Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

著者らは、西オーストラリア州首相の農業・食糧フェローシップ・プログラム(西オーストラリア州政府の雇用・観光・科学・イノベーション省)とサイモン・クック教授(センター)を認めたい。デジタル農業、カーティン大学、マードック大学)。フィールドトライアルと穀物サンプルコレクションは、西オーストラリア州の地域ロイヤリティプログラムの政府によって支援されました。グラントリー・ステイナーとロバート・フレンチがフィールドトライアルに貢献したのを認めます。NCRISが出資するバイオプラットフォームオーストラリアは、機器の資金調達で認められています。

この方法は、30サンプル(サンプルあたり約150シード)に適しています。ここでは、10種類の畑で栽培された小麦品種の3つの生物学的複製が使用されました。
1. 穀物の調製
<ol><li>サンプル(全粒粉)を-80°Cの貯蔵から取り出す。 注:サンプルが複数の季節から収集されている場合は、収穫後すぐに種子の凍結乾燥をお勧めします。これは、保存期間の変化の後に発生する代?...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

ここでは、小麦の分析のためのLC-MSベースの非標的メタボロミクス法を紹介する。この方法は、逆相勾配に第3移動相を導入することにより、4つの取得モード(逆相および脂質アメ有効逆相と正イオン化と正負イオン化を伴う)を2つのモードに組み合わせたものです。組み合わせアプローチは、イオン極性あたり約500の生物学的関連特徴を生み出し、その約半分は小麦品種間の強度が有意に異な...

農業における遺伝子、環境、管理慣行の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。植物代謝物は、ゲノム、環境(気候、降雨など)などの要因の影響を受け、農業環境では作物の管理方法(肥料の適用、殺菌剤など)が影響を受けます。ゲノムとは異なり、メタボロームはこれらの要因の影響を受けるため、メタボロミクスデータは特定の時点でこれらの相互作用の生化学的指紋を提供する。メタボロミクスベースの研究には通常、生物の生化学の深い理解を達成し、生理学に関連して摂動(非生物的または生物的ストレス)への応答メカニズムを説明するのを助けるという2つの目標のうちの1つがあります。そして第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。どちらの場合も、この知識を持つことの結果は、歩留まりのサイズと品質を向上させるという目標を達成するためのより正確な管理戦略です。
植物のメタボロムは、様々な物理化学的特性を有する数千1個の小分子を含むと予測されている。現在、メタボロミクスプラットフォーム(主に質量分析と核磁気共鳴分光法)は、単一の分析でメタボローム全体を捕捉することはできません。メタボロミクス研究者にとって、メタボロムの可能な範囲を可能な限り多く提供するこのような技術(サンプル調製、代謝産物抽出および分析)の開発は、メタボロミクス研究者にとって重要な目的です。小麦粒の以前のターゲットを持っていないメタボロミクス分析は、複数のクロマトグラフィー分離と取得極性および/またはインストゥルメンテーションからのデータを組み合わせて、より大きなメタボロームカバレッジを実現しました。しかし、これは、各モダリティのために別々に調製し、取得するサンプルを必要としました。例えば、ベレグギアら2は、非極性分析体のGC-MS分析に加えて、極性分析体のGC-MS分析のための誘導体化サンプルを調製した。Dasら 3は、分析のカバレッジを改善するために GC-と LC-MS の両方の方法を使用しました;ただし、この方法では、一般に、上記のサンプル準備と 2 つの独立した分析プラットフォームが必要になります。GC-MS5 2、3、43および4LC-MS3を用いた小麦穀物の以前の分析は、GC-MSの50〜412(同定された55)機能、GC-MSおよびLC-MSを組み合わせた409、LC-MS脂質分析5のための数千の機能をもたらした。2少なくとも2つのモードを1つの分析に組み合わせることで、拡張されたメタボロームカバレッジを維持することができ、生物学的解釈の豊かさを高める一方で、時間とコストの両方で節約を提供します。
逆相クロマトグラフィーによる広範な脂質種の効率的な分離を可能にするために、現代のリピドミクス方法論は、溶出溶媒6中のイソプロパノールの高い割合を一般的に使用し、クロマトグラフィーによって解決されない可能性のある脂質クラスに無変性を提供する。効率的な脂質分離のために、開始移動相はまた、分子の他のクラスを考慮する典型的な逆相クロマトグラフィー法よりも有機組成物7においてはるかに高い。勾配の開始時の高い有機組成物は、これらの方法を分子の他の多くのクラスにあまり適さない。最も顕著なのは、逆相液体クロマトグラフィーは、二分溶媒勾配を採用し、クロマトグラフィーの溶出強度が増加するにつれて、ほとんど水性組成から始まり、有機含有量が増加する。この目的のために、我々は、単一の分析内で代謝産物の脂質と非脂質クラスの両方の分離を達成するために、2つのアプローチを組み合わせることを目指した。
ここでは、第3移動相を用いたクロマトグラフィー法を紹介し、単一サンプル調製物と1つの分析カラムを用いた従来の逆転相とリピドミクスに適したクロマトグラフィー法を組み合わせることを可能にする。我々は、これまで主に臨床メタボロミクス研究で実施された品質管理措置およびデータフィルタリングステップの多くを採用してきました。これらのアプローチは、高い技術的再現性と生物学的関連性を持つ堅牢な特徴を決定するのに有用であり、これらの基準を満たしていないものを除外します。例えば、我々は、プールされたQCサンプル8、QC補正9、データフィルタリング9、10の10反復分析と欠損特徴11の偽装について説明する。9

