Name: validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Los autores quisieran dar las gracias al profesor Keertan Dheda, al Dr. Ali Esmail y Marietjie Pretorius en el Instituto de Pulmón de la Universidad de Ciudad del Cabo, quien facilitó la recolección de muestras de cabello para el estudio. Los autores agradecen además las contribuciones de los participantes de este estudio.

Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito antes de la recolección de muestras de cabello. Obtuvimos la aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Ciudad del Cabo y la Universidad de California, San Francisco.
1. Muestreo capilar
<ol><li>Obtener consentimiento informado por escrito.</li>
	<li>Use tijeras limpias para cortar aproximadamente 20-30 hebras de cabello del cuero cabelludo de la región occipital lo más cerca posible del c...

<ol>
	<li>Kurbatova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+poor+outcomes+among+patients+treated+for+multidrug-resistant+tuberculosis+at+DOTS-plus+projects.">Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Respiratory Medicine. , (2017).</li><li>Berg, K. M., Arnsten, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+and+conceptual+challenges+in+measuring+antiretroviral+adherence.">Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence.</a> Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).</li><li>Kagee, A., Nel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+association+between+self-report+items+for+HIV+pill+adherence+and+biological+measures.">Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures.</a> AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).</li><li>Haberer, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+to+antiretroviral+prophylaxis+for+HIV+prevention:+a+substudy+cohort+within+a+clinical+trial+of+serodiscordant+couples+in+East+Africa.">Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa.</a> PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).</li><li>Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+stop+counting+the+tablets.">Time to stop counting the tablets.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+study+of+multiple+measures+of+adherence+to+HIV+protease+inhibitors.">A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors.</a> Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).</li><li>Wendel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+use+of+electronic+adherence+monitoring+in+an+HIV+clinic.">Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic.</a> Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).</li><li>Ruiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+voriconazole+plasma+concentrations+on+treatment+response+in+critically+ill+patients.">Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutic. , (2019).</li><li>Saktiawati, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+sampling+strategies+for+therapeutic+drug+monitoring+of+first-line+tuberculosis+drugs+in+patients+with+tuberculosis.">Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis.</a> Clinical Phamacokinetics. , (2019).</li><li>Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="White+coat+compliance"+limits+the+reliability+of+therapeutic+drug+monitoring+in+HIV-1-infected+patients.">"White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients.</a> HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).</li><li>Cuypers, E., Flanagan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interpretation+of+hair+analysis+for+drugs+and+drug+metabolites.">The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites.</a> Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).</li><li>Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+for+drug+detection.">Hair analysis for drug detection.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).</li><li>Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair:+a+complementary+source+of+bioanalytical+information+in+forensic+toxicology.">Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology.</a> Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atazanavir+concentration+in+hair+is+the+strongest+predictor+of+outcomes+on+antiretroviral+therapy.">Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy.</a> Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).</li><li>Koss, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+concentrations+of+antiretrovirals+predict+viral+suppression+in+HIV-infected+pregnant+and+breastfeeding+Ugandan+women.">Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women.</a> AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).</li><li>Pintye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+Lopinavir+Hair+Concentrations+Are+the+Strongest+Predictor+of+Viremia+in+HIV-Infected+Asian+Children+and+Adolescents+on+Second-Line+Antiretroviral+Therapy.">Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).</li><li>Baxi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nevirapine+Concentration+in+Hair+Samples+Is+a+Strong+Predictor+of+Virologic+Suppression+in+a+Prospective+Cohort+of+HIV-Infected+Patients.">Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients.</a> PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+concentrations+in+hair+strongly+predict+virologic+response+in+a+large+HIV+treatment-naive+clinical+trial.">Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial.</a> Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).</li><li>Gerona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+11+medications+for+drug+resistant+TB+in+small+hair+samples+to+quantify+adherence+and+exposure+using+a+validate+LC-MS/MS+panel.">Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel.</a> Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).</li><li>Metcalfe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+anti-tuberculosis+drug+concentration+in+hair+and+treatment+outcomes+in+MDR-+and+XDR-TB.">Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB.</a> European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).</li><li>Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Beyond+Directly+Observed+Therapy+for+Tuberculosis.">Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis.</a> PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).</li></ol>

Aquí informamos del protocolo para el método que desarrollamos y validamos para cuantificar 11 medicamentos anti-TB utilizados en el tratamiento de la TB-DR en muestras de cabello pequeño utilizando LC-MS/MS. Ningún otro método para cuantificar estos 11 fármacos en el cabello ha sido previamente desarrollado, validado y publicado. Nuestro método puede cuantificar los niveles de subnanogramos de fármacos en sólo 20-30 hebras de cabello de aproximadamente 3 centímetros (cm) de longitud (2 mg) y ya ha sido validad...

