Name: validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Die Autoren danken Professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail und Marietjie Pretorius vom Lung Institute der Universität Kapstadt, die die Entnahme von Haarproben für die Studie erleichtert haben. Die Autoren würdigen ferner die Beiträge der Teilnehmer dieser Studie.

Alle Patienten erteilten vor der Entnahme von Haarproben ihre schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage. Wir erhielten die Genehmigung des Institutional Review Board von der University of Cape Town und der University of California, San Francisco.
1. Haarprobenahme
<ol><li>Erhalten Sie eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage.</li>
	<li>Verwenden Sie eine saubere Schere, um etwa 20-30 Kopfhaut Haarsträhnen aus dem okzipitalen Bereich so nah wie möglich an der Kopfhau...

<ol>
	<li>Kurbatova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+poor+outcomes+among+patients+treated+for+multidrug-resistant+tuberculosis+at+DOTS-plus+projects.">Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Respiratory Medicine. , (2017).</li><li>Berg, K. M., Arnsten, J. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+concentrations+of+antiretrovirals+predict+viral+suppression+in+HIV-infected+pregnant+and+breastfeeding+Ugandan+women.">Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women.</a> AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).</li><li>Pintye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+Lopinavir+Hair+Concentrations+Are+the+Strongest+Predictor+of+Viremia+in+HIV-Infected+Asian+Children+and+Adolescents+on+Second-Line+Antiretroviral+Therapy.">Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).</li><li>Baxi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nevirapine+Concentration+in+Hair+Samples+Is+a+Strong+Predictor+of+Virologic+Suppression+in+a+Prospective+Cohort+of+HIV-Infected+Patients.">Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients.</a> PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+concentrations+in+hair+strongly+predict+virologic+response+in+a+large+HIV+treatment-naive+clinical+trial.">Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial.</a> Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).</li><li>Gerona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+11+medications+for+drug+resistant+TB+in+small+hair+samples+to+quantify+adherence+and+exposure+using+a+validate+LC-MS/MS+panel.">Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel.</a> Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).</li><li>Metcalfe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+anti-tuberculosis+drug+concentration+in+hair+and+treatment+outcomes+in+MDR-+and+XDR-TB.">Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB.</a> European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).</li><li>Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Beyond+Directly+Observed+Therapy+for+Tuberculosis.">Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis.</a> PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).</li></ol>

Wir berichten hier über das Protokoll für die Methode, die wir zur Quantifizierung von 11 Anti-TB-Medikamenten entwickelt und validiert haben, die bei der Behandlung von DR-TB in kleinen Haarproben mit LC-MS/MS verwendet werden. Keine andere Methode zur Quantifizierung dieser 11 Medikamente in Haaren wurde zuvor entwickelt, validiert und veröffentlicht. Unsere Methode kann Sub-Nanogramm-Spiegel von Medikamenten in nur 20-30 Haarsträhnen von etwa 3 Zentimetern (cm) Länge quantifizieren und wurde bereits<sup class="xr...

