Name: validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Les auteurs tient à remercier le professeur Keertan Dheda, le Dr Ali Esmail et Marietjie Pretorius de l’Institut pulmonaire de l’Université du Cap qui ont facilité la collecte d’échantillons de cheveux pour l’étude. Les auteurs reconnaissent également avec gratitude les contributions des participants à cette étude.

Tous les patients ont fourni un consentement éclairé écrit avant la collecte d’échantillons de cheveux. Nous avons obtenu l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université du Cap et de l’Université de Californie à San Francisco.
1. Échantillonnage des cheveux
<ol><li>Obtenir un consentement éclairé écrit.</li>
	<li>Utilisez des ciseaux propres pour couper environ 20-30 mèches de cheveux du cuir chevelu de la région occipitale aussi près du cuir chevelu ...

<ol>
	<li>Kurbatova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+poor+outcomes+among+patients+treated+for+multidrug-resistant+tuberculosis+at+DOTS-plus+projects.">Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Respiratory Medicine. , (2017).</li><li>Berg, K. M., Arnsten, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+to+antiretroviral+prophylaxis+for+HIV+prevention:+a+substudy+cohort+within+a+clinical+trial+of+serodiscordant+couples+in+East+Africa.">Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa.</a> PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).</li><li>Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+stop+counting+the+tablets.">Time to stop counting the tablets.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+study+of+multiple+measures+of+adherence+to+HIV+protease+inhibitors.">A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors.</a> Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).</li><li>Wendel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+use+of+electronic+adherence+monitoring+in+an+HIV+clinic.">Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic.</a> Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).</li><li>Ruiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+voriconazole+plasma+concentrations+on+treatment+response+in+critically+ill+patients.">Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutic. , (2019).</li><li>Saktiawati, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+sampling+strategies+for+therapeutic+drug+monitoring+of+first-line+tuberculosis+drugs+in+patients+with+tuberculosis.">Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis.</a> Clinical Phamacokinetics. , (2019).</li><li>Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="White+coat+compliance"+limits+the+reliability+of+therapeutic+drug+monitoring+in+HIV-1-infected+patients.">"White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients.</a> HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).</li><li>Cuypers, E., Flanagan, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+concentrations+of+antiretrovirals+predict+viral+suppression+in+HIV-infected+pregnant+and+breastfeeding+Ugandan+women.">Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women.</a> AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).</li><li>Pintye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+Lopinavir+Hair+Concentrations+Are+the+Strongest+Predictor+of+Viremia+in+HIV-Infected+Asian+Children+and+Adolescents+on+Second-Line+Antiretroviral+Therapy.">Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).</li><li>Baxi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nevirapine+Concentration+in+Hair+Samples+Is+a+Strong+Predictor+of+Virologic+Suppression+in+a+Prospective+Cohort+of+HIV-Infected+Patients.">Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients.</a> PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+concentrations+in+hair+strongly+predict+virologic+response+in+a+large+HIV+treatment-naive+clinical+trial.">Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial.</a> Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).</li><li>Gerona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+11+medications+for+drug+resistant+TB+in+small+hair+samples+to+quantify+adherence+and+exposure+using+a+validate+LC-MS/MS+panel.">Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel.</a> Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).</li><li>Metcalfe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+anti-tuberculosis+drug+concentration+in+hair+and+treatment+outcomes+in+MDR-+and+XDR-TB.">Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB.</a> European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).</li><li>Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Beyond+Directly+Observed+Therapy+for+Tuberculosis.">Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis.</a> PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).</li></ol>

Nous rapportons ici le protocole pour la méthode que nous avons développée et validée pour quantifier 11 médicaments antituberculeux utilisés dans le traitement de la TUBERCULOSE DR dans de petits échantillons de cheveux à l’aide de LC-MS/MS. Aucune autre méthode pour quantifier ces 11 médicaments dans les cheveux n’a été précédemment développée, validée et publiée. Notre méthode peut quantifier les niveaux de sous-nanogrammes de médicaments dans seulement 20-30 mèches de cheveux d’environ 3 ce...

