Name: morphological and functional evaluation of axons and their synapses during axon death in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-03-16T13:00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster at JoVE.com

We willen het hele Neukomm lab bedanken voor bijdragen. Dit werk werd ondersteund door een Swiss National Science Foundation (SNSF) Assistant Professor award (subsidie 176855), de International Foundation for Research in Paraplegia (IRP, grant P180), SNSF Spark (subsidie 190919) en door steun van de Universiteit van Lausanne en de afdeling Fundamentele Neurowetenschappen (État de Vaud) aan LJN.

1. Observatie van Axon Morfologie tijdens Axon Death in de PNS
<ol><li>Vleugelblessure: gedeeltelijke verwonding van axonbundels<ol>
<li>Gebruik 5 maagdelijke vrouwtjes en 5 mannetjes van het juiste genotype(figuur 4A, P0-generatie) om kruisen bij kamertemperatuur (RT) uit te voeren. Geef P0 elke 3-4 dagen in nieuwe flesjes. Verzamel dagelijks vers eclosed volwassen1 nakomelingen (F 1-generatie) en verouder ze gedurende 7-14 dagen.</li>
		<li>Verdovende vliegen op CO2 pads. Gebruik een microschaar om de voorste vleugelader ruwweg in het midden van de vleugel te snijden(figuur 1A). Gebruik een vleugel voor de blessure en de andere vleugel als een leeftijd-matched ongewonde controle. Breng een blessure per vleugel, en zorg ervoor dat voldoende vleugels gewond (ongeveer 15 vleugels). LET OP: De hele vleugel kan worden doorgesneden, maar het is voldoende om alleen de voorste vleugelader te snijden. Dit is het sterkste deel van de vleugel.</li>
		<li>Herstel de vliegen in voedselhoudende flesjes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vleugeldissectie en visualisatie van axonen<ol>
<li>Verdeel 10 μL halocarbon olie 27 met een pipet langs een hele glazen plaat(figuur 1B).</li>
		<li>Snijd de gewonden af, evenals de niet-gewonde controlevleugel op de gewenste tijdspunten (bijvoorbeeld 1 of 7 dagen na letsel). Gebruik micro schaar te snijden, en pincet om de vleugel te grijpen. Monteer maximaal 4 vleugels in halocarbon olie 27 (Figuur 1B) en bedek ze met een cover slide.</li>
		<li>Beeld de vleugel onmiddellijk met behulp van een draaiende schijfmicroscoop. Verwerf een reeks optische secties langs de z-as met een stapgrootte van 0,33 μm en comprimeer z-stacks in één bestand voor latere analyses. LET OP: Pak niet de voorste vleugelader waar cellichamen en axonen zijn gehuisvest. Pak de vleugel in het midden. Het weefsel in vleugels is niet bevestigd; houd de tijd van het monteren van vleugels tot beeldvorming deze onder 8 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig01.jpg"> Figuur 1: Observatie van axonmorfologie tijdens axondood in de vleugel. (A) Schematische vliegvleugel met twee schaars GFP-gelabelde sensorische neuronen, die ook afzonderlijk hieronder worden aangegeven. De plaats van letsel en het waarnemingsgebied zijn aangegeven. (B) Schematische setup voor vleugelbeeldvorming. Gewonde en niet-gewonde bedieningsvleugels (grijs) zijn gemonteerd in halocarbon olie 27 (rood) op een glazen glijbaan (lichtblauw) en bedekt met een cover slide (zwart). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
2. Observatie van Axon en Synapse Morfologie tijdens Axon Death in de CNS
<ol><li>Antennal ablatie: letsel van hele axonbundels<ol>
<li>Gebruik 5 maagdelijke vrouwtjes en 5 mannetjes van het juiste genotype(figuur 5A, P0 generatie) om kruisen uit te voeren op RT. Pass P0 in nieuwe flacons om de 3-4 dagen. Verzamel dagelijks vers eclosed volwassen1 nakomelingen (F 1-generatie) en laat ze 7 tot 14 dagen verouderen.</li>
		<li>Verdovende vliegen op CO2 pads. Gebruik pincet om het rechter3e antennesegment te ableren voor eenzijdige ablatie; of zowel links als rechts3e antennesegmenten voor bilateralea-c). Dit zal verwijderen GFP-gelabelde neuronale cel lichamen, terwijl hun axonalprojecties blijven in de CNS. LET OP: Antennal ablatie severs de hele axon bundel. Als eenzijdige ablatie wordt uitgevoerd, dient de axonbundel aan de contralaterale kant (de onbejaarde antenne) als interne controle. Zorg ervoor dat u voldoende antenneablaties uitvoert (ongeveer 15 dieren).</li>
