Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
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Os autores gostariam de reconhecer o programa de Bolsas de Agricultura e Alimentação do Primeiro-Ministro da Austrália Ocidental (Departamento de Empregos, Turismo, Ciência e Inovação, Governo da Austrália Ocidental) e o Primeiro-Ministro, professor Simon Cook (Centro para Agricultura Digital, Universidade de Curtin e Universidade Murdoch). Os ensaios de campo e a coleta de amostras de grãos foram apoiados pelo governo do programa Royalties for Regions da Austrália Ocidental. Reconhecemos Grantley Stainer e Robert French por suas contribuições para testes de campo. As Bioplataformas da Austrália, financiadas pelo NCRIS, são reconhecidas pelo financiamento de equipamentos.

Este método é apropriado para 30 amostras (aproximadamente 150 sementes por amostra). Três réplicas biológicas de dez variedades diferentes de trigo cultivados em campo foram usadas aqui.
1. Preparação de grãos
<ol><li>Recuperar amostras (grãos integrais) de -80 °C de armazenamento. NOTA: A secagem congelante das sementes é recomendada logo após a colheita se as amostras estiverem sendo coletadas em várias estações. Isso minimiza quaisquer alterações na concentração met...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

Aqui, apresentamos um método de metabolômica não direcionado à base de LC-MS para a análise de grãos de trigo. O método combina quatro modos de aquisição (fase invertida e fase invertida com ionização positiva e negativa) em dois modos, introduzindo uma terceira fase móvel no gradiente de fase invertida. A abordagem combinada produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por polaridade de íons, com cerca de metade dessas significativamente diferentes em intensidade entre as variedad...

Compreender as interações entre genes, meio ambiente e práticas de manejo na agricultura poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e da qualidade do produto. Os metabólitos vegetais são influenciados por fatores como o genoma, o ambiente (clima, chuvas etc.), e em um ambiente agrícola, a forma como as culturas são gerenciadas (ou seja, aplicação de fertilizantes, fungicidas etc.). Ao contrário do genoma, o metabolome é influenciado por todos esses fatores e, portanto, os dados metabolômicos fornecem uma impressão digital bioquímica dessas interações em um determinado momento. Geralmente, há uma das duas metas para um estudo baseado em metabolômica: em primeiro lugar, obter uma compreensão mais profunda da bioquímica do organismo e ajudar a explicar o mecanismo de resposta à perturbação (estresse abiótico ou biótico) em relação à fisiologia; e, em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo. Em ambos os casos, o resultado de ter esse conhecimento é uma estratégia de gestão mais precisa para alcançar o objetivo de melhorar o tamanho e a qualidade do rendimento.
Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares depequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas. Atualmente, nenhuma plataforma metabolômica (espectrometria de massa predominantemente e espectroscopia de ressonância magnética nuclear) pode capturar todo o metabolome em uma única análise. Desenvolver tais técnicas (preparação da amostra, extração e análise metabólica), que fornecem a maior cobertura possível do metabolome dentro de uma única corrida analítica, é um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica. Análises metabolômicas não direcionadas anteriores de grãos de trigo combinaram dados de múltiplas separações cromatográficas e polaridades de aquisição e/ou instrumentação para maior cobertura metabolome. No entanto, isso exigiu que as amostras fossem preparadas e adquiridas separadamente para cada modalidade. Por exemplo, Beleggia et al.2 prepararam uma amostra derivatizada para a análise de ánlytes polares gc-ms, além da análise gc-ms dos analytes não polares. Das et al.3 utilizaram métodos GC e LC-MS para melhorar a cobertura em suas análises; no entanto, essa abordagem exigiria geralmente preparações amostrais separadas como descrito acima, bem como duas plataformas analíticas independentes. Análises anteriores de grãos de trigo utilizando GC-MS3,5 2,,3,,4 e LC-MS 3 , 5 plataformas produziram 50 a 412 (55 identificados) recursos para GC-MS, 409 para GC-MS e LC-MS combinados e vários milhares para análise de lipidomia slc-MS5. Ao combinar pelo menos dois modos em uma única análise, a cobertura metabolome estendida pode ser mantida, aumentando a riqueza da interpretação biológica e, ao mesmo tempo, oferecendo economia tanto no tempo quanto no custo.
Para permitir a separação eficiente de uma ampla gama de espécies lipídicas por cromatografia de fase invertida, as metodologias de lipidomia modernas geralmente utilizam uma alta proporção de isopropanol no solvente de elução6, proporcionando amenidade às classes lipídicas que poderiam ser não resolvidas pela cromatografia. Para uma separação lipídica eficiente, a fase móvel inicial também é muito maior na composição orgânica7 do que os métodos cromatográficos de fase invertidos típicos, que consideram outras classes de moléculas. A alta composição orgânica no início do gradiente torna esses métodos menos adequados para muitas outras classes de moléculas. Mais notavelmente, a cromatografia líquida de fase invertida emprega um gradiente binário solvente, começando com uma composição principalmente aquosa e aumentando em conteúdo orgânico à medida que a força de eluição da cromatografia é aumentada. Para tanto, buscou-se combinar as duas abordagens para alcançar a separação das classes lipídicas e não lipídicas de metabólitos em uma única análise.
Aqui, apresentamos um método cromatográfico que utiliza uma terceira fase móvel e permite um método de cromatografia de fase reversa e lipidomics adequado à lipidomia usando uma única preparação de amostra e uma coluna analítica. Adotamos muitas das medidas de controle de qualidade e etapas de filtragem de dados que já foram implementadas em estudos de metabolômica predominantemente clínica. Essas abordagens são úteis na determinação de características robustas com alta reprodutibilidade técnica e relevância biológica e excluem aquelas que não atendem a esses critérios. Por exemplo, descrevemos a repetição da amostra de QC agrupada8, correção QC9, filtragem de dados9,,10 e imputação de recursos ausentes11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

