Name: validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail, og Marietjie Pretorius ved University of Cape Town Lung Institute, der lettede indsamlingen af hår prøver til undersøgelsen. Forfatterne anerkender endvidere taknemmeligt bidragene fra deltagerne i denne undersøgelse.

Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke forud for indsamling af hårprøver. Vi fik Institutional Review Board godkendelse fra University of Cape Town og University of California, San Francisco.
1. Hår prøveudtagning
<ol><li>Indhente skriftligt informeret samtykke.</li>
	<li>Brug ren saks til at skære ca 20-30 hovedbund hår tråde fra occipital regionen så tæt på hovedbunden som muligt.</li>
	<li>Placer tape omkring den distale side af håret for at angive retningsbestemthed...

<ol>
	<li>Kurbatova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+poor+outcomes+among+patients+treated+for+multidrug-resistant+tuberculosis+at+DOTS-plus+projects.">Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Respiratory Medicine. , (2017).</li><li>Berg, K. M., Arnsten, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+and+conceptual+challenges+in+measuring+antiretroviral+adherence.">Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence.</a> Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).</li><li>Kagee, A., Nel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+association+between+self-report+items+for+HIV+pill+adherence+and+biological+measures.">Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures.</a> AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).</li><li>Haberer, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+to+antiretroviral+prophylaxis+for+HIV+prevention:+a+substudy+cohort+within+a+clinical+trial+of+serodiscordant+couples+in+East+Africa.">Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa.</a> PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).</li><li>Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+stop+counting+the+tablets.">Time to stop counting the tablets.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+study+of+multiple+measures+of+adherence+to+HIV+protease+inhibitors.">A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors.</a> Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).</li><li>Wendel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+use+of+electronic+adherence+monitoring+in+an+HIV+clinic.">Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic.</a> Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).</li><li>Ruiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+voriconazole+plasma+concentrations+on+treatment+response+in+critically+ill+patients.">Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutic. , (2019).</li><li>Saktiawati, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+sampling+strategies+for+therapeutic+drug+monitoring+of+first-line+tuberculosis+drugs+in+patients+with+tuberculosis.">Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis.</a> Clinical Phamacokinetics. , (2019).</li><li>Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="White+coat+compliance"+limits+the+reliability+of+therapeutic+drug+monitoring+in+HIV-1-infected+patients.">"White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients.</a> HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).</li><li>Cuypers, E., Flanagan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interpretation+of+hair+analysis+for+drugs+and+drug+metabolites.">The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites.</a> Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).</li><li>Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+for+drug+detection.">Hair analysis for drug detection.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).</li><li>Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair:+a+complementary+source+of+bioanalytical+information+in+forensic+toxicology.">Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology.</a> Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atazanavir+concentration+in+hair+is+the+strongest+predictor+of+outcomes+on+antiretroviral+therapy.">Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy.</a> Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).</li><li>Koss, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+concentrations+of+antiretrovirals+predict+viral+suppression+in+HIV-infected+pregnant+and+breastfeeding+Ugandan+women.">Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women.</a> AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).</li><li>Pintye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+Lopinavir+Hair+Concentrations+Are+the+Strongest+Predictor+of+Viremia+in+HIV-Infected+Asian+Children+and+Adolescents+on+Second-Line+Antiretroviral+Therapy.">Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).</li><li>Baxi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nevirapine+Concentration+in+Hair+Samples+Is+a+Strong+Predictor+of+Virologic+Suppression+in+a+Prospective+Cohort+of+HIV-Infected+Patients.">Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients.</a> PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+concentrations+in+hair+strongly+predict+virologic+response+in+a+large+HIV+treatment-naive+clinical+trial.">Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial.</a> Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).</li><li>Gerona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+11+medications+for+drug+resistant+TB+in+small+hair+samples+to+quantify+adherence+and+exposure+using+a+validate+LC-MS/MS+panel.">Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel.</a> Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).</li><li>Metcalfe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+anti-tuberculosis+drug+concentration+in+hair+and+treatment+outcomes+in+MDR-+and+XDR-TB.">Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB.</a> European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).</li><li>Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Beyond+Directly+Observed+Therapy+for+Tuberculosis.">Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis.</a> PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).</li></ol>

Vi rapporterer her protokollen for den metode, vi udviklede og validerede til kvantificering af 11 anti-TB medicin, der anvendes til behandling af DR-TB i små hårprøver ved hjælp af LC-MS/MS. Ingen anden metode til kvantificering af disse 11 lægemidler i hår er tidligere blevet udviklet, valideret og offentliggjort. Vores metode kan kvantificere sub-nanogram niveauer af narkotika i kun 20-30 hår tråde på ca 3 centimeter (cm) i længden (~ 2 mg) og er allerede blevet valideret22. Den lave ...