Au XXIe siècle, la tuberculose pharmacorésistante (TB-DR) est une catastrophe en évolution pour les programmes nationaux de lutte contre la tuberculose déjà faibles, avec des cas confirmés qui ont doublé au cours des cinq dernières années seulement, représentant près d’un tiers de tous les décès liés à la résistance aux antimicrobiens dans le monde1,2. Le traitement réussi de la TUBERCULOSE DR a traditionnellement exigé des régimes de deuxième intention plus longs et plus toxiques que le traitement de la tuberculose sensible à la drogue. En outre, les patients atteints de DR-TB ont souvent des défis préexistants importants à l’adhésion, qui a contribué à l’émergence de la résistance initialement3.
Contrairement à l’infection par le VIH où les charges virales peuvent être utilisées pour surveiller le traitement, les critères de substitution de la réponse au traitement dans la tuberculose sont retardés et peu fiables au niveau individuel4. La surveillance de l’observance des patients, un prédicteur important de la concentration et de l’échec du traitement antituberculeux sous-thérapeutiques, est également difficile. L’adhésion auto-déclarée souffre de biais de rappel et le désir de s’il vous plaît fournisseurs5,6. Le nombre de pilules et les systèmes de surveillance des événements médicamenteux (MEMS) peuvent être plusobjectifs 7, mais ne mesurent pas la consommation réelle de drogues8,9,10. Les niveaux de médicaments dans les biomatrices peuvent fournir des données d’observance et pharmacocinétiques. Par conséquent, les niveaux de médicaments plasmatiques sont couramment utilisés dans la surveillance des médicaments thérapeutiques11,12. Dans le contexte de la surveillance de l’adhérence des médicaments, cependant, les niveaux de plasma représentent une exposition à court terme et sont limités par une variabilité intra- et interpériabilité importante des patients lorsqu’ils déterminent la plage de référence appropriée de l’observance. Les effets du « manteau blanc », où l’observance s’améliore avant les visites à la clinique ou à l’étude, compliquent encore davantage la capacité des niveaux plasmatiques à fournir des modèles précis d’adhérence des médicaments13.
Hair est un biomatrix alternatif qui peut mesurer l’exposition à long terme de drogue14,15. Beaucoup de médicaments et de métabolites endogènes incorporent dans la matrice de protéine de cheveux de la circulation systémique pendant que les cheveux grandissent. Comme ce processus dynamique continue pendant la croissance des cheveux, la quantité de médicament déposé dans la matrice de cheveux dépend de la présence continue de la drogue en circulation, ce qui rend les cheveux une excellente lecture temporelle de la prise de médicaments. Les cheveux en tant que biomatrix ont l’avantage supplémentaire d’être facilement collectés sans avoir besoin de chaîne de froid pour le stockage et l’expédition par rapport au sang. En outre, les cheveux sont non-biorisqueux, ce qui offre des avantages de faisabilité supplémentaires dans le domaine.
Les niveaux de médicaments capillaires ont longtemps été utilisés dans les applications médico-légales16. Au cours de la dernière décennie, les niveaux d’antirétroviraux capillaires (ARV) ont démontré leur utilité dans l’évaluation de l’observance des médicaments dans le traitement et la prévention du VIH, auxquels notre groupe a contribué. Les niveaux d’ARV dans les cheveux se sont avérés être les plus forts prédicteurs indépendants des résultats de traitement dans l’infection de VIH17,18,19,20,21. Pour déterminer si les niveaux de cheveux des patients atteints de tuberculose DR auront le même utilité à prédire les résultats du traitement, nous avons utilisé la LC-MS/MS pour mettre au point et valider une méthode d’analyse de 11 médicaments antituberculeux dans de petits échantillons de cheveux. Dans le cadre d’une évaluation initiale de la performance de l’analyse, nous avons mesuré les niveaux de médicaments antituberculeux dr dans un échantillon pratique de patients atteints de TUBERCULOSE DR recevant un traitement directement observé (DOT) au Cap-Occidental, Afrique du Sud22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:755px;" width="755">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5182-0716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250 uL injection vial inserts</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead ruptor 24</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline-d6</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine-d7</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable lime glass culture tubes</td>
			<td style="width:211px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">60825-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">E890420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">ClearSynth</td>
			<td>CS-O-06597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F0507-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">1395-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot Shaker</td>
			<td style="width:211px;">Bellco Glass Inc</td>
			<td style="width:161px;">7746-32110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">Infinity 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">230-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:211px;">Aqua Solutions Inc</td>
			<td style="width:161px;">W1089-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">I821450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>I821452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">00D-4371-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-8788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge holder</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC-MS/MS quantitation software</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Multiquant 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR">1362103-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin-d8</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L360002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid-d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:211px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:161px;">695554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin-13C, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">M745003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS/MS</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Triple Quad 5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPC 14714</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>O667600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pretomanid (PA-824)</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:161px;">P122500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Prothionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prothionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide-15N, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Septum caps for injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5185-5862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbovap LV evaporator</td>
			<td style="width:211px;">Biotage</td>
			<td style="width:161px;">103198/11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples

La tuberculose pharmacorésistante (TBD) est une menace croissante pour la santé publique, et l’évaluation des niveaux de médicaments thérapeutiques peut avoir d’importants avantages cliniques. Les niveaux de médicaments plasmatiques sont l’évaluation actuelle de l’étalon-or, mais nécessitent une phlébotomie et une chaîne de froid, et ne capturent que l’adhérence très récente. Notre méthode utilise les cheveux, une matrice qui est facilement recueillie et réfléchissant à l’adhérence à long terme, pour tester 11 médicaments antituberculeux. Des travaux antérieurs de notre groupe montrent que les niveaux de médicaments antirétroviraux chez les cheveux sont associés aux résultats du VIH. Notre méthode pour les médicaments DR-TB utilise 2 mg de cheveux (3 cm proximal à la racine), qui est pulvérisé et extrait dans le méthanol. Les échantillons sont analysés à l’attention d’une seule méthode LC-MS/MS, quantifiant 11 médicaments dans une course de 16 minutes. Les limites inférieures de quantification (LLOQ) pour les 11 médicaments varient de 0,01 ng/mg à 1 ng/mg. La présence de médicaments est confirmée en comparant les ratios de deux transitions de spectrométrie de masse. Les échantillons sont quantifiés à l’aide du rapport de zone du médicament par rapport à l’isotopologue de drogue détérité, 15N ou 13C-étiqueté. Nous avons utilisé une courbe d’étalonnage allant de 0,001-100 ng/mg. L’application de la méthode à un échantillon de commodité d’échantillons de cheveux prélevés sur des patients atteints de DR-TB sur la thérapie directement observée (DOT) a indiqué des niveaux de médicaments dans les cheveux dans la gamme dynamique linéaire de neuf des onze médicaments (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacine, clofazimine, bédaquiline, prétomanid). Aucun patient n’était sur le prothionamide, et les niveaux mesurés pour l’éthionamide étaient proches de son LLOQ (avec d’autres travaux examinant plutôt la pertinence du métabolite d’éthionamide pour surveiller l’exposition). En résumé, nous décrivons le développement d’un panel multi-analyte pour les médicaments DR-TB dans les cheveux comme une technique de surveillance thérapeutique des médicaments pendant le traitement pharmacorésistant de la tuberculose.

Une illustration d’un chromatogramme avec des niveaux confirmés de tous les 11 médicaments DR-TB est montrée dans la figure 1. Le temps de rétention de chaque analyte peut changer lors de l’utilisation de différents instruments et colonnes, de sorte que le temps de rétention exact doit être déterminé individuellement.
Les Chromatogrammes d’ion extraits (CIB) pour un médicament particulier (isoniazid, INH) dans l’un des étalonneurs (échantillon ...

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Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Les méthodes actuelles d’analyse de l’adhésion des patients aux régimes complexes de pharmacorésistants-tbsi (DR-TB) peuvent être inexactes et à forte intensité de ressources. Notre méthode analyse les cheveux, une matrice facilement recueillie et stockée, pour des concentrations de 11 médicaments CONTRE la tuberculose DR. À l’aide de LC-MS/MS, nous pouvons déterminer les niveaux de médicaments sous-nanogrammes qui peuvent être utilisés pour mieux comprendre l’observance des médicaments.

