Name: validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao professor Keertan Dheda, ao Dr. Ali Esmail e a Marietjie Pretorius, do Instituto de Pulmão da Universidade da Cidade do Cabo, que facilitaram a coleta de amostras de cabelo para o estudo. Os autores reconhecem ainda com gratidão as contribuições dos participantes deste estudo.

Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da coleta de amostras de cabelo. Obtivemos a aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade da Cidade do Cabo e da Universidade da Califórnia, Em São Francisco.
1. Amostragem de cabelo
<ol><li>Obter consentimento informado por escrito.</li>
	<li>Use uma tesoura limpa para cortar aproximadamente 20-30 fios de cabelo do couro cabeludo da região occipital o mais próximo possível do couro cabeludo.</l...

<ol>
	<li>Kurbatova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+poor+outcomes+among+patients+treated+for+multidrug-resistant+tuberculosis+at+DOTS-plus+projects.">Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Respiratory Medicine. , (2017).</li><li>Berg, K. M., Arnsten, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+and+conceptual+challenges+in+measuring+antiretroviral+adherence.">Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence.</a> Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).</li><li>Kagee, A., Nel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+association+between+self-report+items+for+HIV+pill+adherence+and+biological+measures.">Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures.</a> AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).</li><li>Haberer, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+to+antiretroviral+prophylaxis+for+HIV+prevention:+a+substudy+cohort+within+a+clinical+trial+of+serodiscordant+couples+in+East+Africa.">Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa.</a> PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).</li><li>Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+stop+counting+the+tablets.">Time to stop counting the tablets.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+study+of+multiple+measures+of+adherence+to+HIV+protease+inhibitors.">A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors.</a> Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).</li><li>Wendel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+use+of+electronic+adherence+monitoring+in+an+HIV+clinic.">Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic.</a> Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).</li><li>Ruiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+voriconazole+plasma+concentrations+on+treatment+response+in+critically+ill+patients.">Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutic. , (2019).</li><li>Saktiawati, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+sampling+strategies+for+therapeutic+drug+monitoring+of+first-line+tuberculosis+drugs+in+patients+with+tuberculosis.">Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis.</a> Clinical Phamacokinetics. , (2019).</li><li>Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="White+coat+compliance"+limits+the+reliability+of+therapeutic+drug+monitoring+in+HIV-1-infected+patients.">"White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients.</a> HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).</li><li>Cuypers, E., Flanagan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interpretation+of+hair+analysis+for+drugs+and+drug+metabolites.">The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites.</a> Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).</li><li>Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+for+drug+detection.">Hair analysis for drug detection.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).</li><li>Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair:+a+complementary+source+of+bioanalytical+information+in+forensic+toxicology.">Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology.</a> Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atazanavir+concentration+in+hair+is+the+strongest+predictor+of+outcomes+on+antiretroviral+therapy.">Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy.</a> Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).</li><li>Koss, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+concentrations+of+antiretrovirals+predict+viral+suppression+in+HIV-infected+pregnant+and+breastfeeding+Ugandan+women.">Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women.</a> AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).</li><li>Pintye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+Lopinavir+Hair+Concentrations+Are+the+Strongest+Predictor+of+Viremia+in+HIV-Infected+Asian+Children+and+Adolescents+on+Second-Line+Antiretroviral+Therapy.">Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).</li><li>Baxi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nevirapine+Concentration+in+Hair+Samples+Is+a+Strong+Predictor+of+Virologic+Suppression+in+a+Prospective+Cohort+of+HIV-Infected+Patients.">Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients.</a> PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+concentrations+in+hair+strongly+predict+virologic+response+in+a+large+HIV+treatment-naive+clinical+trial.">Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial.</a> Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).</li><li>Gerona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+11+medications+for+drug+resistant+TB+in+small+hair+samples+to+quantify+adherence+and+exposure+using+a+validate+LC-MS/MS+panel.">Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel.</a> Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).</li><li>Metcalfe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+anti-tuberculosis+drug+concentration+in+hair+and+treatment+outcomes+in+MDR-+and+XDR-TB.">Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB.</a> European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).</li><li>Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Beyond+Directly+Observed+Therapy+for+Tuberculosis.">Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis.</a> PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).</li></ol>

