Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

저자는 서호주 프리미어의 농업 및 식품 펠로우십 프로그램 (일자리, 관광, 과학 및 혁신학과, 웨스턴 오스트레일리아 정부)과 프리미어 펠로우 인 사이먼 쿡 (센터 디지털 농업, 커튼 대학과 머독 대학). 현장 시험 및 곡물 샘플 수집은 서호주 의 지역 로열티 프로그램에 대한 정부의 지원을 받았습니다. 우리는 현장 시험에 기여한 그랜틀리 스테인러와 로버트 프랑스어를 인정합니다. NCRIS가 자금을 지원하는 바이오 플랫폼 오스트레일리아는 장비 자금 조달을 인정받고 있습니다.

이 방법은 30개의 샘플(샘플당 약 150개의 시드)에 적합합니다. 10개의 다른 필드 재배 밀 품종의 3개의 생물학 복제본은 여기에서 이용되었습니다.
1. 곡물의 준비
<ol><li>-80°C 저장고에서 샘플(통곡물)을 회수합니다. 참고: 여러 계절에 샘플을 채취하는 경우 수확 직후에 씨앗의 동결 건조를 권장합니다. 이것은 저장의 다양한 기간 후에 생길 수 있는 대사 산물 농도에 있는 ?...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

여기에서, 우리는 밀 곡물의 분석을 위한 LC-MS 기지를 둔 표적되지 않은 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 4개의 획득 모드(역단계 및 지질-반응성 역위상과 양성 및 음수 이온화)를 두 가지 모드로 결합하여 제3 의 이동상을 역위상 구배로 도입한다. 결합된 접근은 밀 품종 사이 강렬에 있는 이의 대략 반을 가진 이온 극성 당 대략 500의 생물학적으로 관련있는 특징을 산출했습니다. 다른 밀 ?...