Comité de LC-MS/MS validé pour quantifier 11 médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans de petits échantillons de cheveux

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

L’observance du patient est très difficile et le métabolisme des médicaments peut varier d’une personne à l’autre, de sorte que la mesure objective des niveaux de médicaments peut s’avérer importante pour prévenir l’émergence d’une résistance pendant le traitement de la tuberculose. Si l’observance pouvait être quantifiée avec plus de précision et de facilité, les fournisseurs de soins de santé pourraient élaborer un plan de traitement qui limiterait le développement d’une résistance aux médicaments. Nous avons mis au point le premier panneau de spectrométrie de masse analyte multiple pour plusieurs médicaments antituberculeux dans de petits échantillons de cheveux en un seul essai.Notre panneau multi-médicaments ne nécessite qu’un échantillon de deux milligrammes par patient et n’utilise ni phase solide extraction ou étape de filtrage pour prévenir toute perte de volume de l’échantillon. Des mesures objectives de l’exposition aux médicaments mesurées au début du traitement pourraient potentiellement alerter les cliniciens des problèmes avec les médicaments individuels dans le régime de traitement. Les échantillons de cheveux doivent être pulvérisés le jour de l’analyse pour une mesure précise du niveau de concentration des médicaments.Pour acquérir des échantillons de cheveux, après avoir obtenu un consentement éclairé écrit, préparez les matériaux, y compris une étiquette mince, deux étiquettes participantes, une paire de ciseaux, un morceau de papier d’aluminium déplié, un lingette d’alcool et un sac en plastique. Essuyer les lames des ciseaux à l’aide d’un lingette à l’alcool. Aller à l’arrière de la tête et soulever la partie supérieure des cheveux à l’aide d’une pince à cheveux si désiré.Rassemblez 30 mèches de cheveux à l’arrière de la tête et isolez le thatch avec votre main. Prenez les ciseaux jusqu’au cuir chevelu et coupez le thatch des cheveux. Placer délicatement le thatch des cheveux sur le papier d’aluminium.Placez l’étiquette mince sur l’extrémité distale du thatch de cheveux, l’en scotchant solidement au papier d’aluminium. L’extrémité distale est le côté le plus éloigné du cuir chevelu. Pliez le morceau de papier d’aluminium sur le dessus du thatch de cheveux et mettez une étiquette participante sur le dessus du papier d’aluminium.Placez le morceau plié sur du papier d’aluminium dans le sac en plastique et mettez une autre étiquette participante sur le sac en plastique. Pour l’extraction de médicaments à partir des échantillons de cheveux, peser deux milligrammes de chaque échantillon de cheveux dans des tubes de perles étiquetés individuellement et deux milligrammes de l’échantillon de cheveux blancs dans chacun des 16 tubes de perles supplémentaires. Après pesage, placez tous les tubes de perles dans un homogénéisateur de moulin à perles et homogénéisez les échantillons à une vitesse de 6,95 mètres par seconde pendant deux cycles de 30 secondes avec une période de repos de 15 secondes entre chaque cycle.Après la deuxième homogénéisation, ajouter 500 microlitres du mélange standard interne approprié à chaque échantillon et ajouter 500 microlitres de méthanol au tube blanc matriciel. Piquer les tubes courbes d’étalonnage avec le volume approprié de mélange standard de référence selon le tableau et placer tous les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés avec secousses douces pendant deux heures. À la fin de l’incubation, transférer le supernatant de chaque tube de perles dans de nouveaux tubes de microcentrifugeuses étiquetés et ajouter 500 microlitres de méthanol aux tubes de perles.Vortex les tubes de perles et transférer le lavage au méthanol dans les tubes de microcentrifugeuse correspondants. Centrifugez les échantillons et transférez soigneusement les supernatants dans de nouveaux tubes sans déranger les granulés de cheveux. Évaporer le liquide dans les tubes à la sécheresse à 32 degrés Celsius et reconstituer les échantillons avec 200 microlitres d’eau de qualité chromatographie liquide haute pression avec 1% d’acide formique.Après vortex, transférer les échantillons liquides sur des flacons ambrés