Name: validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples
Uploaded: 2020-05-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Författarna vill tacka professor Keertan Dheda, Dr Ali Esmail, och Marietjie Pretorius vid University of Cape Town Lung Institute som underlättade insamling av hårprover för studien. Författarna erkänner vidare tacksamt bidragen från deltagarna i denna studie.

Alla patienter gav skriftligt informerat samtycke före hårprovsamling. Vi fick Institutional Review Board godkännande från University of Cape Town och University of California, San Francisco.
1. Hårprovtagning
<ol><li>Inhämta skriftligt informerat samtycke.</li>
	<li>Använd ren sax för att skära ca 20-30 hårbotten hårstrån från occipital regionen så nära hårbotten som möjligt.</li>
	<li>Placera tejp runt den distala sidan av håret för att indikera riktning. Vik hårprov i ...

<ol>
	<li>Kurbatova, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+poor+outcomes+among+patients+treated+for+multidrug-resistant+tuberculosis+at+DOTS-plus+projects.">Predictors of poor outcomes among patients treated for multidrug-resistant tuberculosis at DOTS-plus projects.</a> Tuberculosis (Edinb). 92, 397-403 (2012).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Respiratory Medicine. , (2017).</li><li>Berg, K. M., Arnsten, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+and+conceptual+challenges+in+measuring+antiretroviral+adherence.">Practical and conceptual challenges in measuring antiretroviral adherence.</a> Journal of Acquired Immunodeficiency Syndromes (JAIDS). 43, 79-87 (2006).</li><li>Kagee, A., Nel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+association+between+self-report+items+for+HIV+pill+adherence+and+biological+measures.">Assessing the association between self-report items for HIV pill adherence and biological measures.</a> AIDS Care. 24 (11), 1448-1452 (2012).</li><li>Haberer, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adherence+to+antiretroviral+prophylaxis+for+HIV+prevention:+a+substudy+cohort+within+a+clinical+trial+of+serodiscordant+couples+in+East+Africa.">Adherence to antiretroviral prophylaxis for HIV prevention: a substudy cohort within a clinical trial of serodiscordant couples in East Africa.</a> PLoS Medicine. 10 (9), 1001511 (2013).</li><li>Pullar, T., Kumar, S., Tindall, H., Feely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+stop+counting+the+tablets.">Time to stop counting the tablets.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutics. 46 (2), 163-168 (1989).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+study+of+multiple+measures+of+adherence+to+HIV+protease+inhibitors.">A comparison study of multiple measures of adherence to HIV protease inhibitors.</a> Annals of Internal Medicine. 134 (10), 968-977 (2001).</li><li>Wendel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barriers+to+use+of+electronic+adherence+monitoring+in+an+HIV+clinic.">Barriers to use of electronic adherence monitoring in an HIV clinic.</a> Annals of Pharmacotherapy. 35, 1010-1101 (2001).</li><li>Ruiz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+voriconazole+plasma+concentrations+on+treatment+response+in+critically+ill+patients.">Impact of voriconazole plasma concentrations on treatment response in critically ill patients.</a> Clinical Pharmacology &amp; Therapeutic. , (2019).</li><li>Saktiawati, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+sampling+strategies+for+therapeutic+drug+monitoring+of+first-line+tuberculosis+drugs+in+patients+with+tuberculosis.">Optimal sampling strategies for therapeutic drug monitoring of first-line tuberculosis drugs in patients with tuberculosis.</a> Clinical Phamacokinetics. , (2019).</li><li>Podsadecki, T. J., Vrijens, B. C., Tousset, E. P., Rode, R. A., Hanna, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="White+coat+compliance"+limits+the+reliability+of+therapeutic+drug+monitoring+in+HIV-1-infected+patients.">"White coat compliance" limits the reliability of therapeutic drug monitoring in HIV-1-infected patients.