Name: untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить программу стипендий премьер-министра Западной Австралии по сельскому хозяйству и продовольствию (Департамент рабочих мест, туризма, науки и инноваций, правительство Западной Австралии) и стипендиат премьер-министра, профессор Саймон Кук (Центр Цифровое сельское хозяйство, Университет Кертина и Университет Мердока). Полевые испытания и сбор образцов зерна были поддержаны правительством Программы роялти для регионов Западной Австралии. Мы признаем Грантли Стейнера и Роберта Френша за их вклад в полевые испытания. NCRIS финансируемых Bioplatforms Австралии признан для финансирования оборудования.

Этот метод подходит для 30 образцов (примерно 150 семян на образец). Здесь были использованы три биологических репликата десяти различных сортов пшеницы, выращенных на местах.
1. Приготовление зерновых
<ol><li>Извлекать образцы (целые зерна) из -80 градусов по Цельсию. ПРИМЕЧА?...

<ol>
	<li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+metabolomics:+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype.">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li><li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype,+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+(Triticum+durum+Desf.)+grain.">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li><li>Das, A., Kim, D. -. W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status.">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li><li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain.">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li><li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS/MS.">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li><li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics.">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li><li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients.">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li><li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis.">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li><li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li><li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies.">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).</li><li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+4.0:+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis.">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li><li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat.">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li><li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level.">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li><li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking.">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li><li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification.">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).</li></ol>

Здесь мы представляем метод нецелевой метаболомики на основе LC-MS для анализа зерна пшеницы. Метод сочетает в себе четыре режима приобретения (обратная фаза и липидно-подливающая обратная фаза с положительной и отрицательной ионизации) в два режима путем введения третьей мобильной фаз?...

