Name: stimulation of stem cell niches and tissue regeneration in mouse skin by switchable protoporphyrin ix-dependent photogeneration of reactive oxygen species in situ
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In

Ce travail a été soutenu par des subventions du Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 à JE) et de l’Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 to JE) d’Espagne. EC a été soutenu par la subvention Atracción de Talento Investigador 2017-T2 / BMD-5766 (Comunidad de Madrid et UAM).

Toutes les procédures d’élevage et d’expérimentation de souris doivent être menées conformément à la législation locale, nationale et internationale et aux directives sur l’expérimentation animale.
1. Induction de la croissance des cheveux, induction de brûlures et identification des LRC BrdU à long terme dans l’épithélium de la peau de la queue
REMARQUE : Utilisez des souris C57BL/6 âgées de 10 ou 7 semaines, de préférence des compagnons de p...

<ol>
	<li>Bl&#225;zquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+1O2+optical+excitation:+A+tool+for+redox+biology.">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li><li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease.">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li><li>Sena, L. A., Chandel, N. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li><li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K/Akt-Dependant+Manner.">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li><li>Myant, K. 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C., Li, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+interactions+between+skin+stem+cells+and+their+niches.">Emerging interactions between skin stem cells and their niches.</a> Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).</li><li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells+and+implications+for+wound+repair.">Epithelial stem cells and implications for wound repair.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).</li></ol>

Ici, nous présentons une méthodologie qui permet une activation transitoire de la production endogène de ROS in vivo dans la peau de souris avec des effets physiologiques. La méthodologie est basée sur une procédure photodynamique pour induire une stimulation contrôlée et locale du photosensibilisateur endogène PpIX (Figure 1B). Cette approche expérimentale est un outil intéressant pour étudier la biologie des ROS dans des systèmes expérimentaux in vivo constituant une avancée...