Relatamos aqui o protocolo para o método que desenvolvemos e validamos para quantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados no tratamento de DR-TB em pequenas amostras de cabelo utilizando LC-MS/MS. Nenhum outro método para quantificar essas 11 drogas em cabelos foi previamente desenvolvido, validado e publicado. Nosso método pode quantificar os níveis de sub-nanogramas de drogas em apenas 20-30 fios de cabelo de aproximadamente 3 centímetros (cm) de comprimento (~2 mg) e já foi validado22. O...

No século XXI, a TB resistente a medicamentos (DR-TB) é uma catástrofe em evolução para programas de controle nacional de TB já fracos, com casos confirmados dobrando apenas nos últimos 5 anos, representando quase um terço de todas as mortes relacionadas à resistência antimicrobiana globalmente1,2. O tratamento bem-sucedido da TB-DR tem exigido convencionalmente regimes de segunda linha mais longos e tóxicos do que o tratamento para a TB sensível a medicamentos. Além disso, os pacientes com TB-DR frequentemente têm desafios pré-existentes significativos para a adesão, o que contribuiu para o surgimento da resistência inicialmente3.
Ao contrário da infecção pelo HIV, onde as cargas virais podem ser usadas para monitorar o tratamento, os pontos finais substitutos da resposta ao tratamento em TB são atrasados e não são confiáveis em um nível individual4. O monitoramento da adesão do paciente, um importante preditor da concentração de medicamentos anti-TB subterapêuticos e falha no tratamento, também é desafiador. A adesão autorreferida sofre de viés de recall e o desejo de agradar aos provedores5,6. A contagem de comprimidos e os sistemas de monitoramento de eventos medicamentosos (MEMS) podem ser mais objetivos7, mas não medem o consumo real de drogas8,,9,10. Os níveis de medicamentos em biomatrices podem fornecer dados de adesão e farmacocinética. Portanto, os níveis de fárres plasmáticos são comumente utilizados no monitoramento de drogas terapêuticas11,12. No contexto do monitoramento da adesão a medicamentos, no entanto, os níveis plasmáticos representam exposição a curto prazo e são limitados por significativa variabilidade intra e interpaciente ao determinar a faixa de referência de adesão adequada. Os efeitos do "jaleco branco", onde a adesão melhora antes das visitas clínicas ou de estudo, complicam ainda mais a capacidade dos níveis plasmáticos de fornecer padrões precisos de adesão a medicamentos13.
O cabelo é uma biomatriz alternativa que pode medir a exposição a medicamentos a longo prazo14,15. Muitas drogas e metabólitos endógenos incorporam-se à matriz proteica capilar da circulação sistêmica à medida que o cabelo cresce. Como esse processo dinâmico continua durante o crescimento capilar, a quantidade de droga depositada na matriz capilar depende da presença contínua da droga em circulação, tornando o cabelo uma excelente leitura temporal da ingestão de drogas. O cabelo como biomatriz tem a vantagem adicional de ser facilmente coletado sem a necessidade de cadeia fria para armazenamento e expedição em comparação com o sangue. Além disso, o cabelo não é bioperigoso, o que proporciona vantagens adicionais de viabilidade no campo.
Os níveis de drogas capilares têm sido usados há muito tempo em aplicações forenses16. Na última década, os níveis de antirretroviral capilar (ARV) demonstraram utilidade na avaliação da adesão de medicamentos no tratamento e prevenção do HIV, para os quais nosso grupo contribuiu. Os níveis de ARV nos cabelos têm se mostrado os mais fortes preditores independentes dos desfechos de tratamento na infecção pelo HIV17,18,19,20,21. Para determinar se os níveis de cabelo dos pacientes com TB-DR terão a mesma utilidade na previsão do resultado do tratamento, utilizou-se o LC-MS/MS para desenvolver e validar um método para analisar 11 medicamentos DR-TB em pequenas amostras de cabelo. Como avaliação inicial do desempenho do ensaio, medimos os níveis de medicamentos DR-TB em uma amostra de conveniência de pacientes com TB-DR recebendo terapia observada diretamente (DOT) no Cabo Ocidental, África do Sul22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:755px;" width="755">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5182-0716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250 uL injection vial inserts</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead ruptor 24</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline-d6</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine-d7</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable lime glass culture tubes</td>
			<td style="width:211px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">60825-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">E890420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">ClearSynth</td>
			<td>CS-O-06597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F0507-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">1395-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot Shaker</td>
			<td style="width:211px;">Bellco Glass Inc</td>
			<td style="width:161px;">7746-32110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">Infinity 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">230-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:211px;">Aqua Solutions Inc</td>
			<td style="width:161px;">W1089-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">I821450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>I821452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">00D-4371-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-8788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge holder</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC-MS/MS quantitation software</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Multiquant 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR">1362103-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin-d8</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L360002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid-d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:211px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:161px;">695554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin-13C, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">M745003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS/MS</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Triple Quad 5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPC 14714</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>O667600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pretomanid (PA-824)</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:161px;">P122500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Prothionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prothionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide-15N, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Septum caps for injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5185-5862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbovap LV evaporator</td>
			<td style="width:211px;">Biotage</td>
			<td style="width:161px;">103198/11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples

A tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) é uma ameaça crescente à saúde pública, e a avaliação dos níveis de medicamentos terapêuticos pode ter importantes benefícios clínicos. Os níveis de drogas plasmáticas são a avaliação padrão-ouro atual, mas requerem flebotomia e uma cadeia fria, e capturam apenas a adesão muito recente. Nosso método utiliza o cabelo, uma matriz que é facilmente coletada e reflexo da adesão a longo prazo, para testar 11 medicamentos anti-TB. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostram que os níveis de drogas antirretrovirais nos cabelos estão associados aos desfechos do HIV. Nosso método para drogas DR-TB utiliza 2 mg de cabelo (3 cm proximal à raiz), que é pulverizado e extraído em metanol. As amostras são analisadas com um único método LC-MS/MS, quantificando 11 medicamentos em um período de 16 minutos. Os limites mais baixos de quantificação (LLOQs) para os 11 fármacos variam de 0,01 ng/mg a 1 ng/mg. A presença de drogas é confirmada comparando-se as razões de duas transições de espectrometria de massa. As amostras são quantificadas usando a proporção da droga para o iotopologue de droga denominado, 15N-, ou 13C-labeled. Utilizou-se uma curva de calibração variando de 0,001-100 ng/mg. A aplicação do método a uma amostra de conveniência de amostras de cabelo coletadas de pacientes com DR-TB em terapia diretamente observada (DOT) indicou níveis de fármacos no cabelo dentro da faixa dinâmica linear de nove das onze drogas (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimina, bedaquiline, pretomanid). Nenhum paciente estava em prothionamida, e os níveis medidos de ethionamida estavam próximos de seu LLOQ (com trabalho suplementar, examinando a adequação do metabólito da ethionamida para a exposição ao monitoramento). Em resumo, descrevemos o desenvolvimento de um painel multi-anilte para medicamentos DR-TB no cabelo como uma técnica de monitoramento de drogas terapêuticas durante o tratamento de TB resistente a medicamentos.

Uma ilustração de um cromatograma com níveis confirmados de todas as 11 drogas DR-TB é mostrada na Figura 1. O tempo de retenção de cada analizadopode mudar ao usar diferentes instrumentos e colunas, de modo que o tempo exato de retenção deve ser determinado individualmente.
Os Cromatogramas de Íon extraídos (EICs) para uma droga específica (isoniazida, INH) em um dos calibradores (amostra de cabelo em branco cravada com padrões de referência de droga...