En el siglo XXI, la tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una catástrofe en evolución para los ya débiles programas nacionales de control de la tuberculosis, con casos confirmados que se duplican solo en los últimos 5 años, lo que representa casi un tercio de todas las muertes relacionadas con la resistencia a los antimicrobianos en todo el mundo1,2. El tratamiento exitoso de la TB-DR ha requerido convencionalmente regímenes de segunda línea más largos y tóxicos que el tratamiento para la tuberculosis sensible a los medicamentos. Además, los pacientes con TB-DR a menudo tienen importantes desafíos preexistentes a la adherencia, lo que contribuyó a la aparición de resistencia inicialmente3.
A diferencia de la infección por VIH, en la que se pueden utilizar cargas virales para controlar el tratamiento, las variables sustitutas de la respuesta al tratamiento en la tuberculosis se retrasan y no son fiables en un nivel individual4. El control de la adherencia de los pacientes, un importante predictor de la concentración de fármacos antituberculosos y la insuficiencia del tratamiento, también es un desafío. La adherencia autoinformada sufre de sesgo de recuerdo y el deseo de complacer a los proveedores5,,6. Los recuentos de píldoras y los sistemas de monitoreo de eventos de medicamentos (MEMS) pueden ser más objetivo7 pero no miden el consumo real de drogas8,9,10. Los niveles de fármacos en las biomatrices pueden proporcionar datos de adherencia y farmacocinéticos. Por lo tanto, los niveles plasmáticos de fármacos se utilizan comúnmente en la monitorización terapéutica de fármacos11,12. Sin embargo, en el contexto de la monitorización de la adherencia a los medicamentos, los niveles plasmáticos representan una exposición a corto plazo y están limitados por una variabilidad significativa dentro e interpaciente al determinar el rango de referencia de adherencia adecuado. Efectos de "capa blanca", donde la adherencia mejora antes de las visitas a la clínica o al estudio, complica aún más la capacidad de los niveles plasmáticos para proporcionar patrones precisos de adherencia a los medicamentos13.
El cabello es una biomatriz alternativa que puede medir la exposición a largo plazo a fármacos14,,15. Muchos fármacos y metabolitos endógenos se incorporan a la matriz de proteína capilar de la circulación sistémica a medida que crece el cabello. A medida que este proceso dinámico continúa durante el crecimiento del cabello, la cantidad de droga depositada en la matriz capilar depende de la presencia continua de la droga en circulación, haciendo del cabello una excelente lectura temporal de la ingesta de drogas. El cabello como biomatriz tiene la ventaja adicional de ser fácilmente recogido sin la necesidad de cadena de frío para el almacenamiento y el envío en comparación con la sangre. Además, el cabello no es biopeligroso, lo que proporciona ventajas de viabilidad adicionales en el campo.
Los niveles de drogas capilares se han utilizado durante mucho tiempo en aplicaciones forenses16. Durante la última década, los niveles de antirretroviral del cabello han demostrado utilidad en la evaluación de la adherencia a las drogas en el tratamiento y la prevención del VIH, a lo que nuestro grupo contribuyó. Se ha demostrado que los niveles de ARV en el cabello son los predictores independientes más fuertes de los resultados del tratamiento en la infección por VIH17,18,19,20,21. Para determinar si los niveles capilares de pacientes con TB-DR tendrán la misma utilidad para predecir el resultado del tratamiento, utilizamos LC-MS/MS para desarrollar y validar un método para analizar 11 medicamentos de TB-DR en muestras de cabello pequeño. Como evaluación inicial del rendimiento del ensayo, medimos los niveles de fármacos contra la tuberculosis retro en una muestra de conveniencia de pacientes con TB-DR que reciben terapia observada directamente (DOT) en el Cabo Occidental, Sudáfrica22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:755px;" width="755">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5182-0716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250 uL injection vial inserts</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead ruptor 24</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline-d6</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine-d7</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable lime glass culture tubes</td>
			<td style="width:211px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">60825-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">E890420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">ClearSynth</td>
			<td>CS-O-06597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F0507-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">1395-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot Shaker</td>
			<td style="width:211px;">Bellco Glass Inc</td>
			<td style="width:161px;">7746-32110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">Infinity 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">230-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:211px;">Aqua Solutions Inc</td>
			<td style="width:161px;">W1089-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">I821450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>I821452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">00D-4371-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-8788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge holder</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC-MS/MS quantitation software</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Multiquant 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR">1362103-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin-d8</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L360002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid-d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:211px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:161px;">695554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin-13C, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">M745003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS/MS</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Triple Quad 5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPC 14714</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>O667600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pretomanid (PA-824)</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:161px;">P122500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Prothionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prothionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide-15N, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Septum caps for injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5185-5862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbovap LV evaporator</td>
			<td style="width:211px;">Biotage</td>
			<td style="width:161px;">103198/11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples

