Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne West Australian Premier's Agriculture and Food Fellowship program (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) og Premier's Fellow, Professor Simon Cook (Senter for Digitalt landbruk, Curtin University og Murdoch University). Feltforsøk og kornprøvesamling ble støttet av regjeringen i Western Australias royalties for regioner-program. Vi anerkjenner Grantley Stainer og Robert French for deres bidrag til feltforsøk. NCRIS-finansierte Bioplatforms Australia er anerkjent for utstyrsfinansiering.

Denne metoden passer for 30 prøver (ca. 150 frø per prøve). Tre biologiske replikater av ti forskjellige feltdyrkede hvetevarianter ble brukt her.
1. Fremstilling av korn
<ol><li>Hent prøver (fullkorn) fra -80 °C lagring. MERK: Frystørking av frø anbefales kort tid etter innhøsting hvis prøver samles inn fra flere sesonger. Dette minimerer eventuelle endringer i metabolittkonsentrasjon som kan oppstå etter varierende lagringsperioder. For å gjøre dette, overføre frø til en 1...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

Her presenterer vi en LC-MS-basert umålrettet metabolomikkmetode for analyse av hvetekorn. Metoden kombinerer fire anskaffelsesmoduser (omvendt fase og lipid-mottagelig omvendt fase med positiv og negativ ionisering) i to moduser ved å introdusere en tredje mobilfase i omvendt fasegradient. Den kombinerte tilnærmingen ga ca 500 biologisk relevante egenskaper per ion polaritet med omtrent halvparten av disse betydelig forskjellige i intensitet mellom hvetesorter. Betydelige endringer i metabolittkonsentrasjon i kornet ...

Å forstå samspillet mellom gener, miljø og ledelsespraksis i landbruket kan gi mer nøyaktig prediksjon og styring av produktutbytte og kvalitet. Plantemetabolitter påvirkes av faktorer som genomet, miljøet (klima, nedbør etc.), og i landbruket, måten avlinger forvaltes (dvs. anvendelse av gjødsel, soppdrepende etc.). I motsetning til genomet påvirkes metabolomet av alle disse faktorene, og dermed gir metabolomikkdata et biokjemisk fingeravtrykk av disse interaksjonene på et bestemt tidspunkt. Det er vanligvis ett av to mål for en metabolomikkbasert studie: for det første for å oppnå en dypere forståelse av organismens biokjemi og bidra til å forklare reaksjonsmekanismen for perturbasjon (abiotisk eller biotisk stress) i forhold til fysiologien; og for det andre, for å knytte biomarkører til perturbasjonen under studien. I begge tilfeller er resultatet av å ha denne kunnskapen en mer presis forvaltningsstrategi for å nå målet om forbedret avkastningsstørrelse og kvalitet.
Plantemetabolomen er spådd å inneholde tusenvisav 1 av små molekyler med varierte fysikokjemiske egenskaper. Foreløpig ingen metabolomics plattformer (overveiende masse spektrometri og kjernefysisk magnetisk resonans spektroskopi) kan fange hele metabolome i en enkelt analyse. Utvikle slike teknikker (prøveforberedelse, metabolittutvinning og analyse), som gir så stor dekning av metabolomet som mulig innenfor en enkelt analytisk løp, er et viktig mål for metabolomikk forskere. Tidligere umålrettede metabolomikkanalyser av hvetekorn har kombinert data fra flere kromatografiske separasjoner og oppkjøpavpolariteter og/eller instrumentering for større metabolomdekning. Dette har imidlertid krevd at prøvene skal tilberedes og anskaffes separat for hver modalitet. Beleggia et al.2 utarbeidet for eksempel et avledet utvalg for GC-MS-analysen av polaranalytter i tillegg til GC-MS-analysen av de ikke-polare analytter. Das et al.3 brukte både GC- og LC-MS-metoder for å forbedre dekningen i sine analyser; Denne tilnærmingen vil imidlertid generelt kreve separate prøvepreparater som beskrevet ovenfor, samt to uavhengige analytiske plattformer. Tidligere analyser av hvetekorn ved hjelp av GC-MS2,3,4 og LC-MS3,5 plattformer har gitt 50 til 412 (55 identifisert) funksjoner for GC-MS, 409 for kombinert GC-MS og LC-MS og flere tusen for en LC-MS lipidomics analyse5. Ved å kombinere minst to moduser i en enkelt analyse, kan utvidet metabolomdekning opprettholdes, noe som øker rikdommen av biologisk tolkning samtidig som den tilbyr besparelser både i tid og kostnad.
For å tillate effektiv separasjon av et bredt spekter av lipidarter ved reversert-fase kromatografi, bruker moderne lipidomics metoder vanligvis en høy andel av isopropanol i elutionløsningsmiddelet6, noe som gir amenability til lipidklasser som ellers kan være uløst av kromatografien. For en effektiv lipidseparasjon er startfasen også mye høyere i organisk sammensetning7 enn de typiske reverserte fasekromatikkene, som vurderer andre klasser av molekyler. Den høye organiske sammensetningen ved starten av gradienten gjør disse metodene mindre egnet for mange andre klasser av molekyler. Spesielt, reversert fase flytende kromatografi benytter en binær løsemiddel gradient, starter med en for det meste vandig sammensetning og øker i organisk innhold som elution styrken av kromatografi en økt. For dette formål forsøkte vi å kombinere de to tilnærmingene for å oppnå separasjon av både lipid- og ikke-lipidklasser av metabolitter i en enkelt analyse.
Her presenterer vi en kromatistisk metode som bruker en tredje mobilfase og muliggjør en kombinert tradisjonell omvendt fase og lipidomikk-passende kromatografimetode ved hjelp av et enkelt prøvepreparat og en analytisk kolonne. Vi har vedtatt mange av kvalitetskontrolltiltak ene og datafiltreringstrinnene som tidligere er implementert i overveiende kliniske metabolomikkstudier. Disse tilnærmingene er nyttige for å bestemme robuste funksjoner med høy teknisk reproduserbarhet og biologisk relevans og utelukker de som ikke oppfyller disse kriteriene. Vi beskriver for eksempel gjentatt analyse av det samlede QC-eksemplet8, QC-korreksjon9,datafiltrering9,,10 og imputering av manglende funksjoner11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

