Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר בתוכנית החקלאות ומלגת המזון של מערב אוסטרליה (המחלקה למשרות, תיירות, מדע וחדשנות, ממשלת אוסטרליה המערבית) וברנש של ראש הממשלה, פרופסור סיימון קוק (המרכז ל החקלאות הדיגיטלית, אוניברסיטת קורטין ואוניברסיטת מרדוק). ניסויים שדה ואוסף לדוגמה דגנים תמכו על ידי הממשלה של התוכנית תמלוגים של אוסטרליה מערב האזורים. אנו מכירים בגראנטלי סטיינר ורוברט פרנץ ' בגין תרומתם לניסויי שדה. הביו-טפסים של אוסטרליה. מודה במימון הציוד

שיטה זו מתאימה ל -30 דגימות (כ-150 זרעים לכל מדגם). במקום שימשו כאן שימוש בשלושה משכפל ביולוגי של עשרה סוגי חיטה שונים.
1. הכנת גרגירים
<ol><li>לאחזר דגימות (דגנים מלאים) מ-80 ° c אחסון. הערה: ייבוש זרעים מומלץ זמן קצר לאחר הקטיף אם מדגמים נאספים ממספר עונות. זה ממזער את כל השינויים ברי...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

כאן, אנו מציגים שיטת LC-MS מבוסס טבולומיקס שאינה ממוקדת ניתוח של דגן חיטה. השיטה משלבת ארבעה מצבי רכישה (שלב הפוך ושלב הפוך לשומנים עם אינון חיובי ושלילי) לשני מצבים על ידי החדרת שלב נייד שלישי לתוך הדרגתי שלב היפוך. הגישה המשולבת הניבה כ 500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל קוטביות יון עם כמחצית ?...

