Name: validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke professor Keertan Dheda, Dr. Ali Esmail og Marietjie Pretorius ved University of Cape Town Lung Institute som tilrettelagte innsamling av hårprøver for studien. Forfatterne anerkjenner videre bidragene fra deltakerne i denne studien.

Alle pasienter ga skriftlig informert samtykke før hårprøveinnsamling. Vi fikk Institutional Review Board godkjenning fra University of Cape Town og University of California, San Francisco.
1. Hår prøvetaking
<ol><li>Innhente skriftlig informert samtykke.</li>
	<li>Bruk ren saks til å kutte ca 20-30 hodebunnen hårtråder fra occipital regionen så nær hodebunnen som mulig.</li>
	<li>Plasser tape rundt den distale siden av håret for å indikere retningsbestemthet. Brett hårprøven i...

<ol>
	<li>Kurbatova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+poor+outcomes+among+patients+treated+for+multidrug-resistant+tuberculosis+at+DOTS-plus+projects.">Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Respiratory Medicine. , (2017).</li><li>Berg, K. M., Arnsten, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+and+conceptual+challenges+in+measuring+antiretroviral+adherence.">Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence.</a> Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).</li><li>Kagee, A., Nel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+association+between+self-report+items+for+HIV+pill+adherence+and+biological+measures.">Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures.</a> AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).</li><li>Haberer, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+to+antiretroviral+prophylaxis+for+HIV+prevention:+a+substudy+cohort+within+a+clinical+trial+of+serodiscordant+couples+in+East+Africa.">Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa.</a> PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).</li><li>Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+stop+counting+the+tablets.">Time to stop counting the tablets.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+study+of+multiple+measures+of+adherence+to+HIV+protease+inhibitors.">A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors.</a> Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).</li><li>Wendel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+use+of+electronic+adherence+monitoring+in+an+HIV+clinic.">Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic.</a> Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).</li><li>Ruiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+voriconazole+plasma+concentrations+on+treatment+response+in+critically+ill+patients.">Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutic. , (2019).</li><li>Saktiawati, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+sampling+strategies+for+therapeutic+drug+monitoring+of+first-line+tuberculosis+drugs+in+patients+with+tuberculosis.">Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis.</a> Clinical Phamacokinetics. , (2019).</li><li>Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="White+coat+compliance"+limits+the+reliability+of+therapeutic+drug+monitoring+in+HIV-1-infected+patients.">"White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients.</a> HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).</li><li>Cuypers, E., Flanagan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interpretation+of+hair+analysis+for+drugs+and+drug+metabolites.">The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites.</a> Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).</li><li>Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+for+drug+detection.">Hair analysis for drug detection.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).</li><li>Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair:+a+complementary+source+of+bioanalytical+information+in+forensic+toxicology.">Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology.</a> Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atazanavir+concentration+in+hair+is+the+strongest+predictor+of+outcomes+on+antiretroviral+therapy.">Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy.</a> Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).</li><li>Koss, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+concentrations+of+antiretrovirals+predict+viral+suppression+in+HIV-infected+pregnant+and+breastfeeding+Ugandan+women.">Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women.</a> AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).</li><li>Pintye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+Lopinavir+Hair+Concentrations+Are+the+Strongest+Predictor+of+Viremia+in+HIV-Infected+Asian+Children+and+Adolescents+on+Second-Line+Antiretroviral+Therapy.">Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).</li><li>Baxi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nevirapine+Concentration+in+Hair+Samples+Is+a+Strong+Predictor+of+Virologic+Suppression+in+a+Prospective+Cohort+of+HIV-Infected+Patients.">Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients.</a> PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+concentrations+in+hair+strongly+predict+virologic+response+in+a+large+HIV+treatment-naive+clinical+trial.">Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial.</a> Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).</li><li>Gerona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+11+medications+for+drug+resistant+TB+in+small+hair+samples+to+quantify+adherence+and+exposure+using+a+validate+LC-MS/MS+panel.">Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel.</a> Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).</li><li>Metcalfe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+anti-tuberculosis+drug+concentration+in+hair+and+treatment+outcomes+in+MDR-+and+XDR-TB.">Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB.</a> European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).</li><li>Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Beyond+Directly+Observed+Therapy+for+Tuberculosis.">Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis.</a> PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).</li></ol>

Vi rapporterer her protokollen for metoden vi utviklet og validert for å kvantifisere 11 anti-TB medisiner benyttet i behandlingen av DR-TB i små hårprøver ved hjelp av LC-MS / MS. Ingen annen metode for å kvantifisere disse 11 stoffene i håret er tidligere utviklet, validert og publisert. Vår metode kan kvantifisere sub-nanogram nivåer av narkotika i bare 20-30 hårtråder på ca 3 centimeter (cm) i lengde (~ 2 mg) og har allerede blitt validert22. Den lave vekten av hår analysert betyr ...

