Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Les auteurs aimeraient souligner le programme de bourses d’études sur l’agriculture et l’alimentation du premier ministre de l’Australie-Occidentale (Ministère de l’emploi, du tourisme, des sciences et de l’innovation, gouvernement de l’Australie-Occidentale) et du premier ministre, le professeur Simon Cook (Centre for Digital Agriculture, Curtin University et Murdoch University). Les essais sur le terrain et la collecte d’échantillons de céréales ont été appuyés par le programme Royalties for Regions du gouvernement de l’Australie-Occidentale. Nous remercions Grantley Stainer et Robert Français pour leur contribution aux essais sur le terrain. Bioplatforms Australia, financé par le NCRIS, est reconnu pour le financement de l’équipement.

Cette méthode est appropriée pour 30 échantillons (environ 150 graines par échantillon). Trois répliques biologiques de dix variétés de blé cultivées sur le terrain ont été utilisées ici.
1. Préparation des grains
<ol><li>Récupérez des échantillons (grains entiers) dans un stockage de -80 oC. REMARQUE : Le séchage du gel des graines est recommandé peu de temps après la récolte si des échantillons sont prélevés sur plusieurs saisons. Cela minimise tout changement dan...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

Ici, nous présentons une méthode de métabolomique non ciblée basée sur le LC-MS pour l’analyse du grain de blé. La méthode combine quatre modes d’acquisition (phase inversée et phase inversée lipidique avec ionisation positive et négative) en deux modes en introduisant une troisième phase mobile dans le gradient de phase inversée. L’approche combinée a produit environ 500 caractéristiques biologiquement pertinentes par polarité ion, dont environ la moitié d’intensité significativement différente...

Comprendre les interactions entre les gènes, l’environnement et les pratiques de gestion dans l’agriculture pourrait permettre une prévision et une gestion plus précises du rendement et de la qualité des produits. Les métabolites végétaux sont influencés par des facteurs tels que le génome, l’environnement (climat, précipitations, etc.) et dans un contexte agricole, la façon dont les cultures sont gérées (c.-à-d. l’épandage d’engrais, les fongicides, etc.). Contrairement au génome, le métabolome est influencé par tous ces facteurs et donc les données métabololomics fournit une empreinte biochimique de ces interactions à un moment donné. Il y a habituellement l’un des deux objectifs d’une étude basée sur la métabolomique : premièrement, pour parvenir à une compréhension plus profonde de la biochimie de l’organisme et aider à expliquer le mécanisme de réponse à la perturbation (stress abiotique ou biotique) par rapport à la physiologie; et deuxièmement, associer les biomarqueurs à la perturbation à l’étude. Dans les deux cas, le résultat de cette connaissance est une stratégie de gestion plus précise pour atteindre l’objectif d’améliorer la taille et la qualité des rendements.
Le métabolome végétal devrait contenir des milliersde petites molécules aux propriétés physicochimiques variées. À l’heure actuelle, aucune plateforme de métabololomie (principalement la spectrométrie de masse et la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire) ne peut capturer le métabolome entier en une seule analyse. Le développement de ces techniques (préparation d’échantillons, extraction et analyse de métabolites), qui fournissent une couverture aussi importante que possible du métabolome au sein d’une seule série analytique, est un objectif clé pour les chercheurs en métaabolomique. Les analyses médabolomics non ciblées antérieures du grain de blé ont combiné les données de multiples séparations chromatographiques et les polarités d’acquisition et/ou l’instrumentation pour une plus grande couverture métabolome. Toutefois, cela a exigé que les échantillons soient préparés et acquis séparément pour chaque modalité. Par exemple, Beleggia et coll.2 ont préparé un échantillon dérivatisé pour l’analyse GC-MS des analytes polaires en plus de l’analyse GC-MS des analytes nonpolaires. Das et coll.3 ont utilisé des méthodes GC- et LC-MS pour améliorer la couverture dans leurs analyses; toutefois, cette approche nécessiterait généralement des préparations d’échantillons distinctes telles que décrites ci-dessus ainsi que deux plates-formes d’analyse indépendantes. Les analyses antérieures des céréales de blé à l’aide de GC-MS2,3,4 et LC-MS3,5 plates-formes ont donné 50 à 412 (55 identifiés) caractéristiques pour GC-MS, 409 pour les plates-formes combinées GC-MS et LC-MS et plusieurs milliers pour une analyse lipidomicique LC-MS5. En combinant au moins deux modes en une seule analyse, une couverture métabolome étendue peut être maintenue, augmentant la richesse de l’interprétation biologique tout en offrant des économies dans le temps et le coût.
Pour permettre la séparation efficace d’un large éventail d’espèces lipidiques par chromatographie de phase inversée, les méthodologies lipidiques modernes utilisent généralement une forte proportion d’isopropanol dans le solvant d’elution6, fournissant une commodité aux classes lipidiques qui pourraient autrement ne pas être résolues par la chromatographie. Pour une séparation efficace des lipides, la phase mobile de départ est également beaucoup plus élevée dans la composition organique7 que les méthodes chromatographiques de phase inversée typiques, qui considèrent d’autres classes de molécules. La composition organique élevée au début du gradient rend ces méthodes moins adaptées à de nombreuses autres classes de molécules. Plus particulièrement, la chromatographie liquide de phase inversée emploie un gradient de solvant binaire, commençant par une composition principalement aqueuse et augmentant dans la teneur organique pendant que la force d’elution de la chromatographie est augmentée. À cette fin, nous avons cherché à combiner les deux approches pour parvenir à la séparation des classes de lipides et non-lipidiques des métabolites au sein d’une seule analyse.
Ici, nous présentons une méthode chromatographique qui utilise une troisième phase mobile et permet une phase inversée traditionnelle combinée et une méthode de chromatographie lipidique appropriée à l’aide d’une seule préparation d’échantillon et d’une colonne analytique. Nous avons adopté bon nombre des mesures de contrôle de la qualité et des étapes de filtrage des données qui ont déjà été mises en œuvre dans des études méabolomics principalement cliniques. Ces approches sont utiles pour déterminer les caractéristiques robustes avec une recrétabilité technique élevée et la pertinence biologique et exclut celles qui ne répondent pas à ces critères. Par exemple, nous décrivons l’analyse répétée de l’échantillon8, qc correction9,données filtrant9,10 et l’imputation des entités manquantes11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