Понимание взаимосвязей между генами, окружающей средой и практикой управления в сельском хозяйстве может позволить более точнопрогнозировать и управиться выходом и качеством продукции. Метаболиты растений зависят от таких факторов, как геном, окружающая среда (климат, осадки и т.д.), а в сельском хозяйстве управляется тем, как управляются сельскохозяйственные культуры (т.е. применение удобрений, фунгицидов и т.д.). В отличие от генома, метаболом находится под влиянием всех этих факторов и, следовательно, метаболомика данные обеспечивает биохимический отпечаток этих взаимодействий в определенное время. Есть, как правило, одна из двух целей для метаболомики на основе исследования: во-первых, для достижения более глубокого понимания биохимии организма и помочь объяснить механизм реагирования на возмущение (абиотических или биотических стресс) в отношении физиологии; и, во-вторых, связать биомаркеры с исследуемыми возмущениями. В обоих случаях результатом наличия этих знаний является более точная стратегия управления для достижения цели повышения размера и качества урожайности.
По прогнозам, метаболомрастение будет содержать тысячи1 малых молекул с разнообразными физикохимическими свойствами. В настоящее время никакие платформы метаболомики (преимущественно масс-спектрометрия и ядерная магнитно-резонансная спектроскопия) не могут зафиксировать весь метаболом в одном анализе. Разработка таких методов (подготовка образцов, метаболитная добыча и анализ), которые обеспечивают максимально большое покрытие метаболом, насколько это возможно в рамках одного аналитического запуска, является ключевой целью для исследователей метаболомики. Предыдущие нецелевые метаболомические анализы зерна пшеницы объединили данные из нескольких хроматографических разделений и закупочных полярностей и/или приборов для большего охвата метаболомами. Однако для этого необходимо подготовить и приобрести образцы отдельно для каждого метода. Например, Beleggia et al.2 подготовили производный образец для анализа полярных анализов GC-MS в дополнение к анализу GC-MS неполярных анализов неполярных анализов. Das et al.3 использовали как методы GC-, так и LC-MS для улучшения охвата в своих анализах; однако этот подход, как правило, требует отдельной выборочной подготовки, как описано выше, а также двух независимых аналитических платформ. Предыдущие анализы зерна пшеницы с использованием GC-MS2,,3,,4 и LC-MS3,,5 платформ дали от 50 до 412 (55 идентифицированных) особенностей для GC-MS, 409 для комбинированных GC-MS и LC-MS и несколько тысяч для анализа липидоми LC-MS5. Объединив по крайней мере два режима в единый анализ, расширенный охват метаболом может быть сохранен, увеличивая богатство биологического толкования, а также предлагая экономию как во времени, так и в стоимости.
Для обеспечения эффективного разделения широкого спектра липидных видов путем обратной фазы хроматографии, современные методологии липидоми обычно используют высокую долю изопропанола в растворителе elution6, обеспечивая удобство для липидных классов, которые в противном случае могли бы быть нерешенными хроматографии. Для эффективного разделения липидов, начиная передвижная фаза также гораздо выше в органическом составе7 чем типичные обратные методы хроматографических фаз, которые рассматривают другие типы молекул. Высокий органический состав в начале градиента делает эти методы менее подходящими для многих других классов молекул. В частности, обратная фаза жидкой хроматографии использует бинарный градиент растворителя, начиная с в основном водного состава и увеличивая органическое содержание по мере увеличения силы растворения хроматографии. С этой целью мы стремились объединить два подхода для достижения разделения как липидных, так и нелипидных классов метаболитов в рамках одного анализа.
Здесь мы представляем хроматографический метод, который использует третью мобильную фазу и позволяет комбинированную традиционную обратную фазу и соответствующий липидомике метод хроматографии с использованием одного образца подготовки и одной аналитической колонки. Мы приняли многие из мер по контролю качества и шагов фильтрации данных, которые ранее были реализованы в преимущественно клинических метаболомических исследованиях. Эти подходы полезны для определения надежных объектов с высокой технической воспроизводимостью и биологической репродукцией и исключают те, которые не отвечают этим критериям. Например, мы описываем повторный анализ объединенной выборки8, коррекции КК9, фильтрации данных9,,10 и вычисления отсутствующих функций11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13C6-sorbitol</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>605514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-aminoanthracene</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>A38800-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA955-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>516961-100 mL</td>
			<td>&#62;99.995%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analyst TF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro software</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalyzerPro XD sortware</td>
			<td>SpectralWorks Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance</td>
			<td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d6-transcinnamic acid</td>
			<td>Isotec</td>
			<td>513962-250 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td>
			<td>A2471-500 mL</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>7670031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td>
			<td>Velocity Scientific Solutions</td>
			<td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Installation kit for Sciex TripleToF</td>
			<td>Sciex</td>
			<td>p/n 4456736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA464-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory blender</td>
			<td>Waring commercial</td>
			<td></td>
			<td>Model HGBTWTS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine-enkephalin</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 700008842</td>
			<td>Tuning solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metaboanalyst</td>
			<td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td>
			<td></td>
			<td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBA456-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miconazole</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3512-1 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td>
			<td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>5426 No. 0021716</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td>
			<td>SSIbio</td>
			<td>1310-S0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Office Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peak View software</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td>Version 1.2 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NUN339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progenesis QI</td>
			<td>Nonlinear Dynamics</td>
			<td></td>
			<td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td>
			<td>Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium formate</td>
			<td>Merck Sigma-Aldrich</td>
			<td>456020-25 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue lyser/homogeniser</td>
			<td>Bertin Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Serial 0001620</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td>
			<td></td>
			<td>001722</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>FSBW6-4</td>
			<td>Optima LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water&#39;s Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>p/n 186005614</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

untargeted liquid chromatography-mass spectrometry-based metabolomics analysis of wheat grain