Compreender as interações entre genes, meio ambiente e gestão na prática agrícola poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e qualidade do produto. Os dados metabolômicos fornecem uma leitura dessas interações em um dado momento e são informativos do estado bioquímico de um organismo. Além disso, metabólitos individuais ou painéis de metabólitos podem ser usados como biomarcadores precisos para previsão e gerenciamento de rendimento e qualidade. Prevê-se que o metabolome da planta contenha milhares de pequenas moléculas com variadas propriedades físico-químicas que fornecem uma oportunidade para uma visão bioquímica sobre traços fisiológicos e descoberta de biomarcadores. Para explorar isso, um objetivo fundamental para os pesquisadores de metabolômica é capturar o máximo possível da diversidade físico-química em uma única análise. Aqui apresentamos um método de metabolômica de massa de cromatografia líquida à base de espectrometria para a análise de grãos de trigo cultivados em campo. O método usa o gerenciador de solventes quaternários cromatógrafo líquido para introduzir uma terceira fase móvel e combina um gradiente tradicional de fase invertida com um gradiente lipídico-passível. Preparação de grãos, extração metabólica, análise instrumental e fluxos de trabalho de processamento de dados são descritos em detalhes. Foi observada boa precisão de massa e reprodutibilidade de sinal, e o método produziu aproximadamente 500 características biologicamente relevantes por modo de ionização. Além disso, foram determinados sinais de características metabólicas e lipídicas significativamente diferentes entre as variedades de trigo.

O metabolome vegetal é influenciado por uma combinação de seu genoma e ambiente, e adicionalmente em um ambiente agrícola, o regime de manejo de culturas. Demonstramos que as diferenças genéticas entre as variedades de trigo podem ser observadas no nível metabólito, aqui, com mais de 500 compostos medidos mostrando concentrações significativamente diferentes entre as variedades apenas no grão. Boa precisão de massa (<10 ppm erro) e reprodutibilidade de sinal (<20% RSD) das nor...

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Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Apresenta-se um método para a análise não direcionada de metabólitos e lipídios de grãos de trigo. O protocolo inclui um método de extração metabólica acetonitrila e metodologia de espectrometria de cromatografia líquida de fase invertida, com aquisição em modos positivos e negativos de ionização eletrospray.

