Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
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Die Autoren möchten das Landwirtschafts- und Ernährungsstipendium des West australian Premier (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) und den Premier es Fellow, Professor Simon Cook (Centre for Digitale Landwirtschaft, Curtin University und Murdoch University). Feldversuche und Getreideprobenentnahme wurden von der Regierung des Programms Royalties for Regions in Westaustralien unterstützt. Wir würdigen Grantley Stainer und Robert French für ihre Beiträge zu Feldversuchen. Die von NCRIS finanzierten Bioplattformen Australien sind für die Finanzierung von Ausrüstungen anerkannt.

Diese Methode eignet sich für 30 Proben (ca. 150 Samen pro Probe). Hier wurden drei biologische Nachbildungen von zehn verschiedenen Weizensorten verwendet.
1. Herstellung von Körnern
<ol><li>Abrufen von Proben (Ganze Körner) aus -80 °C Lagerung. HINWEIS: Die Gefriertrocknung von Samen wird kurz nach der Ernte empfohlen, wenn Proben aus mehreren Jahreszeiten entnommen werden. Dadurch werden Änderungen der Metabolitenkonzentration minimiert, die nach unterschiedlichen Lagerzeiten auft...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

Hier stellen wir eine LC-MS-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Weizengetreide vor. Die Methode kombiniert vier Erfassungsmodi (umgekehrte Phase und lipid-amenable reversed phase mit positiver und negativer Ionisation) in zwei Modi, indem eine dritte mobile Phase in den umgekehrten Phasenverlauf eingeführt wird. Der kombinierte Ansatz ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionenpolarität, wobei etwa die Hälfte dieser signifikant unterschiedlichen Intensitäten zwischen Weizensorten aufwei...