Comprendre les interactions entre les gènes, l’environnement et la gestion dans la pratique agricole pourrait permettre une prévision et une gestion plus précises du rendement et de la qualité des produits. Les données sur la métabolomique fournissent une lecture de ces interactions à un moment donné et sont informatives sur le statut biochimique d’un organisme. En outre, les métabolites individuels ou des panneaux de métabolites peuvent être utilisés comme biomarqueurs précis pour la prévision et la gestion des rendements et de la qualité. Le métabolome végétal devrait contenir des milliers de petites molécules aux propriétés physicochimiques variées qui offrent une occasion de perspicacité biochimique sur les traits physiologiques et la découverte de biomarqueurs. Pour exploiter cela, l’un des principaux objectifs des chercheurs en métabolomique est de saisir autant de diversité physicochimique que possible au sein d’une seule analyse. Nous présentons ici une méthode de métabolomique non ciblée basée sur la chromatographie liquide-masse pour l’analyse du grain de blé cultivé sur le terrain. La méthode utilise le gestionnaire de solvant quaternary chromatographique liquide pour introduire une troisième phase mobile et combine un gradient traditionnel de phase inversée avec un gradient de lipide-amenable. La préparation des grains, l’extraction de métabolites, l’analyse instrumentale et les flux de travail de traitement des données sont décrits en détail. Une bonne précision de masse et la reproductibilité du signal ont été observées, et la méthode a donné environ 500 dispositifs biologiquement pertinents par mode d’ionisation. En outre, des signaux de fonction méabolite et lipidique significativement différents entre les variétés de blé ont été déterminés.

Le métabolome végétal est influencé par une combinaison de son génome et de son environnement, et en plus dans un contexte agricole, le régime de gestion des cultures. Nous démontrons que les différences génétiques entre les variétés de blé peuvent être observées au niveau des métabolites, ici, avec plus de 500 composés mesurés montrant des concentrations significativement différentes entre les variétés dans le seul grain. Une bonne précision de masse (erreur de 10 p...

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Une méthode pour l’analyse non ciblée des métabolites et des lipides de grain de blé est présentée. Le protocole comprend une méthode d’extraction de métabolites en acétonitrile et une méthodologie de spectrométrie de chromatographie-masse liquide inversée, avec acquisition dans des modes d’ionisation électrospray positive et négative.

Chromatographie liquide non ciblée-Analyse métabolomique basée sur la spectrométrie de masse du grain de blé