I det tjueførste århundre, resistente TB (DR-TB) er en utviklende katastrofe for allerede svake nasjonale TB kontrollprogrammer, med bekreftede tilfeller dobling i de siste 5 årene alene, står for nesten en tredjedel av alle dødsfall knyttet til antimikrobiell motstand globalt1,2. Vellykket behandling av DR-TB har konvensjonelt krevd lengre og mer giftige andrelinjeregimer enn behandling for legemiddelsensitiv tuberkulose. Videre har pasienter med DR-TB ofte betydelige eksisterende utfordringer for etterlevelse, noe som bidro til fremveksten av resistens i utgangspunktet3.
I motsetning til HIV-infeksjon der virusbelastninger kan brukes til å overvåke behandling, er surrogatendepunkter for behandlingsrespons i TB forsinket og upålitelig på individuell nivå4. Overvåking av pasientens etterlevelse, en viktig prediktor for subterapeutisk anti-TB-konsentrasjon og behandlingssvikt, er også utfordrende. Selvrapportert etterlevelse lider av tilbakekalling bias og ønsket om å behage leverandører5,6. Pilletellinger og medisinering hendelse overvåkingssystemer (MEMS) kan være mer objektiv7 men ikke måle faktiske narkotikabruk8,9,10. Legemiddelnivåer i biomatrices kan gi både etterlevelse og farmakokinetiske data. Derfor er plasmalegemiddelnivåer ofte brukt i terapeutisk legemiddelovervåking11,12. I sammenheng med overvåking av legemiddeletterlevelse representerer imidlertid plasmanivåer kortsiktig eksponering og er begrenset av signifikant intra- og interpasientvariabilitet ved fastsettelse av passende referanseområde for overholdelse. "Hvit frakk" effekter, hvor overholdelse forbedrer før klinikk eller studiebesøk, kompliserer ytterligere evnen til plasmanivåer for å gi nøyaktige legemiddeloverholdelsesmønstre13.
Hår er en alternativ biomatrix som kan måle langsiktig legemiddeleksponering14,15. Mange stoffer og endogene metabolitter innlemme i håret protein matrise fra systemisk sirkulasjon som håret vokser. Som denne dynamiske prosessen fortsetter under hårvekst, mengden av narkotika deponert i hårmatrisen avhenger av kontinuerlig tilstedeværelse av stoffet i omløp, noe som gjør håret til en utmerket temporal avlesning av legemiddelinntak. Hår som biomatrix har den ekstra fordelen av å bli lett samlet uten behov for kald kjede for lagring og forsendelse sammenlignet med blod. Videre er håret ikke-biofarlig, noe som gir ytterligere mulighetsfordeler i feltet.
Hår narkotika nivåer har lenge vært brukt i rettsmedisinske applikasjoner16. I løpet av det siste tiåret har hårantiretrovirale (ARV) nivåer vist nytte i å vurdere legemiddeloverholdelse i HIV-behandling og forebygging, som vår gruppe bidro til. ARV nivåer i håret har vist seg å være de sterkeste uavhengige prediktorer av behandlingsutfall i HIV-infeksjon17,18,19,20,21. For å finne ut om hårnivåer av DR-TB-pasienter vil ha samme nytte i å forutsi behandlingsutfallet, brukte vi LC-MS / MS for å utvikle og validere en metode for å analysere 11 DR-TB medisiner i små hårprøver. Som en innledende vurdering av analysens ytelse målte vi DR-TB-legemiddelnivåer i en praktisk prøve av pasienter med DR-TB som fikk direkte observert behandling (DOT) i Western Cape, Sør-Afrika22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:755px;" width="755">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5182-0716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250 uL injection vial inserts</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead ruptor 24</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline-d6</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine-d7</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable lime glass culture tubes</td>
			<td style="width:211px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">60825-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">E890420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">ClearSynth</td>
			<td>CS-O-06597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F0507-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">1395-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot Shaker</td>
			<td style="width:211px;">Bellco Glass Inc</td>
			<td style="width:161px;">7746-32110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">Infinity 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">230-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:211px;">Aqua Solutions Inc</td>
			<td style="width:161px;">W1089-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">I821450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>I821452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">00D-4371-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-8788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge holder</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC-MS/MS quantitation software</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Multiquant 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR">1362103-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin-d8</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L360002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid-d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:211px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:161px;">695554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin-13C, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">M745003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS/MS</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Triple Quad 5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPC 14714</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>O667600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pretomanid (PA-824)</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:161px;">P122500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Prothionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prothionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide-15N, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Septum caps for injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5185-5862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbovap LV evaporator</td>
			<td style="width:211px;">Biotage</td>
			<td style="width:161px;">103198/11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples

Legemiddelresistent tuberkulose (DR-TB) er en økende folkehelsetrussel, og vurdering av terapeutiske legemiddelnivåer kan ha viktige kliniske fordeler. Plasma narkotika nivåer er dagens gull standard vurdering, men krever phlebotomy og en kald kjede, og fange bare svært nylig overholdelse. Vår metode bruker hår, en matrise som lett samles inn og reflekterer langsiktig overholdelse, for å teste for 11 anti-TB medisiner. Tidligere arbeid fra gruppen vår viser at antiretrovirale legemiddelnivåer i håret er forbundet med HIV-utfall. Vår metode for DR-TB narkotika bruker 2 mg hår (3 cm proksimal til roten), som pulveriseres og ekstraheres i metanol. Prøver analyseres med en enkelt LC-MS/MS-metode, og kvantifiserer 11 legemidler i en 16 min-kjøring. Lavere grenser for kvantifisering (LLOQs) for de 11 legemidlene varierer fra 0,01 ng/mg til 1 ng/mg. Tilstedeværelse av legemidler bekreftes ved å sammenligne forhold mellom to massespektrometrioverganger. Prøver kvantifiseres ved hjelp av områdeforholdet mellom stoffet og deuterated, 15N-, eller 13C-merket legemiddel isotopologue. Vi brukte en kalibreringskurve fra 0,001-100 ng/mg. Anvendelse av metoden til en praktisk prøve av hårprøver samlet inn fra DR-TB pasienter på direkte observert terapi (DOT) indikerte legemiddelnivåer i håret innenfor det lineære dynamiske området av ni av de elleve legemidlene (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloksacin, moxifloxacin, clofazimin, bedaquiline, pretomanid). Ingen pasienter var på prothionamid, og de målte nivåene for ethionamid var nær sin LLOQ (med videre arbeid i stedet undersøke egnetheten av ethionamid metabolitt for overvåking eksponering). Oppsummert beskriver vi utviklingen av et multi-analyte panel for DR-TB narkotika i håret som en teknikk for terapeutisk legemiddelovervåking under legemiddelresistent TB-behandling.

En illustrasjon av et kromatogram med bekreftede nivåer av alle 11 DR-TB-legemidler er vist i figur 1. Oppbevaringstiden for hver analyte kan endres når du bruker forskjellige instrumenter og kolonner, slik at den nøyaktige oppbevaringstiden bør bestemmes individuelt.
Den ekstraherte Ion Chromatograms (EICs) for ett bestemt stoff (isoniazid, INH) i en av kalibratorene (blank hårprøve spiked med DR-TB narkotika referansestandarder) er vist i <strong class="xf...

Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Nåværende metoder for å analysere pasientenes overholdelse av komplekse legemiddelresistente-tuberkuloseregimer (DR-TB) kan være unøyaktige og ressursintensive. Vår metode analyserer hår, en lett samlet og lagret matrise, for konsentrasjoner av 11 DR-TB medisiner. Ved hjelp av LC-MS/MS kan vi bestemme subnanogram legemiddelnivåer som kan brukes til å forstå legemiddeloverholdelse naviss.