		<li>Herstel de vliegen in voedselhoudende flesjes.</li>
	</ol></li>
	<li>Hersendissectie en visualisatie van axonen<ol><li>Meng siliconen elastomer basis (9 mL) en uithardingsmiddel (1 mL) in een volumeverhouding van 10:1. Breng elk mengsel van 5 mL over in een 35 mm weefselkweekplaat en verminder de lucht die wordt geïntroduceerd door zich 's nachts te mengen met zachte agitatie in de rookkap. Het mengsel stolt binnen 24 uur. LET OP: Dissectieplaten mogen slechts één keer worden bereid en mogen meerdere keren worden gebruikt.</li>
		<li>Verdovenvliegt op CO2-pads en onthoofd volwassen hoofden met behulp van twee pincet op de gewenste tijdspunten (bijvoorbeeld 1 of 7 dagen na de ablatie van de antenne). Gebruik een pincet om de nek te grijpen, en de andere pincet om de thorax vast te stellen. Trek voorzichtig de nek en hoofd van de thorax. LET OP: Laat onthoofde hoofden op het CO2-pad totdat het gewenste aantal is bereikt, maar zorg ervoor dat u binnen 30 minuten doorgaat naar de volgende stap.</li>
		<li>Breng alle koppen over in een microcentrifugebuis van 1,5 mL met een bevestigingsoplossing van 4% paraformaldehyde (PFA) en 0,1% Triton X-100 in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een pincet die in de bevestigingsoplossing zijn gedompeld. LET OP: Vliegkoppen plakken goed op natte pincet. Het maakt het mogelijk om alle koppen gemakkelijk in de microcentrifugebuis over te brengen.</li>
		<li>Fix koppen voor 20 min met zachte agitatie op RT. Zet de microcentrifuge buis op ijs, hoofden zal aangetrokken tot de bodem van de microcentrifuge buis. Verwijder de supernatant met een pipet en herhaal deze procedure met vijf 2 min wasbeurten met 1 mL wasbuffer met 0,1% Triton X-100 in PBS met zachte agitatie bij RT, om de restbevestigingsoplossing te verwijderen. OPMERKING: Video's over het ontleden van volwassen Drosophila hersenen zijn direct beschikbaar27.</li>
		<li>Breng de koppen met een glazen pipet in een dissectieplaat gevuld met wasbuffer. Gebruik een pincet te grijpen en trek de slurf van het hoofd, terwijl het hoofd met de andere pincet. Dit zal een gat achterlaten als de slurf aan het exoskelet was bevestigd.</li>
		<li>Gebruik twee pincet om het exoskelet tussen het gat en elk samengesteld oog te verwijderen. Dit zal het mogelijk maken om de hoofdstructuur te openen met beide pincet, en om voorzichtig krassen uit de hersenen binnen.</li>
		<li>Maak elk brein schoon door trachea of vet te verwijderen die eraan vastzit(figuur 2D, top). Zodra de hersenen is gereinigd, zet het in een nieuwe microcentrifuge buis met 1 mL wasbuffer op ijs. OPMERKING: Beschadigde of verloren optische kwabben hebben geen invloed op de reukkwab in het midden van de hersenen(figuur 2D, boven).</li>
		<li>Vervang de wasbuffer door 1 mL bevestigingsoplossing zodra alle hersenen zijn verzameld en opgehoopt aan de onderkant van de microcentrifugebuis. Fix hersenen voor 10 min met rocken op RT, gevolgd door vijf 2 min wasbeurten in 1 mL wasbuffer met rocken bij RT.</li>
		<li>Breng primaire antilichamen (1:500) in wasbuffer 's nachts met schommelen op 4 °C, gevolgd door 10 wasbeurten meer dan 2 uur met behulp van 1 mL wasbuffer met schommelen op RT.</li>
		<li>Breng secundaire antilichamen (1:500) in wasbuffer 2 uur met schommelen bij RT en wikkel microcentrifuge buis in aluminiumfolie om licht te blokkeren. Houd de microcentrifugebuis bedekt met aluminiumfolie voor de rest van de procedure. Breng tien wasbeurten met 1 mL wasbuffer meer dan 2 uur met rocken op RT.</li>
		<li>Verwijder de supernatant en gebruik een enkele druppel antifade reagens om de hersenen in de microcentrifuge buis te bedekken. Incubeer hersenen gedurende ten minste 30 min bij 4 °C voordat u ze voorbereidt op montage en beeldvorming.</li>
		<li>Bereid een cover slide, plak lab tape op, en knip een "T"-achtige vorm van de tape(Figuur 2D, bodem). De resulterende ruimte dient als gebied waar de hersenen-bevattende antifade reagens28 zal worden gepipettttttin, bij voorkeur in beide kamers. OPMERKING: Gebruik een pipettip van 20-200 μL waarbij 3 mm van de punt is afgesneden om de opening van de pipet te verbreden. Dit zal het mogelijk maken om de hersenen-bevattende antifade reagens pipet. Bedek de hersenen voorzichtig met een dekselplaat.</li>