</a> HIV Clinical Trials. 9 (4), 238-246 (2008).</li><li>Cuypers, E., Flanagan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interpretation+of+hair+analysis+for+drugs+and+drug+metabolites.">The interpretation of hair analysis for drugs and drug metabolites.</a> Clinical Toxicology. 56 (2), 90-100 (2018).</li><li>Knitz, P., Villain, M., Crimele, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+analysis+for+drug+detection.">Hair analysis for drug detection.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 28 (3), 442-446 (2006).</li><li>Barroso, M., Gallardo, E., Vleira, D. N., Lopez-Rivadulla, M., Queiroz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair:+a+complementary+source+of+bioanalytical+information+in+forensic+toxicology.">Hair: a complementary source of bioanalytical information in forensic toxicology.</a> Bioanalysis. 3 (1), 67-79 (2011).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atazanavir+concentration+in+hair+is+the+strongest+predictor+of+outcomes+on+antiretroviral+therapy.">Atazanavir concentration in hair is the strongest predictor of outcomes on antiretroviral therapy.</a> Clinical Infectious Diseases. 52 (10), 1267-1275 (2011).</li><li>Koss, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hair+concentrations+of+antiretrovirals+predict+viral+suppression+in+HIV-infected+pregnant+and+breastfeeding+Ugandan+women.">Hair concentrations of antiretrovirals predict viral suppression in HIV-infected pregnant and breastfeeding Ugandan women.</a> AIDS. 29 (7), 825-830 (2015).</li><li>Pintye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+Lopinavir+Hair+Concentrations+Are+the+Strongest+Predictor+of+Viremia+in+HIV-Infected+Asian+Children+and+Adolescents+on+Second-Line+Antiretroviral+Therapy.">Brief Report: Lopinavir Hair Concentrations Are the Strongest Predictor of Viremia in HIV-Infected Asian Children and Adolescents on Second-Line Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes (JAIDS). 76 (4), 367-371 (2017).</li><li>Baxi, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nevirapine+Concentration+in+Hair+Samples+Is+a+Strong+Predictor+of+Virologic+Suppression+in+a+Prospective+Cohort+of+HIV-Infected+Patients.">Nevirapine Concentration in Hair Samples Is a Strong Predictor of Virologic Suppression in a Prospective Cohort of HIV-Infected Patients.</a> PLoS One. 10 (6), 0129100 (2015).</li><li>Gandhi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiretroviral+concentrations+in+hair+strongly+predict+virologic+response+in+a+large+HIV+treatment-naive+clinical+trial.">Antiretroviral concentrations in hair strongly predict virologic response in a large HIV treatment-naive clinical trial.</a> Clinical Infectious Diseases. 5, 1044-1047 (2019).</li><li>Gerona, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+analysis+of+11+medications+for+drug+resistant+TB+in+small+hair+samples+to+quantify+adherence+and+exposure+using+a+validate+LC-MS/MS+panel.">Simultaneous analysis of 11 medications for drug resistant TB in small hair samples to quantify adherence and exposure using a validate LC-MS/MS panel.</a> Journal of Chromatography B. 1125, 121729 (2019).</li><li>Metcalfe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+anti-tuberculosis+drug+concentration+in+hair+and+treatment+outcomes+in+MDR-+and+XDR-TB.">Association of anti-tuberculosis drug concentration in hair and treatment outcomes in MDR- and XDR-TB.</a> European Respriatory Journal Open Research. 5 (2), (2019).</li><li>Metcalfe, J. Z., O'Donnell, M. R., Bangsberg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+Beyond+Directly+Observed+Therapy+for+Tuberculosis.">Moving Beyond Directly Observed Therapy for Tuberculosis.</a> PLoS Medicine. 12 (9), 1001877 (2015).</li></ol>