Im 21. Jahrhundert ist die medikamentenresistente TB (DR-TB) eine sich entwickelnde Katastrophe für bereits schwache nationale TB-Kontrollprogramme, wobei sich die bestätigten Fälle allein in den letzten 5 Jahren verdoppelt haben und fast ein Drittel aller Todesfälle im Zusammenhang mit AntimikrobiellenResistenzen weltweit1,2ausmachen. Die erfolgreiche Behandlung von DR-TB erforderte konventionell längere und toxischere Zweitlinientherapien als die Behandlung von medikamentenempfindlicher TB. Darüber hinaus haben Patienten mit DR-TB oft erhebliche bereits bestehende Herausforderungen bei der Adhärenz, die zur Entstehung von Resistenzen zunächst 3 beigetragenhaben.
Im Gegensatz zu einer HIV-Infektion, bei der virale Belastungen zur Überwachung der Behandlung verwendet werden können, sind Die Endpunkte der Behandlungsreaktion bei TB verzögert und auf einer individuellen Ebene4unzuverlässig. Die Überwachung der Patiententreue, einem wichtigen Prädiktor für die konzentration von Anti-TB-Medikamenten und Behandlungsversagen, ist ebenfalls eine Herausforderung. Selbst gemeldete Adhärenz leidet unter Rückruf-Bias und dem Wunsch, Anbieter5,6zu gefallen. Pillenzählungen und Medikamentenereignisüberwachungssysteme (MEMS) könnenobjektiver 7 sein, aber nicht den tatsächlichen Drogenkonsum messen8,9,10. Arzneimittelgehalte in Biomatrizen können sowohl Adhärenz als auch pharmakokinetische Daten liefern. Daher werden Plasma-Arzneimittelspiegel häufig in der therapeutischen Arzneimittelüberwachungverwendet 11,12. Im Rahmen der Überwachung der Arzneimitteltreue stellen die Plasmaspiegel jedoch eine kurzfristige Exposition dar und sind durch eine signifikante intra- und interpatienten-Variabilität bei der Bestimmung des geeigneten Referenzbereichs begrenzt. "White Coat"-Effekte, bei denen sich die Adhärenz vor Klinik- oder Studienbesuchen verbessert, erschweren die Fähigkeit des Plasmaspiegels, genaue Wirkstofftreuemuster zu liefern13.
Haar ist eine alternative Biomatrix, die langfristige Drogenexposition14,15messen kann. Viele Medikamente und endogene Metaboliten integrieren sich aus der systemischen Zirkulation in die Haarproteinmatrix, wenn das Haar wächst. Da dieser dynamische Prozess während des Haarwachstums fortbesteht, hängt die Menge des in der Haarmatrix hinterlegten Medikaments von der kontinuierlichen Anwesenheit des Medikaments im Kreislauf ab, was das Haar zu einer ausgezeichneten zeitlichen Auslesung der Medikamentenaufnahme macht. Haar als Biomatrix hat den zusätzlichen Vorteil, dass es im Vergleich zu Blut einfach ohne Kühlkette für Lagerung und Versand gesammelt werden kann. Darüber hinaus ist das Haar nicht biogefährlich, was zusätzliche Machbarkeitsvorteile auf dem Gebiet bietet.
Haardrogenspiegel sind seit langem in forensischen Anwendungen verwendet16. In den letzten zehn Jahren haben die Antiretroviral-Werte (ARV) bei der Beurteilung der Arzneimitteltreue bei der HIV-Behandlung und -Prävention, zu der unsere Gruppe beigetragen hat, einen Nutzen gezeigt. ARV-Spiegel in Haaren haben sich als die stärksten unabhängigen Prädiktoren der Behandlungsergebnisse bei HIV-Infektion17,18,19,20,21. Um festzustellen, ob die Haarstufen von DR-TB-Patienten den gleichen Nutzen bei der Vorhersage des Behandlungsergebnisses haben, haben wir LC-MS/MS verwendet, um eine Methode zur Analyse von 11 DR-TB-Medikamenten in kleinen Haarproben zu entwickeln und zu validieren. Als erste Bewertung der Leistung des Assays haben wir den DR-TB-Medikamentenspiegel in einer Convenience-Probe von Patienten mit DR-TB gemessen, die eine direkt beobachtete Therapie (DOT) im Westkap, Südafrika,erhielten 22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:755px;" width="755">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5182-0716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250 uL injection vial inserts</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead ruptor 24</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline-d6</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine-d7</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable lime glass culture tubes</td>
			<td style="width:211px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">60825-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">E890420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">ClearSynth</td>
			<td>CS-O-06597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F0507-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">1395-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot Shaker</td>
			<td style="width:211px;">Bellco Glass Inc</td>
			<td style="width:161px;">7746-32110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">Infinity 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">230-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:211px;">Aqua Solutions Inc</td>
			<td style="width:161px;">W1089-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">I821450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>I821452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">00D-4371-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-8788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge holder</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC-MS/MS quantitation software</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Multiquant 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR">1362103-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin-d8</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L360002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid-d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:211px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:161px;">695554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin-13C, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">M745003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS/MS</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Triple Quad 5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPC 14714</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>O667600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pretomanid (PA-824)</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:161px;">P122500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Prothionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prothionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide-15N, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Septum caps for injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5185-5862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbovap LV evaporator</td>
			<td style="width:211px;">Biotage</td>
			<td style="width:161px;">103198/11</td>
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validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples

Arzneimittelresistente Tuberkulose (DR-TB) ist eine wachsende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, und die Bewertung des therapeutischen Arzneimittelspiegels kann wichtige klinische Vorteile haben. Plasma-Medikamente sind die aktuelle Gold-Standard-Bewertung, erfordern aber Phlebotomie und eine Kühlkette, und erfassen nur sehr neue Adhärenz. Unsere Methode verwendet Haare, eine Matrix, die leicht gesammelt werden kann und reflektierend für die langfristige Einhaltung, um für 11 Anti-TB-Medikamente zu testen. Frühere Arbeiten unserer Gruppe zeigen, dass antiretrovirale Arzneimittelinihrer in Haaren mit HIV-Ergebnissen in Verbindung gebracht werden. Unsere Methode für DR-TB-Medikamente verwendet 2 mg Haar (3 cm proximal an der Wurzel), das pulverisiert und in Methanol extrahiert wird. Die Proben werden mit einer einzigen LC-MS/MS-Methode analysiert, die 11 Medikamente in einem 16-min-Lauf quantifiziert. Die niedrigeren Grenzwerte für die Quantifizierung (LLOQs) für die 11 Medikamente reichen von 0,01 ng/mg bis 1 ng/mg. Die Wirkstoffpräsenz wird durch den Vergleich von Verhältnissen zweier Massenspektrometrieübergänge bestätigt. Die Proben werden mit dem Flächenverhältnis des Arzneimittels zum deuterated, 15N- oder 13C-markierten Wirkstoff isotopologue quantifiziert. Wir verwendeten eine Kalibrierkurve von 0,001-100 ng/mg. Anwendung der Methode auf eine Convenience-Probe von Haarproben von DR-TB-Patienten auf direkt beobachtete Therapie (DOT) angegeben Arzneimittelspiegel im Haar innerhalb des linearen Dynamikbereichs von neun der elf Medikamente (Isoniazid, Pyrazinamid, Ethambutol, Linezolid, Levofloxacin, Moxifloxacin, Clofazimin, Bedaquiline, Pretomanid). Kein Patient war auf Prothionamid, und die gemessenen Werte für Ethionamid waren in der Nähe seiner LLOQ (mit weiteren Arbeiten stattdessen die Eignung des Metaboliten von Ethionamid für die Überwachung der Exposition). Zusammenfassend beschreiben wir die Entwicklung eines Multi-Analyten-Panels für DR-TB-Medikamente in Haaren als eine Technik zur therapeutischen Arzneimittelüberwachung während der medikamentösen TB-Behandlung.

Abbildung 1zeigt ein Chromatogramm mit bestätigten Konzentrationen aller 11 DR-TB-Medikamente. Die Aufbewahrungszeit für jeden Analyten kann sich ändern, wenn verschiedene Instrumente und Spalten verwendet werden, sodass die genaue Aufbewahrungszeit individuell festgelegt werden sollte.
Die extrahierten Ionenchromatogramme (EiK) für ein bestimmtes Medikament (Isoniazid, INH) in einem der Kalibratoren (leere Haarprobe mit DR-TB-Referenzstandards) sind in <stron...

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Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Aktuelle Methoden zur Analyse der Patientenbindung an komplexe medikamentenresistente Tuberkulose-Therapien (DR-TB) können ungenau und ressourcenintensiv sein. Unsere Methode analysiert Das Haar, eine leicht zu sammelnde und gelagerte Matrix, auf Konzentrationen von 11 DR-TB-Medikamenten. Mit LC-MS/MS können wir Sub-Nanogramm-Medikamentenspiegel bestimmen, die verwendet werden können, um die Arzneimittelhaftung besser zu verstehen.

Validiertes LC-MS/MS Panel zur Quantifizierung von 11 medikamentenresistenten TB-Medikamenten in kleinen Haarproben