		<li>Gebruik klei om twee kleine even broodjes te bereiden. Zorg ervoor dat de kleirollen niet hoger zijn dan de hoogte van een glazen schuif. Plak de kleirollen op de glazen schuif(figuur 2D, onder). Plaats de hersenen-bevattende cover slide sandwich op de klei rollen. OPMERKING: GFP-gelabelde axonen en hun synapsen bevinden zich in de voorkant van de hersenen. Het is daarom gemakkelijker om ze van voren te beeld te maken. Echter, hersenen zullen ofwel naar boven, of gezicht naar beneden op de cover slide sandwich. Kleibroodjes dienen als sandwichhouders, en tijdens de beeldvorming kan de sandwich ondersteboven worden omgedraaid. Dit zal het mogelijk maken om beelden te verwerven van de voorkant van elk brein.</li>
		<li>Verwerf een reeks optische secties langs de z-as met 1,0 μm stap-grootte met behulp van een confocale microscoop, en comprimeren z-stacks in een enkel bestand voor latere analyses, om het aantal axonalprojecties intact te beoordelen.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig02.jpg"> Figuur 2: Observatie van axon en synapsmorfologie tijdens axondood in de hersenen. (A) Zijaanzicht van een schematische vliegkop met gfp-gelabelde cellichamen, axonen en synapsen. (B) Hoge vergroting vooraanzicht van GPF-gelabelde reukreceptorneuronen en hun axonen en synapsen. Cellichamen zijn ondergebracht in het3e antennesegment, en hun axonen projecteren in het CNS. Axonen vormen synapsen in een glomerulus in de linker reukkwab, steken de middellijn over en vormen synapsen in de glomerulus op de contralaterale reukkwab. (C) Voorbeelden van vliegkoppen met eenzijdige ablatie van antennes. Top: Ongewonde controle. Midden: Ablatie van het3e antennesegment. Bodem: Ablatie van het2e (en dus ook3e)antennesegment. (D) Hersenvoorbereiding. Top: Schematische ontleed vlieghersenen met aangegeven geurkwabben en axonale projecties op het gezichtsveld. Onderaan: Schematische opstelling voor hersenenimaging. Twee kleirollen (groen) zijn gemonteerd op een glazen glijbaan (lichtblauw), ze dragen een cover slide sandwich, die vlieghersenen (grijs) bevat. Hersenen zijn gemonteerd in antifade reagens (paars), omgeven door een lab tape (oranje), en bedekt met twee cover dia's (zwart). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
3. Grooming Geïnduceerd door Optogenetics als een uitlezing voor Axon en Synapse Functie
<ol><li>Optogenetische opstelling<ol>
<li>Voer het optogenetische experiment uit in een donkere kamer. Zorg ervoor dat de setup bestaat uit een 850 nm infrarood (IR) LED-spot om vliegen in het donker te verlichten (Figuur 3A),een knipperende 660 nm rode LED-spot om neuronen te activeren die CsChrimson uitdrukken, en een monochrome camera met een 700 nm longpass filter, die de opname van rood lichtflitsen voorkomt.</li>
		<li>Gebruik een 3D-printer om een kleine cirkelvormige gedragskamer met een diameter van 1 cm te genereren, bedek deze met een afdekplaat en plaats een 860 nm zender gekoppeld aan de rode LED-spot naast de kamer(figuur 3B). OPMERKING: De zender geeft aan wanneer de rode LED-spot is ingeschakeld, waardoor de neuronen worden geactiveerd.</li>
		<li>Monteer de LED-spots en de camera op de top van de kamer(Figuur 3A, C).</li>
		<li>Activeer neuronen met 10 Hz flitsen gedurende 10 s. De duur van de activering kan worden aangepast aan het experimentele ontwerp.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het voorbereiden van vliegen voor optogenetica<ol>
<li>Smelt vliegen voedsel in een magnetron. Nadat het voedsel is afgekoeld, voeg u vóór de stolling 1:100 van 20 mM alle trans-retinale in ethanol (EtOH) toe aan een eindconcentratie van 200 μM. Meng goed en giet het voedsel onmiddellijk in lege flacons. OPMERKING: Vermijd het toevoegen van alle trans-retinale aan warm voedsel, dit kan resulteren in minder efficiënte optogenetica.</li>
		<li>Bedek flesjes met gestolde levensmiddelen met pluggen of katoenen balletjes. Wikkel flacons met aluminiumfolie. Bewaar vervolgens de flesjes met voedsel in een donkere, koude kamer.</li>