Vi rapportera här protokollet för den metod vi utvecklat och validerat för att kvantifiera 11 anti-TB mediciner som används vid behandling av DR-TB i små hårprover med LC-MS/MS. Ingen annan metod för att kvantifiera dessa 11 läkemedel i hår har tidigare utvecklats, validerats och publicerats. Vår metod kan kvantifiera subnanogram nivåer av läkemedel i endast 20-30 hårstrån på cirka 3 centimeter (cm) i längd (~ 2 mg) och har redan validerats22. Den låga vikten av hårt analyseras i...

Under det tjugoförsta århundradet är läkemedelsresistent tuberkulos (DR-TB) en växande katastrof för redan svaga nationella tbc-kontrollprogram, med bekräftade fall som fördubblats bara under de senaste fem åren, och står för nästan en tredjedel av alla dödsfall relaterade till antimikrobiell resistens globalt1,2. Framgångsrik behandling av DR-TB har konventionellt krävs längre och mer giftiga andra linjens regimer än behandling för läkemedelskänsliga TB. Dessutom har patienter med DR-TB ofta betydande redan existerande utmaningar att följa, vilket bidrog till uppkomsten av resistens initialt3.
Till skillnad från HIV-infektion där virusbelastningar kan användas för att övervaka behandlingen, är surrogatslutpunkter för behandlingssvar i tbc fördröjd och otillförlitliga på individnivå4. Övervakning av patientens följsamhet, en viktig prediktor för subterapeutisk anti-TB läkemedelskoncentration och behandlingssvikt, är också utmanande. Självrapporterad följsamhet lider av återkallande partiskhet och önskan att behaga leverantörer5,6. Piller räknas och medicinering händelse övervakningssystem (MEMS) kan vara mer mål7 men inte mäta faktisk drogkonsumtion8,9,10. Läkemedelsnivåer i biomatrices kan ge både följsamhet och farmakokinetiska data. Därför används plasmaläkemedelsnivåer ofta i terapeutisk läkemedelsövervakning11,12. I samband med övervakning av läkemedelshämningen representerar dock plasmanivåer kortvarig exponering och begränsas av betydande variationer inom och mellan patienter vid fastställandet av lämpligt referensområde för följsamhet. "White coat" effekter, där följsamhet förbättras före kliniken eller studiebesök, ytterligare komplicerar förmågan hos plasmanivåer för att ge korrekt läkemedelshämning mönster13.
Hår är en alternativ biomatrix som kan mäta långvarig läkemedelsexponering14,15. Många läkemedel och endogena metaboliter införliva i håret protein matris från den systemiska cirkulationen som hår växer. Eftersom denna dynamiska process fortsätter under hårväxt, beror mängden läkemedel som deponeras i hårmatrisen på den kontinuerliga närvaron av läkemedlet i omlopp, vilket gör håret till en utmärkt tidsmässig avläsning av läkemedelsintag. Hår som biomatrix har den extra fördelen av att enkelt samlas in utan behov av kylkedja för förvaring och transport jämfört med blod. Dessutom är hår icke-biohazardous, vilket ger ytterligare genomförbarhetsfördelar på fältet.
Hår narkotikanivåer har länge använts i kriminaltekniska tillämpningar16. Under det senaste årtiondet, hår antiretrovirala (ARV) nivåer har visat nytta vid bedömningen av läkemedelshämning i HIV behandling och förebyggande, som vår grupp bidragit. ARV nivåer i hår har visat sig vara den starkaste oberoende prediktorer för behandlingsresultat i HIV-infektion17,18,19,20,21. För att avgöra om hårnivåer av DR-TB patienter kommer att ha samma nytta för att förutsäga behandling resultatet, vi använde LC-MS/MS för att utveckla och validera en metod för att analysera 11 DR-TB mediciner i små hårprover. Som en första bedömning av analysens prestanda mätte vi DR-TB-läkemedelsnivåer i ett bekvämlighetsprov av patienter med DR-TB som fick direkt observerad behandling (DOT) i Västra Kapprovinsen, Sydafrika22.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:755px;" width="755">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2 mL injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5182-0716</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">250 uL injection vial inserts</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5181-8872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead ruptor 24</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Bead ruptor tubes (2 mL bead kit, 2.8mm ceramic, 2 mL microtubes)</td>
			<td style="width:211px;">OMNI International</td>
			<td style="width:161px;">19628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bedaquiline-d6</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">B119552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clofazimine-d7</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>C324302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable lime glass culture tubes</td>
			<td style="width:211px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">60825-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethambutol-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>E889802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">E890420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">ClearSynth</td>
			<td>CS-O-06597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Formic acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:161px;">F0507-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:216px;">Glass bottles</td>
			<td style="width:211px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">1395-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hot Shaker</td>
			<td style="width:211px;">Bellco Glass Inc</td>
			<td style="width:161px;">7746-32110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">Infinity 1260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade acetonitrile</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">015-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:211px;">Honeywell</td>
			<td style="width:161px;">230-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HPLC grade water</td>
			<td style="width:211px;">Aqua Solutions Inc</td>
			<td style="width:161px;">W1089-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">I821450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoniazid-d4</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>I821452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC column, Synergi 2.5 um Polar RP 100 A 100 x 2 mm</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">00D-4371-B0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-8788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LC guard cartridge holder</td>
			<td style="width:211px;">Phenomenex</td>
			<td style="width:161px;">AJ0-9000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">LC-MS/MS quantitation software</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Multiquant 2.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR">1362103-200MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levofloxacin-d8</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L360002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">L466500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Linezolid-d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>L466502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro centrifuge tubes</td>
			<td style="width:211px;">E&#38;K Scientific</td>
			<td style="width:161px;">695554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>M745000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Moxifloxacin-13C, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">M745003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MS/MS</td>
			<td style="width:211px;">Sciex</td>
			<td style="width:161px;">Triple Quad 5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPC 14714</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>O667600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pretomanid (PA-824)</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td style="width:161px;">P122500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Prothionamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Prothionamide-d5</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td>P839102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pyrazinamide-15N, d3</td>
			<td style="width:211px;">Toronto Research Chemicals</td>
			<td dir="LTR">P840602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Septum caps for injection vials</td>
			<td style="width:211px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:161px;">5185-5862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbovap LV evaporator</td>
			<td style="width:211px;">Biotage</td>
			<td style="width:161px;">103198/11</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