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Die Patientenbindung ist sehr anspruchsvoll und der Arzneimittelstoffwechsel kann von Person zu Person variieren, so dass sich eine objektive Messung des Arzneimittelspiegels als wichtig erweisen kann, um das Auftreten von Resistenzen während der TB-Behandlung zu verhindern. Wenn die Einhaltung genauer und leichter quantifiziert werden könnte, könnten die Gesundheitsdienstleister einen Behandlungsplan entwickeln, der die Entwicklung von Medikamentenresistenzen einschränken würde. Wir haben das erste multiple Analyt-Massenspektrometrie-Panel für mehrere TB-Medikamente in kleinen Haarproben in einem einzigen Test entwickelt.Unser Multi-Drogen-Panel benötigt nur eine Zwei-Milligramm-Probe pro Patient und verwendet weder festphase Extraktion oder Filterschritt, um einen Verlust des Probenvolumens zu verhindern. Objektive Maßnahmen der Drogenexposition, die früh im Behandlungsverlauf gemessen werden, könnten Kliniker möglicherweise auf Probleme mit einzelnen Medikamenten in der Behandlungstherapie aufmerksam machen. Haarproben müssen am Tag der Analyse für eine genaue Messung des Wirkstoffkonzentrationsniveaus pulverisiert werden.Um Haarproben zu erwerben, nach schriftlicher Einwilligung in Kenntnis der Sachlage, bereiten Sie Materialien bereit, darunter ein dünnes Etikett, zwei Teilnehmeretiketten, eine Schere, ein aufgeklapptes Stück Aluminiumfolie, ein Alkoholtuch und eine Plastiktüte. Wischen Sie die Klingen der Schere mit einem Alkoholwisch sauber. Gehen Sie auf die Rückseite des Kopfes und heben Sie den oberen Teil des Haares mit einem Haarspange, wenn gewünscht.Sammeln Sie 30 Haarsträhnen von der Rückseite des Kopfes und isolieren Sie den Strohstrich mit der Hand. Nehmen Sie die Schere auf die Kopfhaut und schneiden Sie den Strohstrich der Haare. Legen Sie den Strohhut des Haares vorsichtig auf die Aluminiumfolie.Legen Sie das dünne Etikett über das distale Ende der Haarstroh, und kleben Sie es sicher auf die Aluminiumfolie. Das distale Ende ist die Seite am weitesten von der Kopfhaut entfernt. Falten Sie über das Stück Aluminiumfolie auf der Oberseite der Haarstroh und legen Sie ein Teilnehmer-Etikett auf die Aluminiumfolie.Legen Sie das gefaltete Stück Aluminiumfolie in die Plastiktüte und legen Sie ein weiteres Teilnehmeretikett auf die Plastiktüte. Für die Arzneimittelextraktion aus den Haarproben wägen sie zwei Milligramm jeder Haarprobe in einzeln beschriftete Perlenröhrchen und zwei Milligramm der rohen Haarprobe in jeweils 16 zusätzliche Perlenröhrchen ab. Nach dem Wiegen alle Perlenrohre in einen Perlenmühlenhomogenisator geben und die Proben mit einer Geschwindigkeit von 6,95 Metern pro Sekunde für zwei 30-Sekunden-Zyklen mit einer 15-Sekunden-Ruhezeit zwischen jedem Zyklus homogenisieren.Nach der zweiten Homogenisierung 500 Mikroliter der entsprechenden internen Standardmischung zu jeder Probe hinzufügen und 500 Mikroliter Methanol in das Matrix-Rohrohr geben. Spike die Kalibrierkurvenrohre mit dem entsprechenden Volumen der Referenzstandardmischung nach der Tabelle und legen Sie alle Rohre in einem 37-Grad-Wasserbad mit sanftem Schütteln für zwei Stunden. Am Ende der Inkubation den Überstand von jedem Perlenrohr in neue markierte Mikrozentrifugenrohre übertragen und 500 Mikroliter Methanol in die Perlenröhrchen geben.Wirbeln Sie die Perlenrohre und übertragen Sie die Methanolwäsche auf die entsprechenden Mikrozentrifugenrohre. Zentrifugieren Sie die Proben und übertragen Sie die Überstande vorsichtig in neue Schläuche, ohne die Haarpellets zu stören. Verdampfen Sie die Flüssigkeit in den Rohren auf Trockenheit bei 32 Grad Celsius und rekonstituieren Sie die Proben mit 200 Mikroliter Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Grade-Wasser mit 1% Ameisensäure.Nach dem Wirbeln die flüssigen Proben mit 250 Mikroliter-Einsätzen auf Bernsteinfläschchen übertragen. Für die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie installieren Sie zunächst eine Zwei- bis 100-Millimeter-Säule mit einer Partikelgröße von 2,5 Mikrometern und 100 Angstrom-Porengröße mit polaren, ethergebundenen Phenolperlen vollständig aus porösem Kieselsäure in das Säulenfach. Vergewissern Sie sich, dass in der Spalte auch eine vom Hersteller empfohlene Schutzkassette installiert ist.Kopieren und fügen Sie die zusammengesetzten Informationen in den MDR-TB LCMS-Methodenübergängen ein. csv-Datei in das Feld im Massenspezifikationsfenster. Erstellen Sie in einer Kalkulationstabelle eine Chargensequenz der Kalibrierkurve, Qualitätskontrollen, Patientenproben, Kalibrierkurven, Qualitätskontrollen, Patientenproben, Kalibrierkurven und Qualitätskontrollen.Fügen Sie Lösemittel-Rohlingsinjektionen am Anfang und AmEnde des Laufs sowie vor und nach der Kalibrierkurve, Qualitätskontrollen und Patientenproben hinzu. Dann legen Sie mindestens acht Lösemittel-Leerinjektionen in die Injektionen in die Kalibrierkurve und die hochwertige Kontrolldurchstechsons, um die Analytübertragung zu reduzieren. Wenn die Batches abgeschlossen sind, öffnen Sie die Quantifizierungssoftware.Führen Sie einen Bildlauf durch die Übergänge durch, um sicherzustellen, dass die automatisch ausgewählte Aufbewahrungszeit korrekt ist, und überprüfen Sie, ob die Glausssche Glättung auf 1,5 eingestellt ist. Klicken Sie als Nächstes auf die Kalibrierungskurve und die Regression, und legen Sie den Wartetyp auf eins über x fest. Klicken Sie auf OK, und überprüfen Sie die Kalibrierkurve und die Qualitätskontrollproben, um sicherzustellen, dass die Charge erfolgreich ausgeführt wurde.Für jeden Quantifier-Referenzanalyten müssen mindestens zwei Drittel der Kalibrierpunkte eine Genauigkeit zwischen 80-120% aufweisen, um zu überprüfen, ob der über der Kalibrierkurve angezeigte R-Wert größer als 0,975 ist. Wenn alle oben genannten Bedingungen erfüllt sind, ist die Charge vorbei und die Proben können quantifiziert werden. Klicken Sie in der Symbolleiste auf Bearbeiten und auf Gesamte Tabelle kopieren.Fügen Sie dann die Tabelle in eine Tabelle ein und verwenden Sie den Durchschnitt der berechneten Konzentration der beiden Probeninjektionen, um die gemeldete Konzentration jeder Probe zu bestimmen. Hier ist eine Abbildung eines Chromatogramms mit bestätigten Konzentrationen aller getesteten 11 medikamentenresistenten TB-Medikamente gezeigt. In diesen Zahlen können die extrahierten Ionenchromatogramme für ein bestimmtes Medikament in einem der Kalibratoren beobachtet werden.Die Quantifizierer- und Qualifiziererübergänge werden verwendet, um das Vorhandensein des Arzneimittels qualitativ zu bestätigen, da das Verhältnis zwischen dem Bereich des Quantifizierers und dem Bereich der Qualifizierer die konstante zwischen den Proben bleibt. Der interne Standard wird ebenfalls überwacht, um sicherzustellen, dass jede Probeninjektion normalisiert wird. In dieser Analyse wurde eine praktische Stichprobe von 15 Haarproben unter einer Gesamtpopulation von 96 Patienten, die medikamentenresistente TB-Medikamente unter direkt beobachteten Therapiebedingungen aus Westkap, Südafrika, einnehmen, untersucht, um repräsentative Konzentrationen von medikamentenresistenten TB-Medikamenten über die niedrigsten und höchsten Werte für jeden Analyten zu bestimmen.In Ermangelung eines festen Phasenextraktions- oder Filterschritts achten Sie beim Übertragen des Überstandes in die Verdampfungsrohre. Alles, was in die Rohre übertragen wird, kann in die Säule injiziert werden. Da der Rotor des Perlenraptors abfliegen kann, wenn er nicht fest verschraubt oder verriegelt ist, sollten Sie den Rotor vor dem Betrieb doppelt überprüfen.Im Gegensatz zu antiretroviralen Medikamenten im Bereich HIV bleibt die Beziehung zwischen Derasetik, Adhinetik, Adhinetik und klinischen Ergebnissen von TB-Medikamenten weitgehend unerforscht. Wir haben vermutet, dass einige TB-Medikamente nicht gut im Haar ansammeln. Die Bekämpfung der Metaboliten dieser Medikamente kann ein besseres Verständnis der Patientenhaftung bieten.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokoll für Long Duration Ganzkörper-Hyperthermie in Mäuse