		<li>Gebruik 5 maagdelijke vrouwtjes en 5 mannetjes(figuur 6A, generatie P0) van het juiste genotype om kruisen uit te voeren op RT. Pass P0 in nieuwe flacons om de 3-4 dagen. Verzamel vers eclosed volwassen nakomelingen (generatie F1)op een dagelijkse basis en laat ze verouderen voor 7 tot 14 dagen in met aluminium bedekte flesjes met 200 μM alle trans-retinale in vliegvoedsel.</li>
		<li>Verzamel vliegen door ze te tikken van voedselbevattende flesjes in een lege flacon zonder voedsel. Koel de flacon af in ijshoudend water voor ongeveer 30 s. Vliegen zullen in slaap vallen. Zet individuele vliegen snel in kleine kamers bedekt met een cover slide(figuur 3B). LET OP: Zodra vliegen opwarmen, worden ze wakker. Het is van cruciaal belang om individuele vliegen snel in één kamer elk te verspreiden. Vermijd CO2 pads om vliegen te verdoven, dit zal hun gedrag beïnvloeden.</li>
		<li>Voer optogenetica uit om antenneverzorging uit te lokken. Hier bestaat het protocol uit de volgende intervallen: 30 s waarbij het rode licht afwezig is, gevolgd door 10 s van blootstelling aan rood licht op 10 Hz. Herhaal deze procedure drie keer in totaal, gevolgd door een extra interval van 30 s waarbij het rode licht afwezig is12,29,30. OPMERKING: Dit protocol kan worden aangepast aan de experimentele voorkeur.</li>
		<li>Verzamel individuele vliegen uit elke kamer op CO2 pads. Onderwerpen ze aan antenneletsel. Ablate zowel de linker en de rechter 2e antennel segmenten(Figuur 2C). Dit zal verwijderen van de cellichamen van johnston's orgaan (JO) neuronen, terwijl de axonalprojecties blijven in de CNS. Herstel de vliegen in met aluminium bedekte flacons met 200 μM alle trans-retinale. OPMERKING: Voor antenneverzorging veroorzaakt door optogenetica, de sensorische neuron cel lichamen zijn gehuisvest in de2e antenne segment (Figuur 2C).</li>
		<li>Op overeenkomstige tijdpunten (bijvoorbeeld 7 dagen post antennale ablatie), vliegt het onderwerp naar een andere verzorgingstest (ga terug naar stap 3.2.4).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig03.jpg"> Figuur 3: Optogenetische opstelling om grooming te induceren als uitlezing voor axon- en synapsfunctie. (A) Illustratie van geassembleerde componenten die nodig zijn voor de optogenetica. Infrarood (IR) LED-spot, camera en rode LED-spot (respectievelijk van links naar rechts). De onderdelen, waaronder een gedetailleerde beschrijving, worden vermeld in de Materiaaltabel. (B) Top view illustratie van een gedragskamer met inbegrip van een IR-zender om rode LED-spot activering aan te geven. (C) Illustratie van een enkele mount setup. Voor de twee LED-spots en de camera zijn in totaal drie mount-opstellingen nodig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<ol>
	<li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Nigrostriatal+Dopaminergic+Neurons+Form+Widely+Spread+and+Highly+Dense+Axonal+Arborizations+in+the+Neostriatum.">Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Wedel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monument+of+Inefficiency:+The+Presumed+Course+of+the+Recurrent+Laryngeal+Nerve+in+Sauropod+Dinosaurs.">A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs.</a> Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).</li><li>Mariano, V., Dom&#237;nguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+mechanisms+of+circuit-integrated+axons.">Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).</li><li>Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration:+an+emerging+axon+death+pathway+linking+injury+and+disease.">Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease.</a> Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).</li><li>Neukomm, L. J., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+cellular+and+molecular+modes+of+axon+degeneration.">Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration.</a> Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).</li><li>Gustavsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">Cost of disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).</li><li>Rosell, A. L., Neukomm, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+death+signalling+in+Wallerian+degeneration+among+species+and+in+disease.">Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease.</a> Open Biology. 9 (8), 190118 (2019).</li><li>Mack, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+injured+axons+and+synapses+is+delayed+by+a+Ube4b/Nmnat+chimeric+gene.">Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene.</a> Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).</li><li>Osterloh, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dSarm/Sarm1+is+required+for+activation+of+an+injury-induced+axon+death+pathway.">dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway.</a> Science. 337 (6093), 481-484 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biology. 10 (12), 1001440 (2012).</li><li>Neukomm, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+Death+Pathways+Converge+on+Axundead+to+Promote+Functional+and+Structural+Axon+Disassembly.">Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly.</a> Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).</li><li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons.">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).</li><li>Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+forward+genetic+approach+for+identifying+axon+death+genes+in+Drosophila.">Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).</li><li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling.">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nature Communications. 8, 14355 (2017).</li><li>Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Wallerian+Degeneration+does+not+Hinder+Regeneration+in+Peripheral+Nerve.">Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve.</a> The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).</li><li>Adalbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+slow+Wallerian+degeneration+(Wld(S))+with+improved+preservation+of+neuromuscular+synapses.">A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137 (23), 3985-3994 (2010).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Wld(S)+or+Nmnat2+in+Mauthner+Cells+by+Single-Cell+Electroporation+Delays+Axon+Degeneration+in+Live+Zebrafish.">Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).</li><li>Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Nmnat2+is+an+essential+survival+factor+for+maintenance+of+healthy+axons.">Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons.</a> PLoS Biology. 8 (1), 1000300 (2010).</li><li>Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phr1+ubiquitin+ligase+promotes+injury-induced+axon+self-destruction.">The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction.</a> Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).</li><li>Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarm1-mediated+axon+degeneration+requires+both+SAM+and+TIR+interactions.">Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).</li><li>Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARM1+activation+triggers+axon+degeneration+locally+via+NAD++destruction.">SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction.</a> Science. 348 (6233), 453-457 (2015).</li><li>Bridge, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+crush+injuries--a+model+for+axonotmesis.">Nerve crush injuries--a model for axonotmesis.</a> Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).</li><li>Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+Degeneration+in+the+Optic+Nerve+Stretch-Injury+Model+of+Traumatic+Brain+Injury:+A+Stereological+Analysis.">Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).</li><li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).</li><li>. Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection Available from: <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2015)</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mowiol+mounting+medium.">Mowiol mounting medium.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> eLife. 3, 02951 (2014).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> eLife. 4, 08758 (2015).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain.">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102 (2), 147-159 (2000).