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Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Os métodos atuais de análise da adesão dos pacientes a regimes complexos de tuberculose resistente a medicamentos (DR-TB) podem ser imprecisos e intensivos em recursos. Nosso método analisa o cabelo, uma matriz facilmente coletada e armazenada, para concentrações de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar níveis de drogas de sub-nanogramas que podem ser utilizados para entender melhor a adesão aos medicamentos.

Painel LC-MS/MS validado para quantificar 11 medicamentos resistentes a medicamentos para tuberculose em amostras de cabelos pequenos

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

A adesão do paciente é muito desafiadora e o metabolismo medicamentoso pode variar de pessoa para pessoa, de modo que a medição objetiva dos níveis de medicamentos pode ser importante na prevenção do surgimento da resistência durante o tratamento da TB. Se a adesão pudesse ser mais precisa e facilmente quantificada, então os profissionais de saúde poderiam desenvolver um plano de tratamento que limitasse o desenvolvimento da resistência a medicamentos. Desenvolvemos o primeiro painel de espectrometria de massa de analito múltiplo para múltiplos medicamentos para TB dentro de pequenas amostras de cabelo em um único ensaio.Nosso painel multidrogas requer apenas uma amostra de dois miligramas por paciente e não usa extração de fase sólida ou etapa de filtragem para evitar qualquer perda de volume amostral. Medidas objetivas de exposição a medicamentos medidas no início do curso de tratamento poderiam potencialmente alertar os médicos para problemas com medicamentos individuais no regime de tratamento. As amostras de cabelo devem ser pulverizadas no dia da análise para uma medição precisa do nível de concentração de drogas.Para adquirir amostras de cabelo, após obter o consentimento por escrito informado, prepare os materiais, incluindo um rótulo fino, dois rótulos participantes, um par de tesouras, um pedaço desdobrado de papel alumínio, um lenço de álcool e um saco plástico. Limpe as lâminas da tesoura com um lenço de álcool. Vá para a parte de trás da cabeça e levante a parte superior do cabelo usando um grampo de cabelo, se desejar.Reúna 30 fios de cabelo da parte de trás da cabeça e isole a palha com a mão. Leve a tesoura até o couro cabeludo e corte a palha do cabelo. Coloque cuidadosamente a palha do cabelo na folha de alumínio.Coloque o rótulo fino sobre a extremidade distal da palha do cabelo, gravando-a firmemente na folha de alumínio. A extremidade distal é o lado mais distante do couro cabeludo. Dobre sobre o pedaço de papel alumínio em cima da palha do cabelo e coloque uma etiqueta participante em cima da folha de alumínio.Coloque o pedaço dobrado sobre a folha de alumínio no saco plástico e coloque outra etiqueta participante em cima do saco plástico. Para extração de drogas das amostras de cabelo, pese dois miligramas de cada amostra de cabelo em tubos de contas rotulados individualmente e dois miligramas da amostra de cabelo em branco em cada um dos 16 tubos adicionais de contas. Após a pesagem, coloque todos os tubos de contas em um homogeneizador de moinho de contas e homogeneize as amostras a uma velocidade de 6,95 metros por segundo para dois ciclos de 30 segundos com um período de descanso de 15 segundos entre cada ciclo.Após a segunda homogeneização, adicione 500 microliters da mistura padrão interna apropriada a cada amostra e adicione 500 microliters de metanol ao tubo em branco da matriz. Espete os tubos de curva de calibração com o volume apropriado de mistura padrão de referência de acordo com a mesa e coloque todos os tubos em um banho de água de 37 graus com agitação suave por duas horas. No final da incubação, transfira o supernascer de cada tubo de contas para novos tubos de microcentrifuuge rotulados e adicione 500 microliters de metanol aos tubos de contas.Vórtice dos tubos de contas e transfira a lavagem de metanol para os tubos de microcentrifuuge correspondentes. Centrifugar as amostras e transferir cuidadosamente os supernantes para novos tubos sem perturbar as pelotas de