I det enogtyvende århundrede, resistente TB (DR-TB) er en udvikling katastrofe for allerede svage nationale TB kontrolprogrammer, med bekræftede tilfælde fordobling i de seneste 5 år alene, tegner sig for næsten en tredjedel af alle dødsfald i forbindelse med antimikrobiel resistens globalt1,2. Vellykket behandling af DR-TB har konventionelt krævet længere og mere giftige andenlinjeregimer end behandling for lægemiddelfølsom TB. Desuden har patienter med DR-TB ofte betydelige allerede eksisterende udfordringer med hensyn til overholdelse, hvilket bidrog til fremkomsten af resistens i første omgang3.
I modsætning til hiv-infektion, hvor virusbelastninger kan anvendes til at overvåge behandlingen, er surrogatendepunkter for behandlingsrespons i TB forsinket og upålidelige på individuelt niveau4. Overvågning af patientens overholdelse, en vigtig prædiktor for subterapeutisk anti-TB lægemiddelkoncentration og behandlingssvigt, er også udfordrende. Selvrapporteret overholdelse lider af tilbagekaldelse bias og ønsket om at behage udbydere5,6. Pilletællinger og systemer til overvågning af medicinhændelser (MEMS) kan være mere mål7, men måler ikke det faktiske narkotikaforbrug8,9,10. Drug niveauer i biomatrices kan give både overholdelse og farmakokinetiske data. Derfor er plasma stof niveauer almindeligt anvendt i terapeutisk stof overvågning11,12. I forbindelse med overvågning af lægemiddeloverholdelse repræsenterer plasmaniveauer imidlertid kortvarig eksponering og er begrænset af signifikant e-variation mellem og mellem patienten, når der fastlægges et passende referenceinterval for overholdelse. "White coat" effekter, hvor overholdelse forbedres forud for klinik eller studiebesøg, yderligere komplicerer muligheden for plasma niveauer til at give nøjagtige stof overholdelse mønstre13.
Hår er en alternativ biomatrix, der kan måle langtidseksponering af lægemidler14,15. Mange lægemidler og endogene metabolitter indarbejde i håret protein matrix fra den systemiske omsætning som hår vokser. Da denne dynamiske proces fortsætter under hårvækst, mængden af narkotika deponeret i håret matrix afhænger af den fortsatte tilstedeværelse af stoffet i omløb, hvilket gør håret en fremragende tidsmæssig udlæsning af stofindtag. Hår som en biomatrix har den ekstra fordel at være let indsamlet uden behov for kølekæde til opbevaring og forsendelse i forhold til blod. Desuden hår er ikke-biofarligt, hvilket giver yderligere gennemførlighedsfordele på området.
Hår narkotika niveauer har længe været brugt i retsmedicinske applikationer16. I løbet af de sidste ti år har hår antiretrovirale (ARV) niveauer vist nytte i vurderingen af narkotika overholdelse i hiv-behandling og forebyggelse, som vores gruppe bidraget. ARV-niveauet i håret har vist sig at være de stærkeste uafhængige prædiktorer for behandlingsresultater ved hiv-infektion17,18,19,20,21. For at afgøre, om hårniveauer af DR-TB patienter vil have samme nytte i at forudsige behandlingsresultatet, brugte vi LC-MS/MS til at udvikle og validere en metode til analyse af 11 DR-TB medicin i små hårprøver. Som en indledende vurdering af analysens ydeevne målte vi DR-TB-medicinniveauet i en praktisk prøve af patienter med DR-TB, der fik direkte observeret behandling (DOT) i Western Cape, Sydafrika22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:755px;" width="755">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5182-0716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250 uL injection vial inserts</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead ruptor 24</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline-d6</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine-d7</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable lime glass culture tubes</td>
			<td style="width:211px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">60825-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">E890420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">ClearSynth</td>
			<td>CS-O-06597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F0507-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">1395-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot Shaker</td>
			<td style="width:211px;">Bellco Glass Inc</td>
			<td style="width:161px;">7746-32110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">Infinity 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">230-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:211px;">Aqua Solutions Inc</td>
			<td style="width:161px;">W1089-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">I821450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>I821452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">00D-4371-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-8788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge holder</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC-MS/MS quantitation software</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Multiquant 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR">1362103-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin-d8</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L360002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid-d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:211px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:161px;">695554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin-13C, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">M745003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS/MS</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Triple Quad 5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPC 14714</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>O667600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pretomanid (PA-824)</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:161px;">P122500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Prothionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prothionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide-15N, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Septum caps for injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5185-5862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbovap LV evaporator</td>
			<td style="width:211px;">Biotage</td>
			<td style="width:161px;">103198/11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples

Lægemiddelresistent tuberkulose (DR-TB) er en voksende trussel mod folkesundheden, og vurdering af terapeutiske lægemiddelniveauer kan have betydelige kliniske fordele. Plasma stof niveauer er den nuværende guld standard vurdering, men kræver phlebotomi og en kold kæde, og fange kun meget nylig tilslutning. Vores metode bruger hår, en matrix, der er let indsamlet og afspejler langsigtet overholdelse, at teste for 11 anti-TB medicin. Tidligere arbejde af vores gruppe viser, at antiretrovirale lægemiddelniveauer i hår er forbundet med hiv-resultater. Vores metode til DR-TB narkotika bruger 2 mg hår (3 cm proksimalt til roden), som er pulveriseret og ekstraheret i methanol. Prøver analyseres med en enkelt LC-MS/MS-metode, kvantificere 11 lægemidler i en 16 min køre. Nedre grænser for kvantificering (LLOQs) for de 11 lægemidler spænder fra 0.01 NG/mg til 1 ng/mg. Narkotika tilstedeværelse bekræftes ved at sammenligne nøgletal af to massespektrometri overgange. Prøver kvantificeres ved hjælp af området forholdet mellem stoffet til deuterated, 15N-, eller 13C-mærket stof isotopologue. Vi brugte en kalibreringskurve fra 0,001 til 100 NG/mg. Anvendelse af metoden på en praktisk prøve af hårprøver indsamlet fra DR-TB patienter på direkte observeret behandling (DOT) angivet lægemiddelniveauer i hår inden for den lineære dynamikområde af ni af de elleve lægemidler (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimin, bedaquiline, pretomanid). Ingen patient var på prothionamid, og de målte niveauer for ethionamid lå tæt på lloq -niveauet (i stedet for yderligere arbejde, der undersøgte egnetheden af ethionamids metabolit til overvågning af eksponering). Sammenfattende beskriver vi udviklingen af et multi-analytpanel til DR-TB-lægemidler i hår som en teknik til terapeutisk lægemiddelovervågning under lægemiddelresistent TB-behandling.

Figur 1viser en illustration af et kromatogram med bekræftede niveauer af alle 11 DR-TB-lægemidler . Opbevaringstiden for hver analysand kan ændre sig, når der anvendes forskellige instrumenter og kolonner, så den nøjagtige opbevaringstid skal bestemmes individuelt.
De ekstraherede Ion Chromatogrammer (EIC) for et bestemt lægemiddel (isoniazid, INH) i en af kalibratorerne (blank hårprøve tilsat DR-TB lægemiddelreferencestandarder) er vist i <strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

De nuværende metoder til analyse af patienternes overholdelse af komplekse resistente tuberkulose (DR-TB) regimer kan være unøjagtige og ressourcekrævende. Vores metode analyserer hår, en let indsamlet og lagret matrix, for koncentrationer af 11 DR-TB medicin. Ved hjælp af LC-MS/MS, Vi kan bestemme sub-nanogram narkotika niveauer, der kan udnyttes til bedre at forstå narkotika overholdelse.