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, Umwelt und Managementpraktiken in der Landwirtschaft könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Pflanzenmetaboliten werden durch Faktoren wie Genom, Umwelt (Klima, Niederschlag usw.) und in einer landwirtschaftlichen Umgebung beeinflusst, wie Pflanzen bewirtschaftet werden (d. h. Die Anwendung von Düngemitteln, Fungizid usw.). Im Gegensatz zum Genom wird das Metabolom durch all diese Faktoren beeinflusst und daher liefern Metabolomik-Daten einen biochemischen Fingerabdruck dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt. Es gibt in der Regel eines von zwei Zielen für eine Metabolomik-basierte Studie: erstens, um ein tieferes Verständnis der Biochemie des Organismus zu erreichen und helfen, den Mechanismus der Reaktion auf Störungen (abiotischen oder biotischen Stress) in Bezug auf die Physiologie zu erklären; und zweitens, Biomarker mit der untersuchten Störung in Verbindung zu bringen. In beiden Fällen ist das Ergebnis dieses Wissens eine präzisere Managementstrategie, um das Ziel einer verbesserten Ertragsgröße und -qualität zu erreichen.
Das Pflanzenmetabolom wird voraussichtlich Tausende von1 kleinen Molekülen mit verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten. Derzeit können keine Metabolomik-Plattformen (vorwiegend Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie) das gesamte Metabolom in einer einzigen Analyse erfassen. Die Entwicklung solcher Techniken (Probenvorbereitung, Metabolitenextraktion und -analyse), die eine möglichst große Abdeckung des Metaboloms innerhalb eines einzigen analytischen Laufs bieten, ist ein zentrales Ziel für Forscher der Metabolomik. Frühere ungezielte Metabolomik-Analysen von Weizengetreide haben Daten aus mehreren chromatographischen Trennungen und Erfassungspolaritäten und/oder Instrumenten für eine größere Metabolomabdeckung kombiniert. Dies erforderte jedoch, dass Proben für jede Modalität einzeln vorbereitet und erworben wurden. So erstellten Beleggia et al.2. 2 zusätzlich zur GC-MS-Analyse der unpolaren Analyten eine derivatisierte Probe für die GC-MS-Analyse von Polaranalyten. Das et al.3 verwendete sowohl GC- als auch LC-MS-Methoden, um die Abdeckung in ihren Analysen zu verbessern; Dieser Ansatz würde jedoch in der Regel getrennte Probenvorbereitungen wie oben beschrieben sowie zwei unabhängige Analyseplattformen erfordern. Frühere Analysen von Weizengetreide mit GC-MS2,3,4 und LC-MS3,5 Plattformen haben 50 bis 412 (55 identifizierte) Funktionen für GC-MS, 409 für kombinierte GC-MS und LC-MS und mehrere tausend für eine LC-MS Lipidomik-Analyse5ergeben. Durch die Kombination von mindestens zwei Modi in einer einzigen Analyse kann eine erweiterte Metabolomabdeckung aufrechterhalten werden, wodurch der Reichtum der biologischen Interpretation erhöht wird und gleichzeitig Zeit- und Kosteneinsparungen erzielt werden.
Um eine effiziente Trennung einer Vielzahl von Lipidarten durch umgekehrte Phasenchromatographie zu ermöglichen, verwenden moderne Lipidomik-Methoden häufig einen hohen Anteil an Isopropanol im Elutionslösungsmittel6, um Lipidklassen, die sonst durch die Chromatographie ungelöst sein könnten, eine Aenbarkeit zu bieten. Für eine effiziente Lipidtrennung ist die startende mobile Phase auch in der organischen Zusammensetzung7 viel höher als die typischen chromatographischen Methoden der umgekehrten Phase, die andere Klassen von Molekülen berücksichtigen. Die hohe organische Zusammensetzung zu Beginn des Gradienten macht diese Methoden weniger geeignet für viele andere Klassen von Molekülen. Vor allem die umgekehrte Phasenflüssigkeitschromatographie verwendet einen binären Lösungsmittelgradienten, beginnend mit einer meist wässrigen Zusammensetzung und einer Erhöhung des organischen Gehalts, da die Elutionsfestigkeit der Chromatographie erhöht wird. Zu diesem Zweck haben wir versucht, die beiden Ansätze zu kombinieren, um die Trennung von Lipid- und Nicht-Lipid-Klassen von Metaboliten in einer einzigen Analyse zu erreichen.
Hier stellen wir eine chromatographische Methode vor, die eine dritte mobile Phase verwendet und eine kombinierte traditionelle umgekehrte Phase und lipidomics-geeignete Chromatographiemethode mit einer einzigen Probenvorbereitung und einer analytischen Spalte ermöglicht. Wir haben viele der Qualitätskontrollmaßnahmen und Datenfilterschritte übernommen, die bisher in überwiegend klinischen Metabolomik-Studien umgesetzt wurden. Diese Ansätze sind nützlich, um robuste Merkmale mit hoher technischer Reproduzierbarkeit und biologischer Relevanz zu bestimmen, und schließen diejenigen aus, die diese Kriterien nicht erfüllen. Zum Beispiel beschreiben wir die Wiederholungsanalyse der gepoolten QC-Probe8, QC-Korrektur9, Datenfilterung9,10 und Imputation fehlender Features11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Genen, der Umwelt und dem Management in der landwirtschaftlichen Praxis könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung von Produktertrag und -qualität ermöglichen. Metabolomics-Daten liefern ein Auslesen dieser Wechselwirkungen zu einem bestimmten Zeitpunkt und sind informativ über den biochemischen Status eines Organismus. Darüber hinaus können einzelne Metaboliten oder Metaboliten-Panels als präzise Biomarker für ertrags- und Qualitätsvorhersage und -management verwendet werden. Das pflanzliche Metabolom wird voraussichtlich Tausende von kleinen Molekülen mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften enthalten, die eine Chance für einen biochemischen Einblick in physiologische Eigenschaften und Biomarker-Entdeckung bieten. Um dies zu nutzen, besteht ein zentrales Ziel für Die Forscher der Metabolomik darin, so viel wie möglich von der physikalisch-chemischen Vielfalt in einer einzigen Analyse zu erfassen. Hier stellen wir eine flüssige Chromatographie-Massenspektrometrie-basierte ungezielte Metabolomik-Methode zur Analyse von Feldweizenkorn vor. Das Verfahren nutzt den quaternären Lösungsmittelmanager des Flüssigchromatographen, um eine dritte mobile Phase einzuführen und kombiniert einen traditionellen umgedrehten Phasengradienten mit einem lipidfreundlichen Gradienten. Getreideaufbereitung, Metabolitenextraktion, instrumentelle Analyse und Datenverarbeitungs-Workflows werden ausführlich beschrieben. Es wurden eine gute Massengenauigkeit und Signalreproduzierbarkeit beobachtet, und die Methode ergab etwa 500 biologisch relevante Merkmale pro Ionisationsmodus. Darüber hinaus wurden signifikant unterschiedliche Metaboliten- und Lipid-Feature-Signale zwischen Weizensorten bestimmt.