Validert LC-MS/MS-panel for kvantifisering av 11 legemiddelresistente TB-medisiner i små hårprøver

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Pasienttilslutning er svært utfordrende og stoffskiftet kan variere person til person så objektiv måling av narkotikanivåer kan vise seg å være viktig for å hindre fremveksten av resistens under TB behandling. Hvis overholdelse kunne være mer nøyaktig og enkelt kvantifisert, så helsepersonell kunne utvikle en behandlingsplan som ville begrense utviklingen av narkotikaresistens. Vi har utviklet det første multippelanalyse massespektrometripanelet for flere TB-medisiner i små hårprøver i en enkelt analyse.Vårt multi-drug panel krever bare en to-milligram prøve per pasient og bruker verken solid fase ekstraksjon eller filtrering trinn for å hindre tap av prøvevolum. Objektive tiltak for legemiddeleksponering målt tidlig i behandlingsforløpet kan potensielt varsle klinikere om problemer med individuelle legemidler i behandlingsregimet. Hårprøver må pulveriseres på analysedagen for en nøyaktig måling av legemiddelkonsentrasjonsnivå.For å skaffe seg hårprøver, etter å ha fått skriftlig informert samtykke, gjør materialer klare, inkludert en tynn etikett, to deltakeretiketter, en saks, et utfoldet stykke aluminiumsfolie, en alkoholserviett og en plastpose. Tørk av saksens kniver med en alkoholserviett. Gå til baksiden av hodet og løft den øverste delen av håret ved hjelp av en hårklipp hvis ønskelig.Samle 30 hårstrå fra baksiden av hodet og isolere stesj med hånden. Ta saksen ned til hodebunnen og kutt hårstanken. Legg forsiktig hårets rist på aluminiumsfolie.Sett den tynne etiketten over den distale enden av hårtimen, og teip den sikkert til aluminiumsfolie. Den distale enden er siden lengst fra hodebunnen. Brett over stykke aluminiumsfolie på toppen av hårtimen og legg en deltakeretikett på toppen av aluminiumsfolie.Legg det brettede overstykket aluminiumsfolie i plastposen og legg en annen deltakeretikett på toppen av plastposen. For legemiddelutvinning fra hårprøvene, vei ut to milligram av hver hårprøve i individuelt merkede perlerør og to milligram av den tomme hårprøven i hver av 16 ekstra perlerør. Etter veiing, plasser alle perlerørene i en perlemølle homogenisator og homogeniser prøvene med en hastighet på 6,95 meter per sekund i to 30-sekunders sykluser med en 15-sekunders hvileperiode mellom hver syklus.Etter den andre homogeniseringen legger du til 500 mikroliter av riktig intern standardblanding til hver prøve og legger til 500 mikroliter metanol til matrisen blankt rør. Spike kalibrering kurve rør med riktig volum av referanse standard blanding i henhold til bordet og plassere alle rørene i en 37 graders vannbad med mild risting i to timer. På slutten av inkubasjonen, overfør supernatant fra hvert perlerør til nye merkede mikrocentrifuge rør og legg til 500 mikroliter metanol til perlerørene.Vortex perlerørene og overfør metanolvasken til de tilsvarende mikrocentrifugerørene. Sentrifuge prøvene og overfør forsiktig supernativa til nye rør uten å forstyrre hårpellets. Fordampe væsken i rørene til tørrhet ved 32 grader Celsius og rekonstituer prøvene med 200 mikroliter med høytrykks flytende kromatografi grade vann med 1% maursyre.Etter vortexing, overfør væskeprøvene til rav hetteglass med 250 mikroliterinnsatser. For flytende kromatografi tandem massespektrometri, først installere en to til 100 millimeter kolonne med en 2,5 mikrometer partikkelstørrelse og 100 angstrom pore størrelse med polar-endcapped eterlinked fenol perler fullt laget av porøs silika inn i kolonnerommet. Kontroller at kolonnen også har en anbefalt beskyttelseskassett fra produsenten installert.Kopier og lim inn den sammensatte informasjonen som er inkludert i MDR-TB LCMS-metodeovergangene. csv-filen i boksen i massespesifikasjonsvinduet. I et regneark oppretter du en batchsekvens av kalibreringskurven, kvalitetskontroller, pasientprøver, kalibreringskurve, kvalitetskontroll, pasientprøver, kalibreringskurve og kvalitetskontroll.Legg til løsemiddel tomme injeksjoner i begynnelsen og slutten av løpet, samt før og etter kalibreringskurven, kvalitetskontroll og pasientprøver. Plasser deretter minst åtte løsemiddel tomme injeksjoner i injeksjonene i kalibreringskurven