Valideret LC-MS/MS Panel til kvantificering af 11 resistente TB-medicin i små hårprøver

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Patientens overholdelse er meget udfordrende og lægemiddelmetabolisme kan variere person til person, så objektiv måling af narkotikaniveauer kan vise sig at være vigtigt for at forhindre fremkomsten af resistens under TB behandling. Hvis overholdelse kunne være mere præcist og let kvantificeres, så sundhedspersonale kunne udvikle en behandlingsplan, der ville begrænse udviklingen af resistens over for lægemidler. Vi har udviklet den første flere analysand massespektrometri panel for flere TB medicin inden for små hår prøver i en enkelt analyse.Vores multi-drug panel kræver kun en to-milligram prøve per patient og bruger hverken fast fase ekstraktion eller filtrering skridt for at forhindre tab af prøve volumen. Objektive målinger af lægemiddeleksponering målt tidligt i behandlingsforløbet kan potentielt advare klinikere om problemer med individuelle lægemidler i behandlingsregimet. Hårprøver skal pulveriseres på analysedagen for en nøjagtig måling af lægemiddelkoncentrationsniveau.At erhverve hår prøver, efter at have fået skriftlig informeret samtykke, få materialer klar, herunder en tynd etiket, to deltager etiketter, en saks, en udfoldet stykke aluminiumsfolie, en alkohol tørre og en plastikpose. Tør knivene på saksen ren med en alkoholserviet. Gå til bagsiden af hovedet og løft den øverste del af håret ved hjælp af et hår klip, hvis det ønskes.Saml 30 hårstrå fra bagsiden af hovedet og isoler stråtækken med hånden. Tag saksen ned til hovedbunden og skær stråtækt af hår. Placer forsigtigt stråtækken af hår på aluminiumsfolien.Sæt den tynde etiket over den distale ende af håret stråtæk, tape det sikkert til aluminiumsfolie. Den distale ende er den side længst væk fra hovedbunden. Fold over det stykke aluminiumsfolie på toppen af håret stråtækt og sætte en deltager etiket på toppen af aluminiumsfolie.Placer foldet over stykke aluminiumsfolie i plastikposen og læg en anden deltager etiket på toppen af plastikposen. For stof ekstraktion fra hårprøver, afveje to milligram af hver hårprøve i individuelt mærket perle rør og to milligram af den tomme hår prøve i hver af 16 ekstra perle rør. Efter vejning anbringes alle perlerørene i en perlefræsningshomogenisator, og prøverne homogeniseres med en hastighed på 6,95 meter pr. sekund i to 30-sekunders cyklusser med en hvileperiode på 15 sekunder mellem hver cyklus.Efter den anden homogenisering tilsættes 500 mikroliter af den relevante interne standardblanding til hver prøve, og der tilsættes 500 mikroliter methanol til matrix blankrøret. Kalibreringskurverørene spikes med det passende volumen af referencestandardblanding i henhold til bordet, og alle rørene anbringes i et 37 graders vandbad med let omrystning i to timer. Ved slutningen af inkubationen overføres supernatanten fra hvert perlerør til nye mærkede mikrocentrifugerør, og der tilsættes 500 mikroliter methanol til perlerørene.Vortex perlerørene og overføre methanol vask til de tilsvarende mikrocentrifuge rør. Centrifuge prøverne og forsigtigt overføre supernatanter i nye rør uden at forstyrre håret pellets. Fordamp væsken i rørene til tørhed ved 32 grader Celsius og rekonstituere prøverne med 200 mikroliter af højtryks flydende kromatografi grade vand med 1% myresyre.Efter vortexing overføres væskeprøverne til gule hætteglas med 250 mikroliterindsatser. For flydende kromatografi tandem massespektrometri, først installere en to til 100 millimeter kolonne med en 2,5 mikrometer partikelstørrelse og 100 angstrom pore størrelse med polar-endcapped etherlinked phenol perler fuldt lavet af porøse silica i kolonnen rummet. Bekræft, at kolonnen også har en producent anbefalet beskyttelsespatron installeret.Kopier og indsæt de sammensatte oplysninger, der er inkluderet i MDR-TB LCMS-metodens overgange. csv fil i boksen i massen spec vinduet. I et regneark skal du oprette en batchsekvens af kalibreringskurven, kvalitetskontrol, patientprøver, kalibreringskurve, kvalitetskontrol, patientprøver, kalibreringskurve og kvalitetskontrol.Der tilsættes blanke opløsningsmiddelinjektninger i starten og slutningen af kørslen samt før og efter kalibreringskurven, kvalitetskontrol og patientprøver. Anbring derefter mindst otte blanke opløsningsmiddelinjektninger i