validated lc-ms/ms panel for quantifying 11 drug-resistant tb medications in small hair samples

Läkemedelsresistent tuberkulos (DR-TB) är ett växande hot mot folkhälsan, och bedömning av terapeutiska läkemedelsnivåer kan ha viktiga kliniska fördelar. Plasma läkemedelsnivåer är den nuvarande guldmyntfoten bedömning, men kräver phlebotomy och en kall kedja, och fånga endast mycket nyligen följsamhet. Vår metod använder hår, en matris som är lätt samlas in och reflekterande av långsiktig följsamhet, för att testa för 11 anti-TB mediciner. Tidigare arbete av vår grupp visar att antiretrovirala läkemedelsnivåer i hår är förknippade med HIV-resultat. Vår metod för DR-TB läkemedel använder 2 mg hår (3 cm proximalt till roten), som pulveriseras och extraheras i metanol. Prover analyseras med en enda LC-MS/MS-metod, kvantifiera 11 läkemedel i en 16 min körning. Lägre kvantifieringsgränser (LLOQ) för de 11 läkemedlen varierar från 0,01 ng/mg till 1 ng/mg. Läkemedelsnärvaro bekräftas genom att jämföra förhållanden mellan två masspektrometriövergångar. Prover kvantifieras med hjälp av förhållandet mellan läkemedlet och dedematerade, 15N-, eller 13C-märkta läkemedel isotopolog. Vi använde en kalibreringskurva från 0.001-100 ng/mg. Tillämpning av metoden på ett bekvämlighetsprov av hårprover som samlats in från DR-TB-patienter på direkt observerad behandling (DOT) indikerade läkemedelsnivåer i hår inom det linjära dynamiska intervallet hos nio av de elva läkemedlen (isoniazid, pyrazinamid, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). Ingen patient var på protionionamid, och de uppmätta nivåerna för etionamid var nära dess LLOQ (med ytterligare arbete i stället undersöka lämpligheten av etionamid metabolit för övervakning exponering). Sammanfattningsvis beskriver vi utvecklingen av en multi-analyte panel för DR-TB läkemedel i hår som en teknik för terapeutiska läkemedelsövervakning under läkemedelsresistenta TB behandling.

En illustration av ett kromatogram med bekräftade nivåer av alla 11 DR-TB-läkemedel visas i figur 1. Lagringstiden för varje analyt kan ändras när du använder olika instrument och kolumner, så den exakta kvarhållningstiden bör bestämmas individuellt.
De extraherade jonkromatogrammen (EIC) för ett visst läkemedel (isoniazid, INH) i en av kalibratorerna (blanka hårprov spetsade med DR-TB läkemedelsreferensstandarder) visas i figur...

Watch this Scientific Journal Video about Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples at JoVE.com

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Nuvarande metoder för att analysera patienternas anslutning till komplexa resistenta tuberkulos (DR-TB) regimer kan vara felaktiga och resurskrävande. Vår metod analyserar hår, en lättinsamlad och lagrad matris, för koncentrationer av 11 DR-TB mediciner. Med hjälp av LC-MS/MS, Vi kan bestämma sub-nanogram läkemedelsnivåer som kan användas för att bättre förstå läkemedelsuppföljsamhet.