Das Pflanzenmetabolom wird durch eine Kombination seines Genoms und seiner Umwelt beeinflusst, und zusätzlich in einer landwirtschaftlichen Umgebung, dem Pflanzenmanagementregime. Wir zeigen, dass hier genetische Unterschiede zwischen Weizensorten auf Metabolitenebene beobachtet werden können, wobei über 500 gemessene Verbindungen signifikant unterschiedliche Konzentrationen zwischen den Sorten allein im Getreide aufweisen. Eine gute Massengenauigkeit (<10 ppm-Fehler) und die Signalrep...

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Eine Methode zur ungezielten Analyse von Weizenkornmetaboliten und Lipiden wird vorgestellt. Das Protokoll umfasst eine Acetonit-Metabolit-Extraktionsmethode und eine umgekehrte Phase-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Methodik mit Erfassung in positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodi.

Ungezielte Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierte Metabolomik-Analyse von Weizengetreide

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Der Metabolit wird durch Faktoren wie die Genomumgebung und Managementpraktiken beeinflusst. Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen diesen Faktoren könnte eine genauere Vorhersage und Verwaltung der Ausbeute und Qualität eines Produkts ermöglichen. Durch die Integration einer dritten mobilen Phase anstelle der traditionellen zwei, ermöglicht diese Technik die Trennung und Detektion einer breiteren Palette von Metaboliten.Metabolomik könnte auf jeden Bereich der Biologie angewendet werden. Erstens, um ein tieferes Verständnis der Biochemie eines Organismus zu erreichen und ihre Reaktion auf abiotischen oder biotischen Stress in Bezug auf die Physiologie zu erklären. Zweitens, Biomarker mit der untersuchten Störung in Verbindung zu bringen.Da Isopropylalkohol ein viskoses Lösungsmittel ist, sollte er bei geringer Flare-Rate eingeführt werden, und eine ausreichende Ausgleichszeit vor der Erhöhung der Zusammensetzung auf 98% verwendet werden Diese Schritte verhindern, dass das chromatische Grafiksystem überdruckt, einen Fehler zurückgibt oder möglicherweise die analytische Säule beschädigt. Um mit der Herstellung der Körner zu beginnen, verwenden Sie einen Labormixer, um das Getreide zu mahlen. Führen Sie den Mixer mit hoher Geschwindigkeit für 20 Sekunden und dann wiederholen.Entfernen Sie das Mixerglas von der Basis. Tippen Sie auf die Seite des Mixerglases, um grobe Körner an die Oberfläche der Probe zu bringen. Das grob gemahlene Korn kann entsorgt oder gelagert werden.Übertragen Sie das fein gemahlene Korn aus dem Mixer auf ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr aus Kunststoff. Bereiten Sie am selben Tag wie die Extraktion das Extraktionslösungsmittel vor, wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes wiegen Sie 200 Milligramm fein gemahlenes Korn in ein Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr.Fügen Sie 500 Mikroliter Extraktionslösungsmittel in das Korn in der Röhre hinzu. Bereiten Sie außerdem einen Rohling vor, indem Sie 500 Mikroliter Extraktionslösungsmittel in ein leeres Rohr geben. Mit einem Homogenisator, auf 6 500 RPM eingestellt, mischen Sie das Lösungsmittel und Getreide für 20 Sekunden.Wiederholen Sie dann weitere 20 Sekunden. Dann zentrifugieren Sie das Rohr bei vier Grad Celsius und 16, 100 mal G, für fünf Minuten. Übertragen Sie den Überstand auf ein Zwei-Milliliter-Kunststoffrohr und behalten Sie das Pellet.Wiederholen Sie den Extraktionsprozess auf dem Pellet zweimal. Kombinieren Sie die drei Überstand, ergibt ein Gesamtextraktvolumen von etwa 1,5 Milliliter und mischen durch Wirbel. Um eine gepoolte Probe aller Getreideextrakte zu machen, die für die Qualitätskontrolle verwendet werden sollen, übertragen Sie 55 Mikroliter jedes Getreideextrakts in ein Zwei-Milliliter-Rohr