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה ונוהלי הניהול בחקלאות עלולים לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. מטבוליטים צמחיים מושפעים גורמים כגון הגנום, הסביבה (אקלים, כמות המשקעים וכו '), ובסביבה החקלאות, הדרך יבולים מנוהלים (כלומר, יישום של דשן, קוטלי פטריות וכו '). בניגוד הגנום, מטאבולזה מושפע כל הגורמים האלה ולכן טבולומיקס נתונים מספק טביעת אצבע ביוכימית של אינטראקציות אלה בזמן מסוים. יש בדרך כלל אחת משתי המטרות למחקר מבוסס טבולומיקס: ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של ביוכימיה של האורגניזם ולעזור להסביר את מנגנון התגובה הפרטורציה (abiotic או לחץ ביוטי) ביחס הפיזיולוגיה; ושנית, לחבר בסמנים עם הפרטורציה תחת לימוד. בשני המקרים, התוצאה של הידע הזה היא אסטרטגית ניהול מדויקת יותר כדי להשיג את המטרה של גודל תשואה משופרת ואיכות.
הצמח בתוך המפעל צפוי להכיל אלפי1 של מולקולות קטנות עם תכונות פיסיוכימיקלים מגוונים. כיום, אין פלטפורמות טבולומיקס (בעיקר ספקטרומטר מסה וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית) יכולים ללכוד את המטה כולו בניתוח אחד. פיתוח טכניקות כאלה (הכנה לדוגמה, הפקת מטבוליזם וניתוח), אשר מספקים כיסוי גדול של מטאמיטין ככל האפשר בתוך הפעלה אנליטית אחת, היא מטרה מרכזית עבור חוקרים טבולומיקס. ניתוח טבולומיקס הקודם לא ממוקד של דגנים חיטה יש נתונים משולבים הפרדות כרומטוגרפיות מרובות ומכשור הרכישה ו/או מיכשור עבור כיסוי מטאמיאלי גדול יותר. עם זאת, יש צורך בדוגמאות שניתן להכין ולרכוש בנפרד עבור כל מודאליות. לדוגמה, Beleggia ואח '2 הכין דוגמה ללעג עבור ניתוח GC-ms של אנליטים קוטביים בנוסף לניתוח GC-ms של האנליטים הלא קוטבי. Das et al.3 בשימוש הן GC-ו-LC-MS שיטות כדי לשפר את הכיסוי בניתוח שלהם; עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל הכנות לדוגמה נפרדת כמתואר לעיל וכן שתי פלטפורמות אנליטיות עצמאיות. ניתוחים קודמים של דגנים חיטה באמצעות GC-ms2,3,4 ו-LC-ms3,5 פלטפורמות הניבו 50 כדי 412 (55 זיהה) תכונות עבור gc-ms, 409 עבור משולב gc-ms ו-LC-ms וכמה אלפי עבור ניתוח LC-ms lipidomics5. על-ידי שילוב לפחות שני מצבים לניתוח אחד, ניתן לשמור על הכיסוי המוארך באופן מתקדם, ולהגדיל את עושרה של פרשנות ביולוגית תוך הנחה גם חיסכון בזמן ובעלות.
כדי לאפשר את ההפרדה היעילה של מגוון רחב של מינים שומנים בדם על ידי כרומטוגרפיה בשלב הפוך, lipidomics המודרנית מתודולוגיות בדרך כלל להשתמש בחלק גבוה של איזופנול ממיסים6, מתן שיעורי השומנים לכיתות שעשויות להיות לא פתורות על ידי הכרומטוגרפיה. עבור הפרדה יעילה השומנים, השלב ההתחלתי הנייד הוא גם הרבה יותר גבוה בהרכב אורגני7 מאשר שיטות היפוך אופייני כרומטוגרפי שלב, אשר לשקול מחלקות אחרות של מולקולות. ההרכב האורגני הגבוה בתחילת מעבר הצבע הופך את השיטות הללו למתאימות פחות למחלקות רבות אחרות של מולקולות. בעיקר, בשלב הפוך כרומטוגרפיה נוזלי מעסיקה מעבר מומס בינארי, החל בהרכב מימית בעיקר והגדלת תוכן אורגני כמו חוזק הכרומטוקציה של הכרומטוגרפיה גדל. לשם כך, ביקשו לשלב את שתי הגישות כדי להשיג הפרדה של שיעורי השומנים וגם לא ליפיד של מטבוליטים בתוך ניתוח אחד.
כאן, אנו מציגים שיטת כרומטוגרפית המשתמשת בשלב הנייד השלישי ומאפשרת שלב היפוך מסורתי משולב וlipidomics-שיטת כרומטוגרפיה מתאימה באמצעות הכנה לדוגמה אחת וטור אנליטי אחד. אימצנו רבות מאמצעי בקרת איכות ושלבי סינון נתונים שיושמו בעבר במחקרים טבולומיקס קליניים בעיקר. גישות אלה שימושיות בקביעת תכונות איתנות עם שימוש ביכולות טכניות גבוהות ורלוונטיות ביולוגית וכוללת את אלה שאינם עומדים בקריטריונים אלה. לדוגמה, אנו מתארים ניתוח חוזר של מדגם qc במאגר8, תיקון QC9, סינון נתונים9,10 והשלכה של תכונות חסרות11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה והניהול בפרקטיקה החקלאית עלולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. הנתונים הטבולומיקס מספקים הקראה מתוך האינטראקציות הללו ברגע נתון והיא אינפורמטיבית של הסטטוס הביוכימי של האורגניזם. עוד, מטבוליטים בודדים או פאנלים של מטבוליטים ניתן להשתמש כמו סמנים מדויקים עבור תשואה וחיזוי איכות וניהול. הצמח מטביו צפוי להכיל אלפי מולקולות קטנות עם תכונות פיזיקליות מגוונות המספקים הזדמנות התובנה הביוכימי לתוך תכונות פיסיולוגיים גילוי ביואריקר. כדי לנצל את זה, מטרת המפתח עבור החוקרים טבולומיקס היא ללכוד כמה שיותר מגוון פיזיקליים ככל האפשר בתוך ניתוח אחד. כאן אנו מציגים שיטה טבולומיקס מבוססת על בסיס כרומטוגרפיה, מבוסס על מטרה בלתי ממוקדת לניתוח דגן חיטה מצמח. השיטה משתמשת במנהל הממס של הנוזל chromatograph הנוזלי כדי להציג שלב נייד שלישי ומשלבת מעבר מסורתי שלב היפוך עם מעבר שומנים בהדרגה. הכנת תבואה, הפקת מטבוליזם, ניתוח אינסטרומנטלי וזרימות עבודה של עיבוד נתונים מתוארות בפרוטרוט. דיוק המוני והאותות הטובים נצפו והשיטה הניבה כ-500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל מצב יינון. יתר על כן, המטלוליט שונים באופן משמעותי ואותות תכונה שומנים בין זני חיטה נקבעו.