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Forschung

Medizin

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopen Dünndarm Transplantation in Ratten

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Die Quantifizierung des Immunsuppressivums Tacrolimus auf Getrocknetes Blut mittels LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Approach for the Administration of Medications and Fluids in Emergency Scenarios and Settings

Ein neuer Ansatz für die Verabreichung von Medikamenten und Flüssigkeiten in Notfallszenarien und Einstellungen

The available routes of administration commonly used for medications and fluids in the acute care setting are generally limited to oral, intravenous, or ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Netzwerkanalyse von Foramen Ovale Elektrode Recordings in Resistente Temporallappen Epilepsie-Patienten

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nerve sparende Mittelharnröhrenobstruktion (NEMO) in Female Kleine Nagetiere

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

Ein Verfahren zur Quantifizierung der oberen Extremität Leistung im täglichen Leben Accelerometer Verwendung

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimierte LC-MS/MS-Methode für die Hochdurchsatz-Analyse der klinischen Proben von Ivacaftor, seinen Hauptmetaboliten und Lumacaftor in biologischen Flüssigkeiten von Mukoviszidose-Patienten

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Bewertung der Fraktur Kallus Entwicklung während der Knochenheilung bei Mäusen mit einem MRI-kompatiblen Osteosynthese Gerät für Maus Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

Geschmack-Prüfung: Eine kurze und validierten Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...