Validerad LC-MS/MS Panel för kvantifiering 11 läkemedelsresistenta tbc-läkemedel i små hårprover

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Patientföljsamhet är mycket utmanande och läkemedelsmetabolism kan variera person till person så objektiv mätning av läkemedelsnivåer kan visa sig vara viktigt för att förhindra uppkomsten av resistens under tbc-behandling. Om följsamheten kunde kvantifieras mer exakt och enkelt kan vårdgivare utveckla en behandlingsplan som skulle begränsa utvecklingen av läkemedelsresistens. Vi har utvecklat den första flera analyt masspektrometri panel för flera TB mediciner inom små hår prover i en enda analys.Vår multi-drug panel kräver bara en två milligram prov per patient och använder varken fast fas extraktion eller filtrering steg för att förhindra förlust av prov volym. Objektiva mått på läkemedelsexponering som mäts tidigt i behandlingskursen skulle kunna varna kliniker för problem med enskilda läkemedel i behandlingsregimen. Hårprover måste pulveriseras på analysdagen för en noggrann läkemedelskoncentrationsnivåmätning.Att förvärva hårprover, efter att ha fått skriftligt informerat samtycke, få material redo inklusive en tunn etikett, två deltagare etiketter, en sax, en ovikt bit aluminiumfolie, en alkohol torka och en plastpåse. Torka av saxens blad rena med en alkoholtorka. Gå till baksidan av huvudet och lyft den övre delen av håret med hjälp av ett hårslips om så önskas.Samla ihop 30 hårstrån från bakhuvudet och isolera halm med handen. Ta ner saxen till hårbotten och klipp av halm av hår. Placera försiktigt halm av hår på aluminiumfolie.Sätt den tunna etiketten över den distala änden av hårstrået, tejpa den säkert till aluminiumfolie. Den distala änden är den sida som är längst från hårbotten. Vik över bit aluminiumfolie ovanpå håret halm och sätta en deltagare etikett ovanpå aluminiumfolie.Placera den vikta över bit aluminiumfolie i plastpåsen och sätta en annan deltagare etikett ovanpå plastpåsen. För drogutdragning från hårproverna, väg ut två milligram av varje hårprov i individuellt märkta pärlrör och två milligram av det tomma hårprovet i var och en av 16 ytterligare pärlrör. Efter vägning, placera alla av pärlan rören i en pärla kvarn homogenisator och homogenisera proverna med en hastighet av 6,95 meter per sekund för två 30-sekunders cykler med en 15-sekunders viloperiod mellan varje cykel.Efter den andra homogeniseringen, tillsätt 500 mikroliter av lämplig intern standard mix till varje prov och tillsätt 500 mikroliter metanol till matrisen blankröret. Spike kalibreringskurvan rör med lämplig volym av referens standard mix enligt tabellen och placera alla rör i en 37 graders vattenbad med skonsam skakning i två timmar. Vid inkubationens överför du supernatanten från varje pärlrör till nya märkta mikrocentrifugrör och tillsätter 500 mikroliter metanol till pärlrören.Vortexa pärlrören och överför metanoltvätten till motsvarande mikrocentrifugrör. Centrifugera proverna och överför noggrant supernatanterna till nya rör utan att störa hårpelletsen. Avdunsta vätskan i rören till torrhet vid 32 grader Celsius och rekonstituera proverna med 200 mikroliter av högt tryck vätskekromatografi grad vatten med 1%myrsyra.Efter vortexing, överför vätskeproverna till bärnstensfärgade injektionsflaska med 250 mikroliterinlägg. För vätskekromatografi tandem masspektrometri, först installera en två till 100 millimeter kolumn med en 2,5 mikrometer partikelstorlek och 100 ångström porstorlek med polära-endcapped etherlinked fenol pärlor helt gjorda av porös kiseldioxid i kolumnen facket. Bekräfta att kolumnen också har en tillverkare rekommenderade vakt patron installerat.Kopiera och klistra in den sammansatta information som ingår i MDR-TB LCMS-metoden övergångar. CSV-fil in i rutan i mass spec fönstret. I ett kalkylblad skapar du en satssekvens av kalibreringskurvan, kvalitetskontroller, patientprover, kalibreringskurva, kvalitetskontroller, patientprover, kalibreringskurva och kvalitetskontroller.Tillsätt solvent blank injektioner vid körningens start och samt före och efter kalibreringskurvan, kvalitetskontroller och patientprover. Placera sedan minst åtta lösningsmedelsstoma injektioner i injektionerna i kalibreringskurvan och den högkvalitativa kontrollflaskan för att minska analytens förd medföding. När batcharna är klara öppnar du quantitationsprogrammet.Bläddra igenom övergångarna för att säkerställa att den automatiskt valda kvarhållningstiden är korrekt och kontrollera att den gaussiska utjämningen är inställd på 1,5. Därefter klickar du på visar kalibreringskurvan och regressionen och ställer in väntetypen på en över x. Klicka på OK och validera kalibreringskurvan och kvalitetskontrollproverna för att försäkra att partiet kördes framgångsrikt.För varje kvantifierreferensalyst måste minst två tredjedelar av kalibreringspunkterna ha en noggrannhet inom 80-120%Kontrollera att det R-värde som visas ovanför kalibreringskurvan är större än 0,975. Om alla ovanstående villkor är uppfyllda har partiet passerat och proverna kan kvantifieras. Klicka på Redigera i verktygsfältet och klicka på Kopiera hela tabellen.Klistra sedan in tabellen i ett kalkylblad och använd medelvärdet av den beräknade koncentrationen av de två provinjektionerna för att bestämma den rapporterade koncentrationen av varje prov. Här visas en illustration av ett kromatogram med bekräftade nivåer av alla testade 11 läkemedelsresistenta tbc-läkemedel. I dessa siffror kan de extraherade jonkromatogrammen för ett visst läkemedel i en av kalibratorerna observeras.Kvantifieraren och kvalificerare övergångar används för att kvalitativt bekräfta förekomsten av läkemedlet som förhållandet mellan området för kvantifieraren och området för kvalet förblir konstant över prover. Den interna standarden övervakas också för att säkerställa att varje provinjektion normaliseras. I denna analys, ett bekvämt urval av 15 hårprover bland en total studie population av 96 patienter som tar läkemedelsresistenta tbc-läkemedel under direkt observerade terapi villkor från Western Cape, Sydafrika utvärderades för att fastställa representativa nivåer av läkemedelsresistenta tbc läkemedel över de lägsta och högsta nivåerna för varje analyt.Om det inte finns en utvinning eller ett filtreringssteg i fast fas, var försiktig när du överför supernatanten i förångningsrören. Allt som överförs till rören kan hamna injiceras i kolumnen. Som rotorn av pärlan raptor kan flyga av om inte tätt skruvade eller låst, se till att dubbelkolla rotorn innan du arbetar.I motsats till antiretrovirala läkemedel inom hiv är förhållandet mellan tbc-medicinering farmakokinetik, följsamhet och kliniska resultat i stort sett ostuderat. Vi har en hypotes om att vissa TB mediciner inte ackumuleras väl i håret. Inriktning på metaboliterna av dessa läkemedel kan ge en bättre förståelse av patientens följsamhet.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokoll för Långtidskurser Whole Body hypertermi hos möss