injektionerne i kalibreringskurven og hætteglasset med høj kvalitet for at reducere analysandoverførslen. Når batcherne er fuldført, skal du åbne kvantiseringssoftwaren.Rul gennem overgange for at sikre, at den automatisk valgte opbevaringstid er nøjagtig, og kontroller, at den gaussiske udjævning er indstillet til 1,5. Klik derefter på viser kalibreringskurven og regressionen, og angiv ventetypen til en over x. Klik på OK, og valider kalibreringskurven og kvalitetskontrolprøverne for at sikre, at batchen kørte korrekt.For hver referenceanalyt skal mindst to tredjedele af kalibreringspunkterne have en nøjagtighed på 80-120 %Kontroller, at den R-værdi, der vises over kalibreringskurven, er større end 0,975. Hvis alle ovenstående betingelser er opfyldt, er partiet bestået, og prøverne kan kvantificeres. Klik på Rediger på værktøjslinjen, og klik på Kopiér hele tabellen.Indsæt derefter tabellen i et regneark, og brug gennemsnittet af den beregnede koncentration af de to prøveinjektints til at bestemme den rapporterede koncentration af hver prøve. Her er vist en illustration af et kromatogram med bekræftede niveauer af alle testede 11 resistente TB narkotika. I disse tal kan de ekstraherede ionkromatogrammer for et bestemt lægemiddel i en af kalibratorerne observeres.Kvantificeringen og kvalifikationskamp overgange bruges til kvalitativt at bekræfte tilstedeværelsen af lægemidlet som forholdet mellem området af kvantificeringen og det område af kvalifikationskamp forbliver konstant på tværs af prøver. Den interne standard overvåges også for at sikre, at hver prøveinjektion normaliseres. I denne analyse, en bekvem prøve på 15 hårprøver blandt en samlet undersøgelse befolkning på 96 patienter, der tager resistente TB medicin under direkte observerede behandling betingelser fra Western Cape, Sydafrika blev evalueret for at bestemme repræsentative niveauer af resistente TB narkotika på tværs af de laveste og højeste niveauer for hver analysand.Hvis der ikke er tale om et fast faseudsugnings- eller filtreringstrin, skal du være forsigtig, når supernatanten overføres til fordampningsrørene. Alt, hvad der overføres til rørene, kan ende med at blive sprøjtet ind i kolonnen. Da rotoren på perlerovroven kan flyve af, hvis den ikke er stramt skruet eller låst, skal du sørge for at dobbelttjekke rotoren, før den tages i brug.I modsætning til antiretrovirale lægemidler inden for hiv, forholdet mellem TB medicin farmakokinetik, overholdelse og kliniske resultater er stort set ustuderet. Vi har en hypotese, at nogle TB medicin ikke ophobes godt i håret. Målretning metabolitter af disse lægemidler kan give en bedre forståelse af patientens overholdelse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokol for Long Duration Whole Body Hypertermi i mus

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopisk tyndtarmstransplantation i rotter

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kvantificering af det immunsuppressive Tacrolimus om Tørrede blodpletter ved LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Approach for the Administration of Medications and Fluids in Emergency Scenarios and Settings

En ny tilgang til administration af medicin og væsker i nødsituationer og indstillinger

The available routes of administration commonly used for medications and fluids in the acute care setting are generally limited to oral, intravenous, or ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Netværk Analyse af foramen ovale elektrode Optagelser i Drug-resistent TLE Patienter

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nerve-besparende Mid-urethral obstruktion (NEMO) i kvindelige lille Gnavere

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metode til kvantificering Upper Limb Performance i min hverdag anvender accelerometre

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimeret LC-MS/MS metoden til høj overførselshastighed analyse af kliniske prøver af Ivacaftor, dets vigtigste metabolitter, og Lumacaftor i biologiske væsker af cystisk fibrose patienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluering af fraktur Callus udvikling under knogleheling i mus ved hjælp af en Mr-kompatible osteosyntese enhed for musen lårben

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

Smag eksamen: En kort og validerede Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...