avec 250 inserts de microlitres. Pour la spectrométrie de masse tandem chromatographie liquide, installez d’abord une colonne de deux à 100 millimètres avec une taille de particules de 2,5 micromètres et une taille de pore angstrom de 100 angstrom avec des perles de phénol éthérées à extrémité polaire entièrement faites de silice poreuse dans le compartiment de la colonne. Confirmez que la colonne dispose également d’une cartouche de garde recommandée par le fabricant.Copier et coller l’information composée incluse dans les transitions de la méthode MDR-TB LCMS. fichier csv dans la boîte dans la fenêtre spec de masse. Dans une feuille de calcul, créez une séquence par lots de la courbe d’étalonnage, des contrôles de qualité, des échantillons de patients, une courbe d’étalonnage, des contrôles de qualité, des échantillons de patients, une courbe d’étalonnage et des contrôles de qualité.Ajoutez des injections de solvant blanc au début et à la fin de la course ainsi qu’avant et après la courbe d’étalonnage, des contrôles de qualité et des échantillons de patients. Ensuite, placez au moins huit injections de solvant blanc dans les injections dans la courbe d’étalonnage et le flacon de contrôle de haute qualité pour réduire le report analyte. Lorsque les lots sont terminés, ouvrez le logiciel de quantitation.Faites défiler les transitions pour vous assurer que le temps de rétention automatiquement sélectionné est exact et vérifiez que le lissage gaussien est réglé à 1,5. Ensuite, cliquez sur affiche la courbe d’étalonnage et la régression et réglez le type d’attente à un sur x. Cliquez sur OK et validez la courbe d’étalonnage et les échantillons de contrôle de la qualité pour vous assurer que le lot a fonctionné avec succès.Pour chaque analyte de référence de quantificateur, au moins les deux tiers des points d’étalonnage doivent avoir une précision dans un délai de 80-120%Vérifiez que la valeur R affichée au-dessus de la courbe d’étalonnage est supérieure à 0,975. Si toutes les conditions ci-dessus sont remplies, le lot est passé et les échantillons peuvent être quantifiés. Cliquez sur Modifier dans la barre d’outils et cliquez sur Copier la table entière.Ensuite, coller la table dans une feuille de calcul et utiliser la moyenne de la concentration calculée des deux injections de l’échantillon pour déterminer la concentration déclarée de chaque échantillon. Voici une illustration d’un chromatogramme avec des niveaux confirmés de tous les 11 médicaments antituberculeux testés. Dans ces chiffres, les chromatogrammes irionaux extraits pour un médicament particulier dans l’un des calibrators peuvent être observés.Les transitions de quantificateur et de qualification sont utilisées pour confirmer qualitativement la présence du médicament, car le rapport entre la zone du quantificateur et la zone de qualification demeure la constante entre les échantillons. La norme interne est également surveillée pour s’assurer que chaque injection d’échantillon est normalisée. Dans cette analyse, un échantillon pratique de 15 échantillons de cheveux parmi une population totale d’étude de 96 patients prenant des médicaments antituberculeux pharmacorésistants dans des conditions thérapeutiques directement observées du Cap occidental, en Afrique du Sud, a été évalué afin de déterminer les niveaux représentatifs de médicaments antituberculeux pharmacorésistants aux niveaux les plus bas et les plus élevés pour chaque analyte.En l’absence d’une phase solide d’extraction ou d’étape de filtrage, prenez soin lors du transfert du supernatant dans les tubes d’évaporation. Tout ce qui est transféré dans les tubes peut finir injecté dans la colonne. Comme le rotor du rapace perlé peut s’envoler s’il n’est pas bien vissé ou verrouillé, assurez-vous de vérifier le rotor avant de le faire fonctionner.Contrairement aux antirétroviraux dans le domaine du VIH, la relation entre la pharmacocinétique des médicaments antituberculeux, l’observance et les résultats cliniques reste largement non étudiée. Nous avons émis l’hypothèse que certains médicaments antituberculeux ne s’accumulent pas bien dans les cheveux. Cibler les métabolites de ces médicaments peut fournir une meilleure compréhension de l’observance des patients.

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