המפעל מושפע משילוב של הגנום והסביבה שלה, ובנוסף בסביבה חקלאית, משטר ניהול יבול. אנו מדגימים כי הבדלים גנטיים בין זני חיטה ניתן לצפות ברמת מטבוליט, כאן, עם מעל 500 תרכובות נמדד מראה ריכוזים שונים באופן משמעותי בין זנים בלבד בדגן. דיוק המוני טוב (< 10 דפים לדקה שגיאה) ו האות מובח?...

Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

המטבוליט מושפע מגורמים כגון סביבת הגנום ושיטות הניהול. הבנת האינטראקציות בין גורמים אלה יכולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של התשואה והאיכות של המוצר. על ידי שילוב שלב נייד שלישי, ולא שני המסורתיים, טכניקה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של מגוון רחב יותר של מטבוליטים.מטבולומיים יכולים להיות מיושמים על כל תחום של ביולוגיה. ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של הביוכימיה של האורגניזם, ולעזור להסביר את תגובתם ללחץ אביוטי או ביוטי ביחס לפיזיולוגיה. שנית, כדי לקשר סמנים ביולוגיים עם הפרעה תחת מחקר.כמו אלכוהול isopropyl הוא ממס צמיג, זה צריך להיות הציג בקצב התלקחות נמוך, מספיק זמן שיווי משקל בשימוש לפני הגדלת הרכב ל 98%צעדים אלה ימנעו את המערכת הגרפית כרומטית מלחץ יתר, החזרת שגיאה, או פוטנציאל נזק לעמודה האנליטית. כדי להתחיל בהכנת הדגנים, השתמש בבלנדר מעבדה כדי לטחון את התבואה. הפעל את הבלנדר במהירות גבוהה במשך 20 שניות ולאחר מכן חזור.מוציאים את צנצנת הבלנדר מהבסיס. הקש על הצד של צנצנת הבלנדר כדי להביא כל תבואה טחון גס על פני השטח של המדגם. ניתן להשליך או לאחסן את התבואה הטחנה גסה.מעבירים את התבואה הטחונה מהלבנדר לצינור מיקרו צנטריפוגה מפלסטיק שני מיליליטר. באותו יום כמו החילוץ, להכין את ממס החילוץ, כמתואר בכתב היד. לאחר מכן, לשקול 200 מיליגרם של תבואה הקרקע דק לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שני מיליליטר.מוסיפים 500 מיקרוליטרים של ממס מיצוי לתבואה בצינור. בנוסף, להכין ריק על ידי הוספת 500 microliters של ממס החילוץ לצינור ריק. באמצעות homogenizer, להגדיר ב 6, 500 סל"ד, לערבב את הממס ואת התבואה במשך 20 שניות.לאחר מכן, חזור על הפעולה למשך 20 שניות נוספות. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינור בארבע מעלות צלזיוס ו 16, 100 פעמים G, במשך חמש דקות. מעבירים את העל-טבעי לצינור פלסטיק של שני מיליליטר ושומרים על גלולה.חזור על תהליך החילוץ על גלולה פעמיים. מערבבים את שלושת העל-טבעיים, מניבים נפח תמצית כולל של כ-1.5 מיליליטר ומערבבים על-ידי מערבולת. כדי להפוך מדגם מאגר של כל תמציות התבואה שישמש לבקרת איכות, להעביר 55 microliters של כל תמצית תבואה לצינור שני מיליליטר ומערבולת.