La tuberculosis farmacorresistente (TB-DR) es una amenaza creciente para la salud pública, y la evaluación de los niveles de medicamentos terapéuticos puede tener importantes beneficios clínicos. Los niveles de fármacos plasmáticos son la evaluación estándar de oro actual, pero requieren flebotomía y una cadena de frío, y capturan sólo una adherencia muy reciente. Nuestro método utiliza el cabello, una matriz que se recoge fácilmente y refleja la adherencia a largo plazo, para probar 11 medicamentos antituberculosos. El trabajo previo de nuestro grupo muestra que los niveles de medicamentos antirretrovirales en el cabello están asociados con los resultados del VIH. Nuestro método para fármacos DR-TB utiliza 2 mg de cabello (3 cm proximal a la raíz), que se pulveriza y se extrae en metanol. Las muestras se analizan con un único método LC-MS/MS, cuantificando 11 fármacos en una carrera de 16 minutos. Los límites más bajos de cuantificación (LLOQ) para los 11 fármacos oscilan entre 0,01 ng/mg y 1 ng/mg. La presencia de fármacos se confirma comparando las relaciones de dos transiciones de espectrometría de masas. Las muestras se cuantifican utilizando la relación de área del fármaco con la isotopotopopotopopoca delaterated, 15N-, o 13Con etiqueta C. Utilizamos una curva de calibración que va desde 0.001-100 ng/mg. La aplicación del método a una muestra de conveniencia de muestras capilares recogidas de pacientes con TB-DR en terapia observada directamente (DOT) indicó niveles de fármacos en el cabello dentro del rango dinámico lineal de nueve de los once fármacos (isoniazida, pirazinamida, ethambutol, linezolid, levofloxacino, moxifloxacino, clofazimine, bedaquilina, pretomanide). Ningún paciente estaba tocando protionamida, y los niveles medidos de etionamida estaban cerca de su LLOQ (con trabajo adicional en lugar de examinar la idoneidad del metabolito de etionamida para monitorear la exposición). En resumen, describimos el desarrollo de un panel multianálisis para fármacos contra la TUBERCULOSIS en el cabello como una técnica para el monitoreo terapéutico de fármacos durante el tratamiento de la tuberculosis farmacorresistente.

En la Figura 1se muestra una ilustración de un cromatograma con niveles confirmados de los 11 fármacos contra la tuberculosis antirretropara desastres. El tiempo de retención para cada analito puede cambiar cuando se utilizan diferentes instrumentos y columnas, por lo que el tiempo de retención exacto debe determinarse individualmente.
Los cromatógramas de iones extraídos (EICI) para un medicamento en particular (isoniazida, INH) en uno de los calibradores (...