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

遺伝子間の相互作用、農業における環境と管理を理解することで、製品収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。メタボロミクスデータは、特定の時点でこれらの相互作用の読み取りを提供し、生物の生化学的状態を有益にします。さらに、個々の代謝産物または代謝産物のパネルは、収量および品質予測および管理のための正確なバイオマーカーとして使用することができる。植物のメタボロムは、生理学的特徴とバイオマーカー発見に生化学的洞察の機会を提供する様々な物理化学的特性を有する何千もの小分子を含むことが予測される。これを利用するために、メタボロミクス研究者にとって重要な目的は、単一の分析で可能な限り多くの物理化学的多様性を捉えるためです。ここでは、フィールド成長小麦の分析のための液体クロマトグラフィー質量分析ベースの未標的メタボロミクス法を提示する。この方法は、液体クロマトグラフ四級溶媒マネージャーを使用して第3移動相を導入し、従来の逆相勾配と脂質を受け入れ可能な勾配と組み合わせたものです。穀物調製、代謝物抽出、器械分析およびデータ処理ワークフローについて詳細に説明する。質量精度と信号再現性が良好で、この方法はイオン化モードごとに約500の生物学的関連特徴を生み出した。また、小麦品種間の代謝産物および脂質特徴シグナルが有意に異なって決定された。

植物のメタボロメは、そのゲノムと環境の組み合わせ、さらに農業環境、作物管理体制の影響を受けます。我々は、小麦品種間の遺伝的差異が代謝産物レベルで観察され得、ここでは、500以上の測定化合物が穀物単独の品種間で有意に異なる濃度を示すことを実証する。良好な質量精度(<10 ppm誤差)および内部標準の信号再現性(<20%RSD)は、Figure 2?...

Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

小麦粒代謝物および脂質の非標的分析法を紹介する。このプロトコルは、アセトニトリル代謝産物抽出法と逆相液体クロマトグラフィー質量分析法法を含み、正および負のエレクトロスプレーイオン化モードでの取得を伴う。