Å forstå samspillet mellom gener, miljø og forvaltning i landbrukspraksis kan gi mer nøyaktig prediksjon og styring av produktutbytte og kvalitet. Metabolomikkdata gir en avlesning av disse interaksjonene på et gitt tidspunkt og er informativ av organismens biokjemiske status. Videre kan individuelle metabolitter eller paneler av metabolitter brukes som presise biomarkører for utbytte og kvalitetsprediksjon og ledelse. Plantemetabolomen er spådd å inneholde tusenvis av små molekyler med varierte fysikokjemiske egenskaper som gir en mulighet for en biokjemisk innsikt i fysiologiske egenskaper og biomarkøroppdagelse. For å utnytte dette, et viktig mål for metabolomikk forskere er å fange så mye av fysikokjemisk mangfold som mulig innenfor en enkelt analyse. Her presenterer vi en flytende kromatografi-massespektrometribasert umålrettet metabolomikkmetode for analyse av feltdyrket hvetekorn. Metoden bruker flytende kromatograf kvartær løsningsmiddel manager for å introdusere en tredje mobil fase og kombinerer en tradisjonell omvendt fase gradient med en lipid-mottagelig gradient. Kornforberedelse, metabolittutvinning, instrumentell analyse og databehandlingsarbeidsflyter er beskrevet i detalj. God massenøyaktighet og signalreproduserbarhet ble observert, og metoden ga ca. 500 biologisk relevante egenskaper per ioniseringsmodus. Videre ble signifikant forskjellige metabolitter og lipidfunksjonssignaler mellom hvetevarianter bestemt.

Plantemetabolomen påvirkes av en kombinasjon av genom og miljø, og i tillegg i en landbrukssetting, avlingsforvaltningsregimet. Vi viser at genetiske forskjeller mellom hvetevarianter kan observeres på metabolittnivå, her, med over 500 målte forbindelser som viser betydelig forskjellige konsentrasjoner mellom varianter i kornet alene. God massenøyaktighet (<10 ppm-feil) og signalreproduserbarhet (<20 % RSD) av interne standarder (figur 2) ble observert ...

Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

En metode for umålrettet analyse av hvetekornmetabolitter og lipider presenteres. Protokollen inkluderer en acetonitrile metabolitt ekstraksjonsmetode og reversert fase flytende kromatografi-massespektrometri metodikk, med oppkjøp i positive og negative elektrospray ioniseringmoduser.

