytisk køre, er et centralt mål for metabolomics forskere. Tidligere ikke-målrettede metabolomanalyser af hvedekorn har kombineret data fra flere kromatografiske separationer og erhvervelsepolariteter og/eller instrumentering for større metabolomdækning. Dette har imidlertid krævet, at prøver blev fremstillet og erhvervet separat for hver modalitet. F.eks. udarbejdede Beleggia et al.2 en afledte prøve til GC-MS-analysen af polaranalysatorer ud over GC-MS-analysen af de ikke-polære analysatorer. Das et al.3 anvendte både GC- og LC-MS-metoder til at forbedre dækningen i deres analyser. Denne fremgangsmåde vil dog generelt kræve særskilte prøvepræparater som beskrevet ovenfor samt to uafhængige analytiske platforme. Tidligere analyser af hvedekorn ved hjælp af GC-MS3,5 2,,3,,4 og LC-MS 3 , 5 platforme har givet 50 til 412 (55 identificerede) funktioner til GC-MS, 409 for kombineret GC-MS og LC-MS og flere tusinde for en LC-MS lipidomics analyse5. Ved at kombinere mindst to tilstande i en enkelt analyse, udvidet metabolom dækning kan opretholdes, øge den rigdom af biologisk etolkning og samtidig tilbyde besparelser i både tid og omkostninger.
For at muliggøre en effektiv adskillelse af en bred vifte af lipidarter ved omvendt fase kromatografi, moderne lipidomics metoder almindeligt bruger en høj andel af isopropanol i eluering opløsningsmiddel6, giver forbedring til lipid klasser, der ellers ville være uløste ved kromatografi. For en effektiv lipidseparation er startmobilfasen også meget højere i organisk sammensætning7 end de typiske omvendte fasekromatografiske metoder, der tager hensyn til andre klasser af molekyler. Den høje organiske sammensætning i starten af gradienten gør disse metoder mindre egnede til mange andre klasser af molekyler. Mest bemærkelsesværdigt, omvendt fase flydende kromatografi beskæftiger en binær opløsningsmiddel gradient, begyndende med en for det meste vandig sammensætning og stigende i organisk indhold som eluering styrken af kromatografi øges. Til dette formål forsøgte vi at kombinere de to tilgange for at opnå adskillelse af både lipid og ikke-lipid klasser af metabolitter inden for en enkelt analyse.
Her præsenterer vi en kromotografisk metode, der bruger en tredje mobil fase og muliggør en kombineret traditionel omvendt fase og lipidomics-passende kromatografimetode ved hjælp af en enkelt prøveforberedelse og en analytisk kolonne. Vi har vedtaget mange af de kvalitetskontrolforanstaltninger og datafiltreringstrin, der tidligere er blevet implementeret i overvejende kliniske metabolomundersøgelser. Disse tilgange er nyttige til bestemmelse af robuste egenskaber med høj teknisk reproducerbarhed og biologisk relevans og udelukker dem, der ikke opfylder disse kriterier. For eksempel beskriver vi gentagen analyse af den samlede QC prøve8, QC korrektion9, data filtrering9,10 og imputation af manglende funktioner11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

En forståelse af samspillet mellem gener, miljø og forvaltning i landbrugspraksis kunne give mulighed for en mere nøjagtig forudsigelse og forvaltning af produktudbytte og -kvalitet. Metabolomics data giver en udlæsning af disse interaktioner på et givet tidspunkt og er informativ af en organismes biokemiske status. Endvidere kan individuelle metabolitter eller paneler af metabolitter anvendes som præcise biomarkører for udbytte og kvalitetsforudsigelse og -styring. Planten metabolom forventes at indeholde tusindvis af små molekyler med varierede fysisk-kemiske egenskaber, der giver mulighed for en biokemisk indsigt i fysiologiske træk og biomarkør opdagelse. For at udnytte dette, et centralt mål for metabolomics forskere er at fange så meget af den fysisk-kemiske mangfoldighed som muligt inden for en enkelt analyse. Her præsenterer vi en flydende kromatografi-masse spektrometri-baserede umålrettede metabolomics metode til analyse af markdyrket hvedekorn. Metoden bruger den flydende kromatograf kvomernære opløsningsmiddel manager til at indføre en tredje mobil fase og kombinerer en traditionel omvendt fase gradient med en lipid-modtagelig gradient. Kornforberedelse, metabolitekstraktion, instrumental analyse og databehandlingsarbejdsgange er beskrevet i detaljer. God massenøjagtighed og signalreproducerbarhed blev observeret, og metoden gav ca. 500 biologisk relevante funktioner pr. ioniseringstilstand. Endvidere blev der fastlagt betydeligt forskellige metabolit- og lipidfunktionssignaler mellem hvedesorter.