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

代謝産物は、ゲノム環境や管理手法などの要因の影響を受けます。これらの要因間の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。従来の2つではなく第3の移動相を組み込むことによって、この技術はより広い範囲の代謝産物の分離および検出を可能にする。メタボロミクスは、生物学の任意の領域に適用することができます。まず、生物の生化学の理解を深め、生理学に関連して、生物的または生物的ストレスに対するそれらの反応を説明するのを助ける。第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。イソプロピルアルコールは粘性溶媒であるため、低フレア速度で導入する必要があり、組成を98%に増やす前に十分な平衡時間を使用すると、クロマチックグラフィックシステムが過加圧したり、誤差を返したり、分析カラムを損傷したりする可能性があります。穀物の調製を開始するには、実験室用ブレンダーを使用して穀物を粉砕します。ブレンダーを高速で20秒間実行してから、繰り返します。ベースからブレンダージャーを取り外します。ブレンダージャーの側面をタップして、粗く粉砕した粒をサンプルの表面に持ち込みます。粗粉砕粒は廃棄するか、保存することができます。ブレンダーから細かく粉砕された穀物を2ミリリットルのプラスチックマイクロ遠心管に移します。抽出と同じ日に、原稿に記載されているように抽出溶媒を調製する。次に、200ミリグラムの細挽き穀物を2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に計量する。チューブ内の穀物に500マイクロリットルの抽出溶媒を加えます。さらに、空のチューブに500マイクロリットルの抽出溶媒を加えてブランクを作製します。ホモジナイザーを使用し、6,500RPMにセットし、溶媒と穀物を20秒間混合する。その後、さらに 20 秒間繰り返します。その後、チューブを摂氏4度、16倍、100倍Gで5分間遠心分離する。上清を2ミリリットルのプラスチックチューブに移し、ペレットを保持します。ペレットの抽出プロセスを2回繰り返します。3つの上清を組み合わせ、約1.5ミリリットルの総抽出量を生成し、渦によって混合する。品質管理に使用するすべての穀物抽出物のプールサンプルを作るために、各穀物抽出物の55マイクロリットルを2ミリリットルのチューブと渦に移します。次いで、このプールされたサンプルの50マイクロリットルのアリコートをガラスバイアルに移す。各穀物サンプル抽出物の50マイクロリットルのアリコートをガラスバイアルに移す。書かれた原稿に記載されているように、液体クロマトグラフィー質量分析に必要な溶液を準備する。LCMS分析の日に、1ミリリットルの5%アセトニトリルを調製し、1ミリリットルのロイシン・エンケファリン当たり200ナノグラムを含有する。この溶液の950マイクロリットルを、粒抽出物の50マイクロリットルアリコートを含むガラスバイアルに加えます。渦をかいてバイアル中の内容物を混ぜます。まず、原稿とメーカーのユーザーガイドに記載されているように、機器のキャリブレーションを設定します。次に、移動相および洗浄溶媒を含むLCMSグレードの溶媒を使用してLC流体システムをパージし、洗浄する。LC方式の開始条件を使用してLCシステムを平衡化し、カラム圧が安定していることを確認します。計測器シーケンステーブルを設定します。サンプルシーケンスの最初にナトリウムのフォーマットを注入して、機器のキャリブレーションを確認します。最初に溶剤と予備ブランクを分析し、次にシステムコンディショニング用のプールされた品質管理サンプルを分析し、次に無作為化サンプルリストを分析します。技術複製として、品質管理サンプルを定期的に実行します。シーケンスの最後に 2 つの品質管理サンプルを実行します。シーケンスの実行中に、内部標準質量精度と信号再現性の両方を含むデータ品質を確認します。信号の再現性を確認するには、オーバーレイスペクトルの目視検査で十分です。4つの内部標準は、穀物抽出物を調製するために使用される溶液に含まれていた。LCMSでは、正と負のイオン化モードの両方で、良好な質量精度と内部標準の単一再現性が観察されました。ブランクの分析に基づいて、負のモードで421の信号と正のモードで835の信号がアーティファクトであると判断された。これらのシグナルは、穀物サンプル中の平均単一強度の5%以上の強度でブランクに存在していた。アーティファクトの除去とデータのさらなるフィルタリングの後、ネガティブモードは483の機能を返し、ポジティブモードは523の機能を返しました。約250の特徴は生物学的に関連しており、小麦品種の強度が大きく異なっていました。このプロトコルでは、準備ブランク、内部標準、プールされたサンプルを含めるなどの品質管理対策が重要です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

逆相液体クロマトグラフィー-質量分析法による無細胞タンパク質合成代謝の絶対定量

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

遺伝子発現プロファイリングのための修飾法による穀物種子からの高品質なトランスクリプトームデータの取得

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

液体クロマトグラフィー質量分析とバイオインフォマティクスによるペプチドグリカンの半定量分析

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

ヘッドスペース固相微小抽出を用いたブラックカラントフルーツの揮発性化合物のガスクロマトグラフィー-質量分析法のプロファイリング

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...