농업의 유전자, 환경 및 관리 관행 간의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리할 수 있습니다. 식물 대사 산물은 게놈, 환경 (기후, 강우 등)과 같은 요인에 의해 영향을 받고 농업 환경에서 작물을 관리하는 방식 (즉, 비료, 살균제 등의 적용)에 의해 영향을받습니다. 게놈과는 달리, 대사체는 이 요인 전부에 의해 영향을 받고 그러므로 metabolomics 데이터는 특정 시간에 이 상호 작용의 생화확적인 지문을 제공합니다. 일반적으로 대사체학 기반 연구에 대한 두 가지 목표 중 하나가 있습니다: 첫째, 유기체의 생화학에 대한 깊은 이해를 달성하고 생리학과 관련하여 섭동 (생체 또는 생체 스트레스)에 대한 반응 메커니즘을 설명하는 데 도움이됩니다. 둘째, 바이오마커를 연구 하에 섭동과 연관시다. 두 경우 모두 이러한 지식을 보유한 결과는 수율 크기와 품질 향상이라는 목표를 달성하기 위한 보다 정확한 관리 전략입니다.
식물 메타볼로메는 다양한 물리 화학적 특성을 가진 수천개의 작은 분자를 포함할 것으로 예측됩니다. 현재, 어떤 대사체학 플랫폼 (주로 질량 분광법 및 핵 자기 공명 분광법)은 단 하나 분석에서 전체 metabolome를 붙잡을 수 없습니다. 이러한 기술 개발 (샘플 준비, 대사 산물 추출 및 분석), 단일 분석 실행 내에서 가능한 한 대사 체의 큰 범위를 제공, 대사 체학 연구원에 대 한 주요 목표. 밀 곡물의 이전 비표적 대사체학 분석은 더 큰 대사체 범위를 위해 다중 크로마토그래피 분리 및 획득 극성 및/또는 계측에서 얻은 데이터를 결합했습니다. 그러나, 이것은 각 양식에 대해 별도로 준비하고 취득하는 견본을 요구했습니다. 예를 들어, Beleggia등 2는 비극성 분석물의 GC-MS 분석 이외에 극성 분석물의 GC-MS 분석을 위한 유도체 샘플을 제조하였다. Das etal.3은 GC- 및 LC-MS 방법을 모두 사용하여 분석에서 커버리지를 개선했습니다. 그러나, 이 접근법은 일반적으로 위에서 설명한 바와 같이 별도의 샘플 준비뿐만 아니라 두 개의 독립적인 분석 플랫폼이 필요합니다. GC-MS2,3,3,4 및 LC-MS33,5 플랫폼을 이용한 밀곡물의 이전 분석은 GC-MS에 대한 50 내지 412(55identified) 특징을 산출하였고, 409는 GC-MS 및 LC-MS를 결합하고 LC-MS 지질학 분석에 대해 수천 개의 특징을 산출하였다 5.5 단일 분석에 적어도 두 개의 모드를 결합하여 확장된 대사체 커버리지를 유지하여 생물학적 해석의 풍요로움을 높이는 동시에 시간과 비용을 모두 절감할 수 있습니다.
역상 크로마토그래피에 의해 광범위한 지질 종의 효율적인 분리를 허용하기 위해, 현대 지질학 방법론은 일반적으로 용출 용매6에서이소프로판올의 높은 비율을 사용하며, 그렇지 않으면 크로마토그래피에 의해 해결되지 않을 수 있는 지질 클래스에 대한 어플가능성을 제공한다. 효율적인 지질 분리를 위해, 시작 이동상은 또한 분자의 다른 클래스를 고려하는 전형적인 역상 크로마토그래피 방법보다 유기조성물 7에서 훨씬 더 높다. 그라데이션의 시작 부분에 높은 유기 조성물은 분자의 많은 다른 클래스에 이러한 방법을 덜 적합하게. 가장 주목할 만한, 역상 액체 크로마토그래피는 주로 수성 조성으로 시작하여 크로마토그래피의 용출 강도가 증가함에 따라 유기 함량이 증가하는 이진 용매 구배를 채용합니다. 이를 위해, 우리는 단일 분석 내에서 대사 산물의 지질 및 비 지질 클래스의 분리를 달성하기 위해 두 가지 접근법을 결합하고자했습니다.
여기에서는, 우리는 제 3 이상을 사용하고 단 하나 견본 준비 및 1개의 분석 컬럼을 사용하여 전통적인 반전상 및 lipidomics 적합한 크로마토그래피 방법을 결합하는 크로마토그래피 방법을 제시하는 것을 제시합니다. 당사는 주로 임상 대사체학 연구에서 이전에 구현된 많은 품질 관리 조치 및 데이터 필터링 단계를 채택했습니다. 이러한 접근법은 높은 기술적 재현성 및 생물학적 관련성을 가진 견고한 특징을 결정하는 데 유용하며 이러한 기준을 충족하지 않는 특징은 제외합니다. 예를 들어, 풀링된 QC 샘플8,QC 보정9,데이터 필터링9,,10 및 누락된 피처의대칭(11)의반복 분석을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

유전자, 환경 및 농업 관행의 관리 사이의 상호 작용을 이해하면 제품 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리 할 수 있습니다. Metabolomics 데이터는 주어진 순간에 이 상호 작용의 판독을 제공하고 유기체의 생화확적인 상태의 유익합니다. 또한, 개별 대사 산물 또는 대사 산물의 패널은 수율 및 품질 예측 및 관리를위한 정확한 바이오 마커로 사용될 수있다. 식물 메타볼로메는 생리적 특성과 바이오마커 발견에 대한 생화학적 통찰력을 제공하는 다양한 물리화학적 특성을 가진 수천 개의 소분자를 함유할 것으로 예측됩니다. 이를 악용하기 위해, 대사체학 연구원의 주요 목표는 단일 분석 내에서 가능한 한 많은 물리 화학적 다양성을 포착하는 것입니다. 여기에서 우리는 필드 성장한 밀 곡물의 분석을 위한 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기지를 둔 표적으로 한 metabolomics 방법을 제시합니다. 이 방법은 액체 크로마토그래피 사분면 용매 관리자를 사용하여 제 3 의 이상을 소개하고 전통적인 역상 그라데이션과 지질 -amenable 그라데이션을 결합합니다. 곡물 준비, 대사 산물 추출, 도구 분석 및 데이터 처리 워크플로우에 대해 자세히 설명합니다. 양호한 질량 정확도 및 신호 재현성이 관찰되었고, 이 방법은 이온화 모드당 약 500개의 생물학적으로 관련된 특징을 산출하였다. 또한, 밀 품종 간의 현저하게 다른 대사 산물 및 지질 특징 신호를 결정했습니다.