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Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Los métodos actuales para analizar la adherencia de los pacientes a regímenes complejos de tuberculosis farmacorresistente (DR-TB) pueden ser inexactos e intensivos en recursos. Nuestro método analiza el cabello, una matriz fácilde de recoger y almacenar, para concentraciones de 11 medicamentos DR-TB. Usando LC-MS/MS, podemos determinar los niveles de fármacos subnanogramos que se pueden utilizar para entender mejor la adherencia a los medicamentos.

Panel LC-MS/MS validado para cuantificar 11 medicamentos resistentes a la tuberculosis en muestras de pelo pequeño

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

La adherencia del paciente es muy difícil y el metabolismo de los fármacos puede variar de persona a persona, por lo que la medición objetiva de los niveles de los medicamentos puede resultar importante para prevenir la aparición de resistencia durante el tratamiento de la tuberculosis. Si la adherencia pudiera cuantificarse con mayor precisión y facilidad, entonces los proveedores de atención médica podrían desarrollar un plan de tratamiento que limitara el desarrollo de resistencia a los medicamentos. Hemos desarrollado el primer panel de espectrometría de masas de analito múltiple para múltiples medicamentos para la tuberculosis dentro de muestras de cabello pequeño en un solo ensayo.Nuestro panel multi-fármaco solo requiere una muestra de dos miligramos por paciente y no utiliza ni extracción de fase sólida ni paso de filtrado para evitar cualquier pérdida de volumen de muestra. Las medidas objetivas de exposición a medicamentos medidas al principio del curso de tratamiento podrían alertar potencialmente a los médicos sobre los problemas con los medicamentos individuales en el régimen de tratamiento. Las muestras de cabello deben pulverizarse el día del análisis para una medición precisa del nivel de concentración de fármacos.Para adquirir muestras de cabello, después de obtener el consentimiento informado por escrito, prepare materiales que incluyan una etiqueta delgada, dos etiquetas de participante, un par de tijeras, una pieza desplegada de papel de aluminio, una toallita de alcohol y una bolsa de plástico. Limpie las cuchillas de las tijeras con una toallita con alcohol. Ve a la parte posterior de la cabeza y levanta la parte superior del cabello usando un clip para el cabello si lo deseas.Reúne 30 hebras de pelo de la parte posterior de la cabeza y aísla la paja con la mano. Lleva las tijeras hasta el cuero cabelludo y corta la paja del cabello. Coloque cuidadosamente la paja del cabello en la lámina de aluminio.Coloque la etiqueta delgada sobre el extremo distal de la paja del cabello, pegándola firmemente a la lámina de aluminio. El extremo distal es el lado más alejado del cuero cabelludo. Doblar sobre la pieza de papel de aluminio en la parte superior de la paja del cabello y poner una etiqueta de participante en la parte superior de la lámina de aluminio.Coloque la pieza doblada sobre papel de aluminio en la bolsa de plástico y coloque otra etiqueta participante en la parte superior de la bolsa de plástico. Para la extracción de fármacos de las muestras de cabello, pesar dos miligramos de cada muestra de cabello en tubos de cuenta etiquetados individualmente y dos miligramos de la muestra de cabello en blanco en cada uno de 16 tubos de cuentas adicionales. Después del pesaje, coloque todos los tubos de perlas en un homogeneizador de molino de cuentas y homogeneice las muestras a una velocidad de 6,95 metros por segundo durante dos ciclos de 30 segundos con un período de reposo de 15 segundos entre cada ciclo.Después de la segunda homogeneización, añadir 500 microlitros de la mezcla estándar interna apropiada a cada muestra y añadir 500 microlitros de metanol al tubo en blanco de la matriz. Espiba los tubos de curva de calibración con el volumen adecuado de mezcla estándar de referencia según la mesa y coloque todos los tubos en un baño de agua de 37 grados con agitación suave durante dos horas. Al final de la incubación, transfiera el sobrenadante de cada tubo de perla a nuevos tubos de microcentrífuga etiquetados y agregue 500 microlitros de metanol a los tubos de perlas.Vórtice los tubos de cuenta y transfiera el lavado de metanol a los tubos de microcentrífuga correspondientes. Centrifugar las muestras y transferir cuidadosamente los sobrenadantes a nuevos tubos sin molestar los