og høy kvalitetskontroll hetteglass for å redusere analyttoverførsel. Når batchene er fullført, åpner du kvantitetsprogramvaren.Bla gjennom overgangene for å sikre at den automatisk valgte oppbevaringstiden er nøyaktig, og kontroller at den gaussiske utjevning er satt til 1,5. Deretter klikker du på viser kalibreringskurven og regresjonen og setter ventetypen til én over x. Klikk OK, og valider kalibreringskurven og kvalitetskontrolleksemplene for å sikre at den satsvise jobben ble kjørt.For hver kvantifisatorreferanseanalytt må minst to tredjedeler av kalibreringspunktene ha en nøyaktighet innen 80-120 %Kontroller at R-verdien som vises over kalibreringskurven er større enn 0,975. Hvis alle de ovennevnte betingelsene er oppfylt, har partiet passert og prøvene kan kvantifiseres. Klikk Rediger på verktøylinjen, og klikk Kopier hele tabellen.Lim deretter inn tabellen i et regneark og bruk gjennomsnittet av den beregnede konsentrasjonen av de to prøveinjeksjonene for å bestemme den rapporterte konsentrasjonen av hver prøve. Her er vist en illustrasjon av et kromatogram med bekreftede nivåer av alle testet 11 legemiddelresistente TB narkotika. I disse tallene kan de ekstraherte ionkromatrammer for ett bestemt stoff i en av kalibratorene observeres.Kvantifisatoren og kvalifikatorovergangene brukes til kvalitativt å bekrefte tilstedeværelsen av stoffet, da forholdet mellom kvantifierområdet og kvalifiseringsområdet forblir konstanten på tvers av prøver. Den interne standarden overvåkes også for å sikre at hver prøveinjeksjon normaliseres. I denne analysen ble et praktisk utvalg av 15 hårprøver blant en total studiepopulasjon på 96 pasienter som tok legemiddelresistente TB-legemidler under direkte observerte behandlingsforhold fra Western Cape, Sør-Afrika evaluert for å bestemme representative nivåer av legemiddelresistente TB-legemidler på tvers av de laveste og høyeste nivåene for hver analyte.I fravær av en solid fase ekstraksjon eller filtrering trinn, vær forsiktig når du overfører supernatanten til fordampningsrørene. Alt som overføres til rørene kan ende opp injisert i kolonnen. Siden rotoren på perleraptoren kan fly av hvis den ikke er godt skrudd eller låst, må du kontrollere rotoren før den brukes.I motsetning til antiretrovirale midler innen HIV, forblir forholdet mellom tb medisiner farmakokinetikk, etterlevelse og kliniske resultater i stor grad ikke pålagt. Vi har hypotetisk at noen TB medisiner ikke akkumuleres godt i håret. Målretting metabolitter av disse stoffene kan gi en bedre forståelse av pasientens etterlevelse.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokoll for lang varighet Whole Body Hypertermi i Mus

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopic tynntarm Transplantasjon i rotter

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kvantifisering av den immunsuppressive Tacrolimus på tørket blod Spots Bruke LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Approach for the Administration of Medications and Fluids in Emergency Scenarios and Settings

A Novel Approach for administrasjonen av medisiner og Fluids i nødsituasjoner og innstillinger

The available routes of administration commonly used for medications and fluids in the acute care setting are generally limited to oral, intravenous, or ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Network Analyse av foramen ovale elektrode Recordings i resistent tinninglappen epilepsipasienter

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nerve-sparing Midt-urethral obstruksjon (Nemo) i Female smågnagere

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metode for å kvantifisere Upper Limb Performance i dagliglivet Bruke Akselerometre

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimalisert LC--MS-/ MS metoden for høy gjennomstrømming analyse av klinisk prøver av Ivacaftor, store metabolitter og Lumacaftor i biologiske væsker Cystic Fibrosis pasienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

I Vivo Evaluering av brudd Callus utvikling i bein Healing i mus bruker en MRI-kompatibel Osteosynthesis enhet for musen Femur

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

Smak eksamen: En kort og validert Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...