und Einenwirbel.Dann übertragen Sie 50 Mikroliter Aliquots dieser gepoolten Probe auf Glasfläschchen. Übertragen Sie einen 50-Mikroliter-Aliquot jedes Kornprobenextrakts auf Glasfläschchen. Wie im schriftlichen Manuskript beschrieben, bereiten Sie die Lösungen vor, die für die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie benötigt werden.Bereiten Sie am Tag der LCMS-Analyse 100 Milliliter 5%Acetonitril vor, die 200 Nanogramm pro Milliliter Leucin Enkephalin enthalten. Fügen Sie 950 Mikroliter dieser Lösung in die Glasflasche mit dem 50 Mikroliter Aliquot des Kornextrakts hinzu. Mischen Sie den Inhalt in der Durchstechflasche durch Wirbeln.Richten Sie zunächst eine Kalibrierung der Instrumente ein, wie im Manuskript und im Benutzerhandbuch des Herstellers beschrieben. Als nächstes spülen und spülen Sie das LC-Fluidiksystem mit LCMS-Lösungsmitteln, einschließlich mobiler Phasen- und Waschlösungsmittel. Gleichgewichten Sie das LC-System unter Verwendung der Startbedingungen der LC-Methode, um sicherzustellen, dass sich der Säulendruck stabilisiert hat.Richten Sie die Instrumentensequenztabelle ein. Injizieren Sie das Natriumformat am Anfang der Probensequenz, um die Gerätekalibrierung zu überprüfen. Analysieren Sie zuerst Lösungsmittel und präparative Rohlinge, gefolgt von gepoolten Qualitätskontrollproben für die Systemkonditionierung und dann der randomisierten Stichprobenliste.Führen Sie Qualitätskontrollproben in regelmäßigen Abständen aus, da sie technisch repliziert werden. Führen Sie zwei Qualitätskontrollbeispiele am Ende der Sequenz aus. Überprüfen Sie während der Ausführung der Sequenz die Datenqualität, einschließlich der internen Standardmassengenauigkeit und der Signalreproduzierbarkeit.Zur Überprüfung der Signalreproduzierbarkeit sollte eine Sichtprüfung von überlagerten Spektren ausreichen. Vier interne Standards wurden in die Lösung aufgenommen, die zur Herstellung der Getreideextrakte verwendet wurde. Während LCMS wurden sowohl für positive als auch für negative Ionisationsmodi eine gute Massengenauigkeit und eine einzige Reproduzierbarkeit interner Standards beobachtet.Basierend auf der Analyse von Rohlingen wurden 421 Signale im negativen Modus und 835 Signale im positiven Modus als Artefakte bewertet. Diese Signale waren in Rohlingen mit Intensitäten vorhanden, die 5 % der durchschnittlichen Einzelintensität in Kornproben entsprachen oder darüber lagen. Nach dem Entfernen der Artefakte und der weiteren Filterung der Daten wurden im negativen Modus 483 Features und der positive Modus 523 Features zurückgegeben.Etwa 250 Merkmale waren biologisch relevant und unterschieden sich signifikant in der Intensität zwischen den Weizensorten. Die Qualitätskontrollmaßnahmen, wie die Aufnahme von präparativen Rohlingen, internen Standards und gepoolten Proben, sind in diesem Protokoll zu beachten.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Ein Tandem-Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-basierter Ansatz zur Analyse von Metabolit<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Forschung

Biochemie

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Tiefen Proteom Profilierung durch isobare Kennzeichnung, umfangreiche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie und softwaregestützte Quantifizierung

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolute Quantifizierung des zellfreien Proteinsynthesestoffwechsels durch Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analyse des Zelllipidoms von Saccharomyces Cerevisiae mit Flüssigchromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilierung flüchtiger Verbindungen in schwarzen Johannisbeerfrüchten mittels Headspace-Festphasen-Mikroextraktion gekoppelt an Gaschromatographie-Massenspektrometrie

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...