pellets capilares. Evaporar el líquido en los tubos a sequedad a 32 grados Celsius y reconstituir las muestras con 200 microlitros de cromatografía líquida de alta presión grado agua con 1%ácido fórmico.Después del vórtice, transfiera las muestras líquidas a viales de ámbar con 250 inserciones de microlitros. Para la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida, instale primero una columna de dos a 100 milímetros con un tamaño de partícula de 2,5 micrómetros y un tamaño de poro de angstrom de 100 con perlas de fenol etherlinked polar-endcaped completamente hechas de sílice porosa en el compartimiento de la columna. Confirme que la columna también tiene instalado un cartucho de protección recomendado por el fabricante.Copie y pegue la información compuesta incluida en las transiciones del método MDR-TB LCMS. csv en el cuadro de la ventana de especificación de masa. En una hoja de cálculo, cree una secuencia por lotes de la curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración, controles de calidad, muestras de pacientes, curva de calibración y controles de calidad.Añada inyecciones en blanco solventes al inicio y al final de la carrera, así como antes y después de la curva de calibración, los controles de calidad y las muestras del paciente. A continuación, coloque al menos ocho inyecciones en blanco de disolvente en las inyecciones en la curva de calibración y el vial de control de alta calidad para reducir el arrastre del analito. Cuando se completen los lotes, abra el software de cuantificación.Desplácese por las transiciones para asegurarse de que el tiempo de retención seleccionado automáticamente es preciso y compruebe que el suavizado gaussiano está establecido en 1.5. A continuación, haga clic en muestra la curva de calibración y la regresión y establezca el tipo de espera en uno sobre x. Haga clic en Aceptar y valide la curva de calibración y las muestras de control de calidad para asegurarse de que el lote se ejecutó correctamente.Para cada analito de referencia del cuantificador, al menos dos tercios de los puntos de calibración deben tener una precisión dentro del 80-120%Compruebe que el valor R mostrado por encima de la curva de calibración es mayor que 0,975. Si se cumplen todas las condiciones anteriores, el lote ha pasado y las muestras se pueden cuantificar. Haga clic en Editar en la barra de herramientas y haga clic en Copiar toda la tabla.A continuación, pegue la tabla en una hoja de cálculo y utilice el promedio de la concentración calculada de las dos inyecciones de muestra para determinar la concentración notificada de cada muestra. Aquí se muestra una ilustración de un cromatograma con niveles confirmados de todos los 11 medicamentos farmacorresistentes probados. En estas cifras, se pueden observar los cromatogramas iónicos extraídos para un medicamento en particular en uno de los calibradores.Las transiciones del cuantificador y del calificador se utilizan para confirmar cualitativamente la presencia del medicamento, ya que la relación entre el área del cuantificador y el área del calificador sigue siendo la constante entre las muestras. El estándar interno también se supervisa para garantizar que cada inyección de muestra se normaliza. En este análisis, se evaluó una muestra conveniente de 15 muestras de cabello entre una población total de 96 pacientes que toman medicamentos resistentes a los medicamentos en condiciones de tratamiento con tuberculosis en el Cabo Occidental de Sudáfrica para determinar los niveles representativos de medicamentos resistentes a la tuberculosis en los niveles más bajos y más altos de cada analito.En ausencia de una fase sólida de extracción o paso de filtrado, tenga cuidado al transferir el sobrenadante a los tubos de evaporación. Cualquier cosa transferida a los tubos puede terminar inyectada en la columna. Como el rotor del raptor de cuentas puede volar si no está bien atornillado o bloqueado, asegúrese de comprobar dos veces el rotor antes de operar.A diferencia de los antirretrovirales en el campo del VIH, la relación entre la farmacocinética de medicamentos para la tuberculosis, la adherencia y los resultados clínicos sigue siendo en gran medida no estudiada. Hemos hipotetizado que algunos medicamentos para la tuberculosis no se acumulan bien en el cabello. Dirigirse a los metabolitos de estos medicamentos puede proporcionar una mejor comprensión de la adherencia del paciente.

Research

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