Planten metabolom er påvirket af en kombination af sit genom og miljø, og derudover i en landbrugsmæssig indstilling, afgrødeforvaltning regime. Vi viser, at genetiske forskelle mellem hvedesorter kan observeres på metabolitniveau, her, med over 500 målte forbindelser, der viser signifikant forskellige koncentrationer mellem sorter i kornet alene. Der blev observeret god massenøjagtighed (<10 ppm-fejl) og signalreproducerbarhed (<20% RSD) af interne standarder (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

En metode til ikke-målrettet analyse af hvede korn metabolitter og lipider præsenteres. Protokollen indeholder en acetonitril metabolit ekstraktionsmetode og omvendt fase flydende kromatografi-masse spektrometri metode, med erhvervelse i positive og negative elektrospray ionisering tilstande.

Umålrettet flydende kromatografi-massespektrometri-baserede metabolomiske analyse af hvedekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Metabolitten påvirkes af faktorer som genommiljøet og forvaltningspraksis. En forståelse af samspillet mellem disse faktorer kan give mulighed for mere præcis forudsigelse og styring af et produkts udbytte og kvalitet. Ved at indarbejde en tredje mobil fase, snarere end de traditionelle to, denne teknik giver mulighed for adskillelse og påvisning af en bredere vifte af metabolitter.Metabolomics kan anvendes på ethvert område af biologi. For det første at opnå en dybere forståelse af en organisme biokemi, og hjælpe med at forklare deres reaktion på abiotisk eller biotisk stress i forhold til fysiologi. For det andet at forbinde biomarkører med den undersøgelse, der undersøges.Da isopropylalkohol er et tyktflydende opløsningsmiddel, bør det indføres ved lav flarehastighed, og der bør anvendes tilstrækkelig ækvilibreringstid, før sammensætningen øges til 98 %Disse trin forhindrer det kromatiske grafiske system i at lægge for meget tryk, returnere en fejl eller potentielt beskadige analysesøjlen. For at begynde forberedelse af korn, skal du bruge et laboratorium blender til at male kornet. Kør blenderen med høj hastighed i 20 sekunder, og gentag derefter.Fjern blenderglasset fra bunden. Bank på siden af blenderglasset for at bringe eventuelt groft malet korn til prøvens overflade. Det grove korn kan kasseres eller opbevares.Overfør det fintbesortede korn fra blenderen til et mikrocentrifugerør af to milliliterplast. På samme dag som ekstraktionen forberedes ekstraktionsopløsningsmidlet som beskrevet i manuskriptet. Dernæst vejer 200 milligram fintfødt korn i et to-milliliter mikrocentrifugerør.Tilsæt 500 mikroliter ekstraktionsmiddel til kornet i røret. Desuden forberedes en blind ved at tilføje 500 mikroliter ekstraktionsmiddel til et tomt rør. Ved hjælp af en homogenisator, sat til 6, 500 RPM, bland opløsningsmiddel og korn i 20 sekunder.Gentag derefter i yderligere 20 sekunder. Derefter centrifuge røret ved fire grader Celsius og 16, 100 gange G, i fem minutter. Overfør supernatanten til et to milliliter plastrør og hold pellet.Gentag ekstraktionsprocessen på pellet to gange. Kombiner de tre supernatants, hvilket giver et samlet ekstraktvolumen på ca. 1,5 milliliter og blandes ved at vortexing. For at lave en samlet prøve af alle de kornekstrakter, der skal anvendes til kvalitetskontrol, overføres 55 mikroliter af hvert kornekstrakt til et to milliliterrør og vortex.Derefter overføres 50 mikroliter aliquots af denne poolede prøve til glashætteglas. Overfør en 50-mikroliter aliquot af hver kornprøve ekstrakt til glashætteglas. Som beskrevet i det skriftlige