식물 대사체는 게놈과 환경의 조합에 의해 영향을, 그리고 또한 농업 설정에서, 작물 관리 정권. 우리는 밀 품종 간의 유전적 차이가 대사 산물 수준에서 관찰 될 수 있음을 보여줍니다, 여기, 이상과 500 곡물 혼자 품종 사이의 상당히 다른 농도를 보여주는 측정 화합물. 양호한 질량 정확도(<10 ppm 오차) 및 내부 표준의 신호 재현성(<20% RSD)(그림2)은음?...

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

밀 곡물 대사 산물 및 지질의 비표적 분석을위한 방법이 제시된다. 이 프로토콜에는 아세토니트릴 대사산물 추출 방법 및 역위상 액체 크로마토그래피 질량 분광법 방법이 포함되며, 양극 및 음전소 이온화 모드로 수집됩니다.

밀 곡물의 비표적 액체 크로마토그래피 질량 분광계 기반 대사체학 분석

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

대사 산물은 게놈 환경 및 관리 관행과 같은 요인에 의해 영향을 받습니다. 이러한 요소 간의 상호 작용을 이해하면 제품의 수율과 품질을 보다 정확하게 예측하고 관리할 수 있습니다. 전통적인 2개가 아닌 세 번째 이동 단계를 통합함으로써 이 기술은 더 넓은 범위의 대사 산물을 분리하고 검출할 수 있게 합니다.메타볼로믹스는 생물학의 모든 영역에 적용될 수 있었습니다. 첫째, 유기체의 생화학에 대한 깊은 이해를 달성하고 생리학과 관련하여 생체 내 또는 생물학적 스트레스에 대한 반응을 설명하는 데 도움이됩니다. 둘째, 바이오마커를 연구 하에 의기양양하게 연관짓는다.이소프로필 알코올은 점성 용매이기 때문에, 낮은 플레어 속도로 도입되어야 하며, 구성을 98%로 높이기 전에 충분한 평형 시간을 도입하여 이러한 단계는 색채 그래픽 시스템이 과압, 오류 반환 또는 잠재적으로 분석 열을 손상시키는 것을 방지할 것이다. 곡물의 준비를 시작하려면 실험실 블렌더를 사용하여 곡물을 갈아. 블렌더를 20초 동안 고속으로 실행한 다음 반복합니다.베이스에서 블렌더 항아리를 제거합니다. 믹서기 항아리의 측면을 탭하여 거친 접지 곡물을 샘플 표면에 가져옵니다. 거칠게 분쇄된 곡물은 폐기하거나 저장할 수 있습니다.블렌더에서 2밀리리터 플라스틱 마이크로 원심분리기 튜브로 미세하게 분쇄된 곡물을 전달합니다. 추출과 같은 날에, 원고에 설명된 대로 추출 용매를 준비한다. 다음으로, 2밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 200 밀리그램의 미세 접그레인을 계량합니다.튜브의 곡물에 추출 용매 500 마이크로리터를 추가합니다. 또한 빈 튜브에 500 마이크로리터의 추출 용매를 추가하여 빈 공간을 준비합니다. 6, 500 RPM으로 설정된 균질화제를 사용하여 용매와 곡물을 20초 동안 혼합합니다.그런 다음 20초 동안 반복합니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 4도, 100배, 5분간 원심분리합니다. 상체를 2밀리리터 플라스틱 튜브로 옮기고 펠릿을 유지합니다.펠릿에서 추출 과정을 두 번 반복합니다. 세 개의 수퍼나티를 결합하여 약 1.5 밀리리터의 총 추출물 볼륨을 산출하고 소용돌이에 섞습니다. 품질 관리에 사용되는 모든 곡물 추출물의 풀링된 샘플을 만들기 위해 각 곡물 추출물의 55마이크로리터를 2밀리리터 튜브와 소용돌이로 옮기십시오.그런 다음 이 풀이 된 샘플의 50 개의 마이크로 리터 알리쿼트를 유리 바이알로 옮기습니다. 각 곡물 샘플 추출물의 50 마이크로리터 알리쿼트를 유리 바이알로 옮기. 