Понимание взаимосвязей между генами, окружающей средой и управлением в сельскохозяйственной практике может позволить более точнопрогнозировать и управить урожайность и качество продукции. Метаболомика данные обеспечивает чтение из этих взаимодействий в данный момент времени и информативным биохимического статуса организма. Кроме того, отдельные метаболиты или панели метаболитов могут быть использованы в качестве точных биомаркеров для прогнозирования и управления качеством. По прогнозам, метаболомрастение будет содержать тысячи мелких молекул с разнообразными физикохимическими свойствами, которые дают возможность биохимическому пониманию физиологических признаков и открытию биомаркеров. Чтобы использовать это, ключевой целью исследователей метаболомики является захват как можно больше физико-химического разнообразия в рамках одного анализа. Здесь мы представляем метод нецелевой метаболомики жидкой хроматографии-масс-спектрометрии для анализа пшеничного зерна, выращенного на местах. Метод использует менеджер растворителя каломатографа жидкостного хроматографа для введения третьей мобильной фазы и сочетает в себе традиционный градиент обратной фазы с липидно-податливым градиентом. Подробно описаны подготовка зерна, извлечение метаболита, инструментальный анализ и обработка данных. Наблюдалась хорошая точность массы и воспроизводимость сигнала, и метод дал около 500 биологически значимых функций в режиме ионизации. Кроме того, были определены значительно разные метаболитные и липидные сигналы между сортами пшеницы.

Метаболом растений влияет сочетание его генома и окружающей среды, а также в сельскохозяйственных условиях, режим управления сельскохозяйственными культурами. Мы демонстрируем, что генетические различия между сортами пшеницы можно наблюдать на уровне метаболита, з?...

Watch this Scientific Journal Video about Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain at JoVE.com

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Представлен метод нецелевого анализа метаболитов и липидов зерна пшеницы. Протокол включает в себя метод извлечения метаболита ацетонитрила и обратную фазовую методологию жидкой хроматографии-масс-спектрометрии, с приобретением в положительных и отрицательных режимах ионизации электроспрея.

Нецелевая жидкая хроматография-масс-спектрометрия на основе метаболомики Анализ зерна пшеницы