manuskript skal du forberede de løsninger, der vil være nødvendige for flydende kromatografimassespektrometri.På dagen for LCMS-analysen forberedes 100 milliliter 5%acetonitril, der indeholder 200 nanogram pr. milliliter leucin enkephalin. Der tilsættes 950 mikroliter af denne opløsning til glashætteglasset, der indeholder kornekstraktets 50 mikroliter aliquot. Bland indholdet i hætteglasset ved at hvirvle.Først skal du oprette en kalibrere instrumenterne som beskrevet i manuskriptet og producentens brugervejledning. Dernæst rense og skylle LC fluidics systemet ved hjælp af LCMS grade opløsningsmidler, herunder mobile fase og vaske opløsningsmidler. Lc-systemet skal fordeles ved hjælp af startbetingelserne for LC-metoden, hvilket sikrer, at kolonnetrykket er stabiliseret.Konfigurer instrumentsekvenstabellen. Indsprøjt natriumformat i begyndelsen af prøvesekvensen for at kontrollere instrumentkalibreringen. Analysér opløsningsmiddel og præparative emner først, efterfulgt af poolede kvalitetskontrolprøver til systemkonditionering, og derefter den randomiserede prøveliste.Kør kvalitetskontrolprøver med jævne mellemrum, som tekniske replikater. Kør to kvalitetskontrolprøver i slutningen af sekvensen. Mens sekvensen kører, skal du kontrollere datakvaliteten, herunder både den interne standardmassenøjagtighed og signalgentageligheden.For at kontrollere signal reproducerbarhed, bør besigtigelse af overlejret spektre være tilstrækkeligt. Fire interne standarder blev inkluderet i den opløsning, der blev anvendt til fremstilling af kornekstrakterne. Under LCMS blev der observeret god massenøjagtighed og enkelt reproducerbarhed af interne standarder for både positive og negative ioniseringstilstande.Baseret på analyse af emner, 421 signaler i den negative tilstand og 835 signaler i den positive tilstand blev anset for at være artefakter. Disse signaler var til stede i emner ved intensiteter svarende til eller større end 5% af den gennemsnitlige enkeltintensitet i kornprøver. Efter fjernelse af artefakter og yderligere filtrering af data, den negative tilstand returnerede 483 funktioner og den positive tilstand returnerede 523 funktioner.Ca. 250 funktioner var biologisk relevante og varierede signifikant i intensitet på tværs af hvedesorter. Kvalitetskontrolforanstaltningerne, såsom medtagelse af præparative emner, interne standarder og samleprøver, er vigtige at huske i denne protokol.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

En Tandem væskekromatografi-massespektrometri-baseret tilgang til Metabolit Analyse af<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyb proteomet profilering af Isobar mærkning, omfattende væskekromatografi, massespektrometri og Software-assisteret kvantificering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolut kvantificering af celle frit protein syntese metabolisme ved omvendt fase-væskekromatografi-massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Opnåelse af udskriftsdata af høj kvalitet fra kornfrø ved en modificeret metode til genekspressionsprofilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semikvantitativ analyse af peptidoglycan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

En massespektrometribaseret proteomics-tilgang til global R-methyleringsanalyse med høj konfidensprotein

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilering flygtige forbindelser i solbærfrugt ved hjælp af Headspace Solid-Phase Microextraction Koblet til Gaskromatografi-Mass Spektrometri

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...