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Le métabolite est influencé par des facteurs tels que l’environnement génomique et les pratiques de gestion. La compréhension des interactions entre ces facteurs pourrait permettre une prédiction et une gestion plus précises du rendement et de la qualité d’un produit. En incorporant une troisième phase mobile, plutôt que les deux traditionnelles, cette technique permet la séparation et la détection d’un plus large éventail de métabolites.La métabolomique pourrait être appliquée à n’importe quel domaine de la biologie. Tout d’abord, pour parvenir à une compréhension plus profonde de la biochimie d’un organisme, et aider à expliquer leur réponse au stress abiotique ou biotique par rapport à la physiologie. Deuxièmement, associer les biomarqueurs à la perturbation à l’étude.Comme l’alcool isopropylique est un solvant visqueux, il doit être introduit à faible taux de poussée, et suffisamment de temps d’équilibrage utilisé avant d’augmenter la composition à 98%Ces étapes empêcheront le système graphique chromatique de sur-pression, de retourner une erreur, ou potentiellement endommager la colonne analytique. Pour commencer la préparation des grains, utilisez un mélangeur de laboratoire pour moudre le grain. Faire fonctionner le mélangeur à grande vitesse pendant 20 secondes, puis répéter.Retirer le pot du mélangeur de la base. Appuyez sur le côté du pot du mélangeur pour amener tout grain grossièrement moulu à la surface de l’échantillon. Le grain grossièrement moulu peut être jeté ou entreposé.Transférer le grain finement moulu du mélangeur dans un tube de micro centrifugeuse en plastique de deux millilitres. Le même jour que l’extraction, préparer le solvant d’extraction, tel que décrit dans le manuscrit. Ensuite, pesez 200 milligrammes de grain finement moulu dans un tube de micro centrifugeuse de deux millilitres.Ajouter 500 microlitres de solvant d’extraction au grain dans le tube. En outre, préparer un blanc en ajoutant 500 microlitres de solvant d’extraction à un tube vide. À l’aide d’un homogénéiseur, réglé à 6 500 RPM, mélanger le solvant et le grain pendant 20 secondes.Ensuite, répétez encore 20 secondes. Ensuite, centrifugez le tube à quatre degrés Celsius et 16 100 fois G, pendant cinq minutes. Transférer le supernatant dans un tube en plastique de deux millilitres et conserver la pastille.Répétez le processus d’extraction sur la pastille deux fois. Mélanger les trois supernatants, en donnant un volume total d’extrait d’environ 1,5 millilitres et mélanger par vortex. Pour faire un échantillon mis en commun de tous les extraits de grain à utiliser pour le contrôle de la qualité, transférez 55 microlitres de chaque extrait de grain dans un tube et un vortex de deux millilitres.Ensuite, transférez 50 aliquots microlitres de cet échantillon mis en commun en flacons de verre. Transférer un aliquot de 50 microlitres de chaque extrait d’échantillon de grain sur des flacons de verre. Tel que décrit dans le manuscrit écrit, préparez les solutions qui seront nécessaires pour la spectrométrie de masse chromatographie liquide.Le jour de l’analyse LCMS, préparez 100 millilitres d’acétylonitrile à 5 %, contenant 200 nanogrammes par millilitre de leucine enkephalin. Ajouter 950 microlitres de cette solution au flacon de verre contenant les 50 microlitres aliquot de l’extrait de grain. Mélanger le contenu dans le flacon par vortex.Tout d’abord, mettre en place un étalonnage des instruments tel que décrit dans le manuscrit et le guide de l’utilisateur du fabricant. Ensuite, purgez et rincez le système de fluidité LC à l’aide de solvants de qualité LCMS, y compris la phase mobile et les solvants de lavage. Equilibrer le système LC en utilisant les conditions de démarrage de la méthode LC, en s’assurant que la pression de la colonne s’est stabilisée.Configurer la table de séquence de l’instrument. Injecter du format sodium au début de la séquence de l’échantillon pour vérifier l’étalonnage de l’instrument. Analyser d’abord les blancs solvants et préparateurs, puis les échantillons de contrôle de la qualité mis en commun pour le conditionnement du système, puis la liste des échantillons randomisés.Exécutez des échantillons de contrôle de la qualité à intervalles réguliers, sous forme de répliques techniques. Exécutez deux échantillons de contrôle de la qualité à la fin de la séquence. Pendant que la séquence est en cours d’exécution, vérifiez la qualité des données, y compris la précision de masse standard interne et la reproductibilité du signal.Pour vérifier la reproductibilité du signal, l’inspection visuelle des spectres superposés devrait suffire. Quatre normes internes ont été incluses dans la solution utilisée pour préparer les extraits de grain. Au cours du LCMS, une bonne précision de masse et une reproduction unique des normes internes ont été observées pour les modes d’ionisation positifs et négatifs.D’après l’analyse des blancs, 421 signaux en mode négatif et 835 signaux en mode positif ont été jugés être des artefacts. Ces signaux étaient présents dans les blancs à des intensités égales ou supérieures à 5 % de l’intensité unique moyenne des échantillons de grains. Après la suppression des artefacts et le filtrage supplémentaire des données, le mode négatif a retourné 483 fonctionnalités et le mode positif a retourné 523 fonctionnalités.Environ 250 caractéristiques étaient biologiquement pertinentes et différaient considérablement en intensité entre les variétés de blé. Les mesures de contrôle de la qualité, telles que l’inclusion de blancs préparateurs, de normes internes et d’échantillons mis en commun, sont importantes à retenir dans ce protocole.

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Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Obtenir des données transcriptome de haute qualité à partir de graines de céréales par une méthode modifiée pour le profilage de l’expression génique

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Analyse quantitative du lipidome cellulaire de Saccharomyces Cerevisiae à l’aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Analyse semi-quantitative du peptidoglycane par chromatographie liquide Spectrométrie de masse et bioinformatique

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Métabolomique quantitative de Saccharomyces Cerevisiae par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Une approche protéomique basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse globale et à haut niveau de confiance de la R-méthylation des protéines

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilage des composés volatils dans les fruits de cassis à l’aide de la microextraction en phase solide de l’espace de tête couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...