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

На метаболит влияют такие факторы, как геномная среда и методы управления. Понимание взаимодействия между этими факторами могло бы позволить более точно прогнозировать и управление урожайностью и качеством продукта. Путем включения третьей мобильной фазы, а не традиционных двух, этот метод позволяет разделение и обнаружение более широкого спектра метаболитов.Метаболомика может быть применена к любой области биологии. Во-первых, добиться более глубокого понимания биохимии организма и помочь объяснить их реакцию на абиотический или биотический стресс по отношению к физиологии. Во-вторых, связать биомаркеры с изучаемым возмущением.Поскольку изопропиловый спирт является вязким растворителем, его следует ввести при низкой скорости вспышки, а достаточное время эквилибрации используется до увеличения состава до 98%Эти шаги помешают хроматической графической системе перенапомиться, вернув ошибку или потенциально повредив аналитическую колонку. Чтобы начать подготовку зерна, используйте лабораторный блендер для измельчения зерна. Запустите блендер на высокой скорости в течение 20 секунд, а затем повторить.Снимите банку блендера с основания. Нажмите на сторону банки блендера, чтобы вывести любое крупнозернистое зерно на поверхность образца. Крупнозернистое зерно может быть выброшено или сохранено.Перенесите мелкозернистое зерно из блендера в двухми миллилитровую пластиковую микро центрифугу. В тот же день, что и добыча, подготовь растворитель извлечения, как описано в рукописи. Затем взвесим 200 миллиграммов мелкозернистого зерна в двухми миллилитровую микро центрифугу.Добавьте 500 микролитров растворителя экстракции к зерну в трубке. Кроме того, подготовьте пробел, добавив 500 микролитров растворителя экстракции в пустую трубку. Используя гомогенизатор, установленный при 6500 об/мин, смешайте растворитель и зерно в течение 20 секунд.Затем повторите еще 20 секунд. Затем центрифуга трубки при четырех градусах по Цельсию и 16, 100 раз G, в течение пяти минут. Перенесите супернатант в двухми миллилитровую пластиковую трубку и сохраните гранулы.Повторите процесс экстракции на гранулы дважды. Объедините три супернатанта, что даст общий объем экстракта около 1,5 миллилитров и смешайте вихрем. Чтобы сделать объединили образец всех зерновых экстрактов, которые будут использоваться для контроля качества, перенесите 55 микролитров каждого экстракта зерна в двухми миллилитровую трубку и вихрь.Затем перенесите 50 микролитров алицитов этого слитка в стеклянные флаконы. Перенесите 50-микролитерную алицита каждого экстракта образца зерна на стеклянные флаконы. Как описано в рукописи, подготовь решения, которые будут необходимы для жидкой хроматографии масс-спектрометрии.В день анализа LCMS, подготовить 100 миллилитров 5%ацетонитрил, содержащий 200 нанограмм на миллилитр лейцин энкефалин. Добавьте 950 микролитров этого раствора в стеклянный флакон, содержащий 50 микролитров алицита экстракта зерна. Смешайте содержимое во флаконе вихрем.Во-первых, найте калибровку инструментов, описанных в рукописи, и руководство пользователя производителя. Далее, очистить и промыть систему жидкости LC с помощью LCMS класса растворителей, в том числе мобильных фаз и мыть растворителей. Equilibrate системы LC с использованием LC метод стартовых условий, гарантируя, что давление столбца стабилизировалась.Настройка таблицы последовательности инструментов. Ввините formate натрия в начале последовательности образца для проверки калибровки инструмента. Сначала проанализируйте растворительные и препаративные пробелы, затем объединили образцы контроля качества для системного кондиционирования, а затем рандомизированный список образцов.Регулярно запускаем образцы контроля качества в качестве технических репликаций. Вы запустите два образца контроля качества в конце последовательности. Пока последовательность работает, проверьте качество данных, включая как внутреннюю стандартную точность массы, так и воспроизводимость сигнала.Для проверки воспроизводимости сигнала достаточно визуального осмотра наложенных спектров. В раствор, используемый для подготовки зерновых экстрактов, были включены четыре внутренних стандарта. Во время LCMS наблюдалась хорошая точность массы и единая воспроизводимость внутренних стандартов как для положительных, так и для отрицательных режимов ионизации.На основе анализа заготовок 421 сигнал в негативном режиме и 835 сигналов в положительном режиме были судились артефактами. Эти сигналы присутствовали в заготовки при интенсивности, равной или более 5% от средней одной интенсивности в образцах зерна. После удаления артефактов и дальнейшей фильтрации данных негативный режим вернул 483 функции и положительный режим вернул 523 функции.Приблизительно 250 особенностей были биологически актуальными и значительно отличались по интенсивности по сортам пшеницы. Важно помнить о мерах контроля качества, таких как включение в этот протокол готовых пробелов, внутренних стандартов и унижаемых образцов.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Тандем жидкостной хроматографии на основе подхода для анализа метаболитов<em&gt; Золотистый стафилококк</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

Глубокая протеома профилирование Изобарический маркировки, обширные жидкостная хроматография, масс-спектрометрии и при содействии программного обеспечения количественной оценки

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Получение высококачественных транскриптомных данных из зерновых семян с помощью модифицированного метода профилирования экспрессии генов

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Полуколичественный анализ пептидогликана методами жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии и биоинформатики

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Протеомический подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Profiling Volatile Compounds in Blackcurrant Fruit using Headspace Solid-Phase Microextraction Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

Профилирование летучих соединений в плодах черной смородины с использованием твердофазной микроэкстракции в сочетании с газовой хроматографией-масс-спектрометрией

There is an increasing interest in measuring volatile organic compounds (VOCs) emitted by ripe fruits for the purpose of breeding varieties or cultivars ...