לאחר מכן, להעביר 50 aliquots microliter של מדגם זה מאגר בקבוקונים זכוכית. מעבירים אליקוט של 50 מיקרוליטר של כל תמצית דגימת תבואה לבקבוקוני זכוכית. כמתואר בכתב היד הכתוב, הכינו את הפתרונות שיידרשו לספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה נוזלית.ביום הניתוח LCMS, להכין 100 מיליליטר של 5%אצטוניטריל, המכיל 200 ננוגרם לכל מיליליטר לאוצין enkephalin. הוסף 950 microliters של פתרון זה בקבוקון זכוכית המכיל את 50 aliquot microliter של תמצית התבואה. מערבבים את התוכן בבקבוקון על ידי מערבולת.ראשית, להגדיר כיול המכשירים כמתואר בכתב היד ואת מדריך המשתמש של היצרן. לאחר מכן, לטהר ולשטוף את מערכת נוזלי LC באמצעות ממסים כיתה LCMS, כולל פאזה ניידת ממיסים לשטוף. לצייד את מערכת LC באמצעות תנאי ההתחלה של שיטת LC, להבטיח כי לחץ העמודה התייצב.כוונן את טבלת רצף הכלים. הזרק נתרן formate בתחילת רצף הדגימה כדי לבדוק את כיול המכשיר. נתח תחילה ריקים ממסים ומיכונים, ואחריו דגימות בקרת איכות ממונפת עבור מיזוג מערכת ולאחר מכן את רשימת הדגימות האקראיות.הפעל דוגמאות בקרת איכות במרווחי זמן קבועים, כשכפולים טכניים. הפעל שתי דגימות בקרת איכות בסוף הרצף. בזמן שהרצף פועל, בדוק את איכות הנתונים, כולל דיוק המסה הסטנדרטי הפנימי וגם את יכולת השכפול של האות.כדי לבדוק את שכפול האות, בדיקה חזותית של ספקטרום מכוסה אמורה להספיק. ארבעה תקנים פנימיים נכללו בתסכה המשמשת להכנת תמציות התבואה. במהלך LCMS, דיוק מסה טוב ושחזור יחיד של תקנים פנימיים נצפו עבור מצבי יינון חיוביים ושליליים.בהתבסס על ניתוח של כדורי סרק, 421 אותות במצב שלילי ו 835 אותות במצב חיובי נשפטו להיות חפצים. אותות אלה היו נוכחים ריקים בעוצמות השוות או יותר מ-5% מהעוצמה הבודדת הממוצעת בדגימות תבואה. לאחר הסרת הממצאים וסינון נוסף של הנתונים, המצב השלילי החזיר 483 תכונות וה במצב החיובי החזיר 523 תכונות.כ-250 מאפיינים היו רלוונטיים מבחינה ביולוגית ושונים משמעותית בעוצמתם בין זני החיטה. אמצעי בקרת האיכות, כגון הכללת ריקים מוכנים, תקנים פנימיים ודגימות מאגר, חשוב לזכור בפרוטוקול זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

קוונפיקציה מוחלטת של מטבוליזם החלבון ללא שימוש בפרוטאין על-ידי היפוך-שלב נוזלי כרומטוגרפיה המסה-ספקטרומטריה

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

קבלת נתונים באיכות גבוהה טראנסקריפט מזרעי דגנים על ידי שיטה שהשתנתה ליצירת פרופיל ביטוי גנים

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

יצירת פרופילים של תרכובות נדיפות בפרי דומדמניות שחורות באמצעות מיקרו-קסטרה של שלב מוצק Headspace בשילוב ספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה-מסה

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...