서면 원고에 설명된 바와 같이 액체 크로마토그래피 질량 분석법에 필요한 솔루션을 준비한다.LCMS 분석 당일, 밀리리터 류신 엔케팔린당 200 나노그램을 함유한 5%아세토닐릴100밀리리터를 준비합니다. 이 용액의 마이크로리터 950마이크로리터를 곡물 추출물의 50 마이크로리터 알리쿼트가 들어 있는 유리 바이알에 추가합니다. 소용돌이에 의해 유리병에 내용기를 혼합.먼저 원고와 제조업체의 사용자 가이드에 설명된 대로 계측기 교정을 설정합니다. 다음으로, LCMS 급성 용매를 사용하여 LC 유체 시스템을 제거하고 플러시합니다. LC 방법 시작 조건을 사용하여 LC 시스템을 평형화하여 열 압력이 안정화되도록 합니다.계측기 시퀀스 테이블을 설정합니다. 시료 시퀀스의 시작 부분에 나트륨 포메이트를 주입하여 계측기 교정을 확인합니다. 먼저 용매 및 전두엽 블랭크를 분석하고 시스템 컨디셔닝을 위한 풀링된 품질 관리 샘플과 무작위 샘플 목록을 분석합니다.기술 복제로 품질 관리 샘플을 정기적으로 실행합니다. 시퀀스의 끝에서 두 개의 품질 관리 샘플을 실행합니다. 시퀀스가 실행되는 동안 내부 표준 질량 정확도와 신호 재현성을 모두 포함하여 데이터 품질을 확인합니다.신호 재현성을 확인하려면 오버레이 스펙트럼의 육안 검사로 충분합니다. 곡물 추출물을 준비하는 데 사용되는 용액에 4개의 내부 표준이 포함되었다. LCMS 동안 양수 및 음의 이온화 모드 모두에서 양질량 정확도와 내부 표준의 단일 재현성이 관찰되었습니다.공백 의 분석에 따라, 음수 모드에서 421 신호와 양성 모드에서 835 신호는 유물로 판단되었다. 이러한 신호는 곡물 샘플의 평균 단일 강도의 5%와 같거나 큰 강도의 공백에 존재하였다. 아티팩트를 제거하고 데이터의 추가 필터링 후 음수 모드는 483개의 기능을 반환했으며 양수 모드는 523개의 기능을 반환했습니다.약 250개의 특징은 생물학적으로 관련이 있고 밀 품종에 걸쳐 강도가 크게 달랐습니다. 사전 공백, 내부 표준 및 풀링된 샘플의 포함과 같은 품질 관리 조치는 이 프로토콜에서 기억하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

의 대사 산물 분석을위한 탠덤 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석 기반 접근<em&gt; 포도상 구균</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

연구

생화학

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

깊은 프로테옴 Isobaric 라벨, 광범위 한 액체 크로마토그래피, 질량 분석 및 소프트웨어 기반 정량화 하 여 프로 파일링

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

역상 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 의한 무세포 단백질 합성 대사의 절대 정량화

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

유전자 발현 프로파일링을 위한 수정된 방법으로 시리얼 씨앗에서 고품질 전사 데이터 획득

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

헤드스페이스 고체-위상 미세 추출을 사용하여 블랙커런트 과일의 휘발성 화합물 프로파일링

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...