cabelo. Evaporar o líquido nos tubos até secar a 32 graus Celsius e reconstituir as amostras com 200 microliters de água de grau de cromatografia líquida de alta pressão com ácido 1% fórmico.Após o vórtice, transfira as amostras líquidas para frascos âmbar com 250 inserções de microliteres. Para a espectrometria de massa de cromatografia líquida, instale primeiro uma coluna de dois a 100 milímetros com tamanho de partícula de 2,5 micrômetros e tamanho de 100 poros angstrom com contas de fenol etherlinked polar totalmente feitas de sílica porosa no compartimento da coluna. Confirme se a coluna também tem um cartucho de guarda recomendado pelo fabricante instalado.Copie e cole as informações compostas incluídas nas transições do método LCMS MDR-TB. arquivo csv na caixa na janela de especificação de massa. Em uma planilha, crie uma sequência em lote da curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração, controles de qualidade, amostras de pacientes, curva de calibração e controles de qualidade.Adicione injeções em branco de solvente no início e no final da corrida, bem como antes e depois da curva de calibração, controles de qualidade e amostras do paciente. Em seguida, coloque pelo menos oito injeções em branco de solvente nas injeções na curva de calibração e no frasco de controle de alta qualidade para reduzir a transferência de analito. Quando os lotes terminarem, abra o software de quantitação.Role as transições para garantir que o tempo de retenção selecionado automaticamente seja preciso e verifique se a suavização gaussiana está definida como 1.5. Em seguida, clique em exibir a curva de calibração e a regressão e defina o tipo de espera para um sobre x. Clique em OK e valide a curva de calibração e as amostras de controle de qualidade para garantir que o lote seja ranuado com sucesso.Para cada analito de referência do quantificador, pelo menos dois terços dos pontos de calibração devem ter uma precisão dentro de 80-120% Verifique se o valor R exibido acima da curva de calibração é superior a 0,975. Se todas as condições acima estiverem satisfeitas, o lote passou e as amostras podem ser quantificadas. Clique em Editar na barra de ferramentas e clique em Copiar a tabela inteira.Em seguida, cole a tabela em uma planilha e use a média da concentração calculada das duas injeções amostrais para determinar a concentração relatada de cada amostra. Aqui é mostrada uma ilustração de um cromatograma com níveis confirmados de todos os 11 medicamentos resistentes a medicamentos resistentes a medicamentos. Nestas figuras, podem ser observados cromatogramas de íons extraídos para uma determinada droga em um dos calibradores.As transições do quantificador e da qualificação são utilizadas para confirmar qualitativamente a presença da droga, pois a razão entre a área do quantificador e a área de qualificação permanece a constante entre as amostras. O padrão interno também é monitorado para garantir que cada injeção de amostra seja normalizada. Nesta análise, uma amostra conveniente de 15 amostras de cabelo entre uma população total de 96 pacientes que tomam medicamentos resistentes a medicamentos para TB sob condições terapêuticas diretamente observadas do Cabo Ocidental, África do Sul foi avaliada para determinar níveis representativos de medicamentos resistentes a medicamentos para TB nos níveis mais baixos e mais altos para cada analito.Na ausência de uma fase sólida de extração ou etapa de filtragem, tome cuidado ao transferir o sobrenatante para os tubos de evaporação. Qualquer coisa transferida para os tubos pode acabar injetada na coluna. Como o rotor do raptor de contas pode voar se não estiver bem aparafusado ou bloqueado, certifique-se de verificar novamente o rotor antes de operar.Em contraste com os antirretrovirais no campo do HIV, a relação entre a farmacocinética medicamentosa de TB, a adesão e os desfechos clínicos permanece em grande parte não estudada. Temos a hipótese de que alguns medicamentos para tuberculose não se acumulam bem no cabelo. Direcionar os metabólitos dessas drogas pode proporcionar uma melhor compreensão da adesão do paciente.

Research

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