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopic tunntarmstransplantation i råttor

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Kvantifiering av Immunsuppressivum takrolimus på torkade blodfläckar Använda LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

A Novel Approach for the Administration of Medications and Fluids in Emergency Scenarios and Settings

En ny metod för administration av läkemedel och vätskor i nödsituationer och inställningar

The available routes of administration commonly used for medications and fluids in the acute care setting are generally limited to oral, intravenous, or ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Network Analys av foramen ovale Elektrodrecordings i Läkemedelsresistenta Temporallobsepilepsi Patienter

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction (NeMO) in Female Small Rodents

Nerve-sparing Mid-urethral Obstruction NeMO in Female Small Rodents

Nervsparande Mid-uretral obstruktion (NEMO) hos kvinnliga smågnagare

Partial bladder outlet obstruction (pBOO) has a high prevalence, causes significant patient burden, and immense health care costs. The most common animal ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

En metod för att kvantifiera Upper Limb Performance i det dagliga livet som använder accelerometrar

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimerad LC-MS/MS metod för High-throughput analys av kliniska prover av ivakaftor, dess huvudmetaboliter och lumakaftor i biologiska vätskor av cystisk fibros patienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Utvärdering av fraktur förhårdnader utveckling under läkning hos möss med en MRI-kompatibel osteosyntes enhet för mus lårbenet

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Taste Exam: A Brief and Validated Test

Smak prov: En kort och validerade Test

The emerging importance of taste in medicine and biomedical research, and new knowledge about its genetic underpinnings, has motivated us to supplement ...