Análise de metabolômica baseada em espectrometria líquida não direcionada

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

O metabólito é influenciado por fatores como o ambiente do genoma e as práticas de manejo. Compreender as interações entre esses fatores poderia permitir uma previsão e gerenciamento mais precisos do rendimento e qualidade de um produto. Ao incorporar uma terceira fase móvel, em vez das duas tradicionais, esta técnica permite a separação e detecção de uma gama mais ampla de metabólitos.Metabolômica pode ser aplicada a qualquer área da biologia. Em primeiro lugar, para obter uma compreensão mais profunda da bioquímica de um organismo, e ajudar a explicar sua resposta ao estresse abiótico ou biótico em relação à fisiologia. Em segundo lugar, associar biomarcadores com a perturbação em estudo.Como o álcool isopropílico é um solvente viscoso, deve ser introduzido a baixa taxa de sinalização, e tempo de equilíbrio suficiente usado antes de aumentar a composição para 98%Essas etapas impedirão que o sistema gráfico cromático pressione demais, devolvendo um erro ou potencialmente danificando a coluna analítica. Para começar a preparação dos grãos, use um liquidificador de laboratório para moer o grão. Execute o liquidificador em alta velocidade por 20 segundos e depois repita.Remova o frasco do liquidificador da base. Bata na lateral do frasco do liquidificador para trazer qualquer grão grosseiramente moído para a superfície da amostra. Os grãos moídos grossresamente podem ser descartados ou armazenados.Transfira o grão finamente moído do liquidificador para um tubo de micro centrífuga de plástico de dois mililitros. No mesmo dia da extração, prepare o solvente de extração, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, pese 200 miligramas de grãos finamente moídos em um tubo de micro centrífuga de dois mililitros.Adicione 500 microliters de solvente de extração ao grão no tubo. Além disso, prepare um branco adicionando 500 microliters de solvente de extração a um tubo vazio. Com um homogeneizador, fixado a 6.500 RPM, misture o solvente e o grão por 20 segundos.Então, repita por mais 20 segundos. Em seguida, centrifugar o tubo a quatro graus Celsius e 16,100 vezes G, por cinco minutos. Transfira o supernatante para um tubo plástico de dois mililitros e mantenha a pelota.Repita o processo de extração na pelota duas vezes. Combine os três supernantes, produzindo um volume total de extrato de aproximadamente 1,5 mililitros e misture por vórtice. Para fazer uma amostra agrupada de todos os extratos de grãos a serem usados para controle de qualidade, transfira 55 microliters de cada extrato de grão para um tubo de dois mililitros e vórtice.Em seguida, transfira 50 alíquotas de microliter desta amostra agrupada para frascos de vidro. Transfira uma alíquota de 50 microliter de cada extrato de amostra de grão para frascos de vidro. Como descrito no manuscrito escrito, prepare as soluções que serão necessárias para espectrometria de massa cromatografia líquida.No dia da análise LCMS, prepare 100 mililitros de 5% de acetonitrilo, contendo 200 nanogramas por enkephalina de leucina mililitro. Adicione 950 microliters desta solução ao frasco de vidro contendo a alíquota de 50 microliteres do extrato de grãos. Misture o conteúdo no frasco por vórtice.Primeiro, configure um calibrar os instrumentos descritos no manuscrito e no guia de usuário do fabricante. Em seguida, purgar e lavar o sistema de fluidos LC usando solventes de grau LCMS, incluindo fase móvel e solventes de lavagem. Equilibre o sistema LC usando as condições de partida do método LC, garantindo que a pressão da coluna tenha estabilizado.Configure a tabela de sequência de instrumentos. Injete formato de sódio no início da sequência amostral para verificar a calibração do instrumento. Analisar primeiro os espaços em branco solventes e preparatórios, seguidos de amostras de controle de qualidade agrupadas para condicionamento do sistema e, em seguida, a lista de amostras aleatórias.Execute amostras de controle de qualidade em intervalos regulares, como réplicas técnicas. Execute duas amostras de controle de qualidade no final da sequência. Enquanto a sequência estiver em execução, verifique a qualidade dos dados, incluindo tanto a precisão de massa padrão interna quanto a reprodutibilidade do sinal.Para verificar a reprodutibilidade do sinal, a inspeção visual de espectros sobrepostos deve ser suficiente. Quatro normas internas foram incluídas na solução utilizada para a elaboração dos extratos de grãos. Durante o LCMS, observou-se boa precisão em massa e reprodutibilidade única de padrões internos para os modos de ionização positiva e negativa.Com base na análise de espaços em branco, 421 sinais no modo negativo e 835 sinais no modo positivo foram julgados como artefatos. Esses sinais estavam presentes em espaços em branco em intensidades iguais ou superiores a 5% da intensidade média única em amostras de grãos. Após a remoção dos artefatos e posterior filtragem dos dados, o modo negativo retornou 483 recursos e o modo positivo retornou 523 recursos.Aproximadamente 250 características foram biologicamente relevantes e diferiram significativamente em intensidade entre as variedades de trigo. As medidas de controle de qualidade, como a inclusão de espaços em branco preparatórios, normas internas e amostras agrupadas, são importantes de se lembrar neste protocolo.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Uma abordagem baseada em Espectrometria Tandem Cromatografia Líquida de Massachusetts para análise de metabolitos de<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Bioquímica

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Obtenção de dados de transcriptome de alta qualidade de sementes de cereal por um método modificado para criação de perfil de expressão genética

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Análise semiquantitativa de peptidoglicanos por cromatografia líquida, espectrometria de massas e bioinformática

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Perfil de compostos voláteis em frutas groselha usando microextração de fase sólida do headspace acoplado à espectrometria de massa de cromatografia gasosa

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...