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

Metabolitten påvirkes av faktorer som genommiljøet og forvaltningspraksisen. Forstå interaksjoner mellom disse faktorene kan tillate mer nøyaktig prediksjon og styring av et produkts avkastning og kvalitet. Ved å innlemme en tredje mobil fase, i stedet for de tradisjonelle to, denne teknikken tillater separasjon og påvisning av et bredere spekter av metabolitter.Metabolomics kan brukes på ethvert område av biologi. For det første, for å oppnå en dypere forståelse av kroppens biokjemi, og bidra til å forklare deres respons på abiotisk eller biotisk stress i forhold til fysiologien. For det andre, å knytte biomarkører med perturbasjonen under studien.Siden isopropylalkohol er et viskøs løsningsmiddel, bør det innføres ved lav fakkelhastighet, og tilstrekkelig likevektstid som brukes før du øker sammensetningen til 98%Disse trinnene vil forhindre at det kromatiske grafiske systemet overtrykker, returnerer en feil eller potensielt skader den analytiske kolonnen. For å begynne å forberede kornene, bruk en laboratorieblender til å male kornet. Kjør blenderen på høy hastighet i 20 sekunder, og gjenta deretter.Fjern hurtigmikserkannen fra sokkelen. Trykk på siden av blenderkannen for å bringe grovt malt korn til overflaten av prøven. Grovt malt korn kan kastes eller lagres.Overfør det finkvernede kornet fra blenderen til et to milliliter plastmikrosentrigerrør. På samme dag som utvinningen, forberede utvinning løsemiddel, som beskrevet i manuskriptet. Deretter veier du 200 milligram finbunnet korn i et to milliliter mikro sentrifugerør.Tilsett 500 mikroliter ekstraksjonsløsemiddel til kornet i røret. I tillegg forberede en blank ved å legge til 500 mikroliter ekstraksjon løsemiddel til et tomt rør. Bruk en homogenisator, satt til 6, 500 RPM, bland oppløsningsvæsken og kornet i 20 sekunder.Gjenta deretter i ytterligere 20 sekunder. Deretter sentrifuger røret ved fire grader Celsius og 16, 100 ganger G, i fem minutter. Overfør det overnaturlige til et to milliliter plastrør og behold pelleten.Gjenta ekstraksjonsprosessen på pellet to ganger. Kombiner de tre supernativa, noe som gir et totalt ekstraktvolum på ca. 1,5 milliliter og bland ved å virvle. For å lage en samlet prøve av alle kornekstraktene som skal brukes til kvalitetskontroll, overfør 55 mikroliter av hvert kornekstrakt til et to milliliter rør og virvel.Deretter overfører du 50 mikroliter aliquots av denne samlede prøven til hetteglass med glass. Overfør en 50-mikroliter aliquot av hvert kornprøveekstrakt til hetteglass. Som beskrevet i det skriftlige manuskriptet, forberede løsninger som vil være nødvendig for flytende kromatografi massespektrometri.På dagen for LCMS-analysen, forberede 100 milliliter med 5% acetonitril, som inneholder 200 nanogram per milliliter leucin enkephalin. Tilsett 950 mikroliter av denne oppløsningen til hetteglasset med 50 mikroliter aliquot av kornekstraktet. Bland innholdet i hetteglasset ved å virvle.Først setter du opp en kalibrere instrumentene som beskrevet i manuskriptet og produsentens brukerhåndbok. Deretter renser og skyller LC-fluidicssystemet ved hjelp av LCMS-oppløsningsvæsker, inkludert mobilfase og vaskemidler. Likevekt LC-systemet ved hjelp av startforholdene for LC-metoden, slik at kolonnetrykket har stabilisert seg.Definer instrumentsekvenstabellen. Injiser natriumformat i begynnelsen av prøvesekvensen for å kontrollere instrumentkalibreringen. Analyser løsemiddel og forberedende emner først, etterfulgt av samlede kvalitetskontrollprøver for systemkondisjonering, og deretter den randomiserte eksempellisten.Kjør kvalitetskontrolleksempler med jevne mellomrom, som tekniske replikeringer. Kjør to kvalitetskontrolleksempler på slutten av sekvensen. Mens sekvensen kjører, kontrollerer du datakvaliteten, inkludert både den interne standard massenøyaktigheten og signalreproduksjonsbarheten.For å kontrollere signalreproduserelighet, bør visuell inspeksjon av overlaid spektra være tilstrekkelig. Fire interne standarder ble inkludert i løsningen som ble brukt til å forberede kornekstraktene. Under LCMS ble god massenøyaktighet og enkelt reproduserbarhet av interne standarder observert for både positive og negative ioniseringsmoduser.Basert på analyse av blanks ble 421 signaler i negativ modus og 835 signaler i positiv modus dømt til å være artefakter. Disse signalene var til stede i emner med intensiteter lik eller større enn 5% av gjennomsnittlig enkeltintensitet i kornprøver. Etter fjerning av artefaktene og ytterligere filtrering av dataene, returnerte negativ modus 483-funksjoner og positiv modus returnerte 523-funksjoner.Omtrent 250 funksjoner var biologisk relevante og varierte signifikant i intensitet på tvers av hvetevarianter. Kvalitetskontrolltiltakene, som inkludering av forberedende emner, interne standarder og samlede prøver, er viktige å huske i denne protokollen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Dyp proteom profilering av isobar merking, omfattende flytende Ture, massespektrometri og Software-baserte kvantifisering

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Absolutt kvantifisering av Cell-fri protein syntese metabolisme av reversert-fase flytende kromatografi-Mass massespektrometri

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Skaffe transkripsjonsdata av høy kvalitet fra kornfrø med en modifisert metode for genuttrykksprofilering

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Semi-kvantitativ analyse av peptidoglykan ved væskekromatografi, massespektrometri og bioinformatikk

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

En massespektrometribasert proteomikktilnærming for global og høykonfidensprotein R-metyleringsanalyse

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Profilering av flyktige forbindelser i solbærfrukt ved hjelp av headspace solidfaset mikroekstraksjon koblet til gasskromatografi-massespektrometri

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...