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont le résultat de la réduction chimique de l’oxygène moléculaire pour former de l’eau et comprennent l’oxygène singulet, l’anion superoxyde, le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle 1,2,3. Les ROS ont une durée de vie très courte en raison de leur nature extrêmement réactive chimique. Dans les organismes aérobies, les ROS sont fortuitement formés à l’intérieur des cellules en tant que sous-produit perméable majeur de la respiration aérobie (chaîne de transport d’électrons) dans les mitochondries. L’accumulation transitoire de niveaux élevés de ROS dans la cellule entraîne une condition de stress oxydatif qui peut provoquer l’inactivation irréversible des protéines, des lipides et des sucres et l’introduction de mutations dans la molécule d’ADN 2,3,4,5. L’accumulation progressive de dommages oxydatifs dans les cellules, les tissus et les organismes entiers augmente régulièrement avec le temps et a été associée à l’induction de programmes de mort cellulaire, à plusieurs pathologies et au processus de vieillissement 2,3,4,6.
Les organismes aérobies ont régulièrement développé des mécanismes moléculaires efficaces pour lutter contre l’accumulation excessive de ROS dans les cellules et les tissus. Ces mécanismes comprennent des membres de la famille des protéines superoxyde dismutase (SOD), qui catalysent la dismutation radicalaire superoxyde en oxygène moléculaire et en peroxyde d’hydrogène, ainsi que différentes catalases et peroxydases qui utilisent le pool antioxydant (glutathion, NADPH, peroxyrédoxine, thiorédoxine 7,8) pour catalyser la conversion ultérieure du peroxyde d’hydrogène en eau et en oxygène moléculaire.
Cependant, plusieurs rapports soutiennent le rôle des ROS en tant que composants clés des circuits moléculaires qui régulent les fonctions cellulaires critiques, y compris la prolifération, la différenciation et la mobilité 2,3,4. Ce concept est également soutenu par l’identification initiale et la caractérisation de mécanismes dédiés à la production de ROS dans les organismes aérobies, y compris les lipoxygénases cyclooxygénases et les NADPH oxydases 9,10. En ce sens, les ROS jouent un rôle actif dans le développement des embryons de vertébrés 11,12,13 et des rôles clés pour ces molécules dans la régulation de fonctions physiologiques in vivo spécifiques ont été rapportés dans différents systèmes expérimentaux, y compris le programme de différenciation des progéniteurs hématopoïétiques chez Drosophila14, l’induction de guérison chez le poisson zèbre ou la régénération de la queue chez les têtards Xenopus 15. Chez les mammifères, les ROS ont été impliqués dans le potentiel d’auto-renouvellement / différenciation des cellules souches neurales dans un modèle de neurosphère16 et dans la dérégulation de la fonction des cellules souches intestinales lors de l’initiation du cancer colorectal17. Dans la peau, la signalisation ROS a été associée à la différenciation épidermique et à la régulation de la niche des cellules souches cutanées et du cycle de croissance du follicule pileux18,19.
Dans cette perspective, une limitation expérimentale majeure pour déterminer les rôles physiologiques des ROS dans les systèmes biologiques, à la fois dans des conditions normales ou pathologiques, est le manque d’outils expérimentaux adéquats pour induire une production contrôlée de ces molécules dans les cellules et les tissus, ressemblant précisément à leur production physiologique en tant que seconds messagers de signalisation. À l’heure actuelle, la plupart des approches expérimentales impliquent l’administration de ROS exogènes, principalement sous forme de peroxyde d’hydrogène. Nous avons récemment mis en œuvre une approche expérimentale pour activer une production in vivo transitoire et non létale de ROS endogènes dans la peau de souris, basée sur l’administration de précurseurs de la protoporphyrine IX photosensibilisante endogène (PpIX; par exemple, l’acide aminolaevulinique ou son dérivé méthylique méthylaminolévulinate) et une irradiation supplémentaire de l’échantillon avec de la lumière rouge pour induire la formation in situ de ROS à partir d’oxygène moléculaire intracellulaire (Figure 1). Cette procédure photodynamique peut être utilisée efficacement pour stimuler les niches de cellules souches résidentes, activant ainsi les programmes de régénération du tissu19,20 et ouvrant la voie à de nouvelles modalités thérapeutiques en médecine régénérative de la peau. Ici, nous présentons une description détaillée du protocole, montrant des exemples représentatifs de stimulation des niches de cellules souches, mesurée comme une augmentation du nombre de cellules retenant marquées à long terme de la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) dans la région du renflement du follicule pileux19,21, et l’activation ultérieure des programmes de régénération (accélération de la croissance des cheveux et processus de guérison des brûlures) induite par transitoire, production non létale de ROS dans la peau de la souche de souris C57Bl6.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="811">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescin diacetate</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">D6883-50MG</td>
			<td style="width:161px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">5&#39;-bromo-2&#39;-deoxiuridine</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">B5002-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein</td>
			<td style="width:104px;">Roche</td>
			<td>11202693001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Depilatory cream (e.g., Veet)</td>
			<td style="width:104px;">Veet</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Dihydroethidium</td>
			<td style="width:104px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>37291-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">In Vivo imaging system, e.g., IVIS Lumina 2</td>
			<td style="width:104px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:432px;">mALA in the form of topical cream, e.g.,METVIX Crema 160 mg/g</td>
			<td style="width:104px;">Galderma</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Power energy meter (e.g., ThorLabs Model PM100D)</td>
			<td style="width:104px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:432px;">Red light source, e.g., 636 nm Aktilite LED lamp</td>
			<td style="width:104px;">Photocure ASA</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stimulation of stem cell niches and tissue regeneration in mouse skin by switchable protoporphyrin ix-dependent photogeneration of reactive oxygen species in situ

Ici, nous décrivons un protocole pour induire une photogénération in vivo commutable d’espèces réactives endogènes de l’oxygène (ROS) dans la peau de souris. Cette production transitoire de ROS in situ active efficacement la prolifération cellulaire dans les niches de cellules souches et stimule la régénération tissulaire comme en témoigne fortement l’accélération des processus de cicatrisation des brûlures et de croissance des follicules pileux. Le protocole est basé sur un traitement photodynamique réglable qui traite le tissu avec des précurseurs de la protoporphyrine IX photosensibilisante endogène et irradie davantage le tissu avec de la lumière rouge sous des paramètres physico-chimiques étroitement contrôlés. Dans l’ensemble, ce protocole constitue un outil expérimental intéressant pour analyser la biologie ROS.

L’administration topique du précurseur mALA dans le dos et la peau de la queue de souris entraîne une accumulation significative de PpIX dans l’ensemble du tissu et, en particulier, dans le follicule pileux, comme le démontre la fluorescence rose rougeâtre de ce composé sous excitation en lumière bleue (407 nm) (Figure 2A,C). L’irradiation ultérieure du tissu traité avec une lumière rouge (636 nm) à une fluence de 2,5−4 J/cm2 favorise la producti...

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Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

L’objectif de ce protocole est d’induire une production transitoire in vivo de niveaux non létaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans la peau de souris, favorisant ainsi les réponses physiologiques dans les tissus.

Stimulation de niches de cellules souches et régénération tissulaire dans la peau de souris par photogénération commutable d’espèces réactives de l’oxygène dépendantes de la protoporphyrine IX in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

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