</li><li>Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+activation+of+parallel+sensory+pathways+promotes+a+grooming+sequence+in+Drosophila.">Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Farley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Pebbled/RREB1+regulates+injury-induced+axon+degeneration.">Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+depletion+of+ESCRT+protein+Vps4+underlies+injury-induced+autophagic+impediment+and+Wallerian+degeneration.">Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration.</a> Science Advances. 5 (2), 4971 (2019).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila.">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> bioRxiv. 102, 636076 (2019).</li><li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons.">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).</li><li>Vagnoni, A., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cAMP/PKA/Kinesin-1+Axis+Promotes+the+Axonal+Transport+of+Mitochondria+in+Aging+Drosophila+Neurons.">A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons.</a> Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+mitophagy+independence+in+the+maintenance+of+axonal+mitochondria+during+normal+aging.">In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging.</a> Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+S-Transferase+Regulates+Mitochondrial+Populations+in+Axons+through+Increased+Glutathione+Oxidation.">Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation.</a> Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).</li></ol>

De auteurs verklaren dat ze niets te onthullen hebben.

De hier beschreven protocollen maken de robuuste en reproduceerbare observatie van morfologie mogelijk, evenals de functie van axonen en hun synapsen gescheiden van hun cellichamen in Drosophila. De vleugeltest vergemakkelijkt de observatie van axondood zij aan zij van niet gewonde controleaxonen in PNS14, terwijl de antennetest de observatie van gehele zenuwbundels van GFP-geëtiketteerde axonen en hun synapsen vergemakkelijkt, om zowel morfologie als functie in de hersenen (CNS)12te beoordelen . Er zijn kritische stappen en bepaalde voordelen voor elke benadering van studie morfologie die in aanmerking moeten worden genomen bij het ontwerpen van experimenten.
Om axonmorfologie in de PNS in de vleugel te observeren, kunnen experimenten gemakkelijk worden uitgevoerd, vanwege de transparantie van de vleugel: het maakt het mogelijk om dissectie en immunohistochemie te omzeilen. Echter, als gevolg van het gebrek aan fixatie, de vleugels moeten onmiddellijk na montage14worden afgebeeld. Momenteel worden twee verschillende Gal4-stuurprogramma's vaak gebruikt, ok371Gal4 of dpr1Gal4, en beide referenties bieden verschillende benaderingen om degeneratie14,26te kwantificeren . Schaarse etikettering van een paar neuronen wordt aanbevolen, met behulp van "Mozaïek Analyse met een repressible Cell Marker (MARCM)"14,31, als de resolutie van axonalmorfologie is ongekend. In tegenstelling, de observatie van synapsen is niet mogelijk in vleugels, ze bevinden zich in de ventrale zenuwkoord in de thorax van de vliegen. Bovendien kunnen extra axonale markers niet worden gevisualiseerd door immunohistochemie: de wasachtige nagelriem maakt het onmogelijk voor de verspreiding van fixatiefen en antilichamen in het onderliggende weefsel.
Om axon en synapsmorfologie in de CNS te observeren, moeten hersendissecties worden uitgevoerd. Ze bieden het voordeel van het visualiseren van extra axonale en synaptische markers door het gebruik van immunohistochemie, en synapsen kunnen worden waargenomen naast axonen in hetzelfde gezichtsveld10,13. Een grote collectie van gekarakteriseerde olfactorische receptor neuron (ORN) Gal4 drivers is direct beschikbaar32, en vaak, OR22aGal4 is de driver van keuze. Voor antenneablatie zijn cellichamen van OR22a-neuronen ondergebracht in het3e segment (Figuur 2B). Een op fluorescentieintensiteit gebaseerde kwantificering wordt gebruikt om de degeneratie van axonen of synapsen te kwantificeren13. Omgekeerd, experimenten zijn tijdrovend als gevolg van hersendissectie en antilichaam vlekken.
Om axonale en synaptische functie na axotomie te visualiseren, wordt optogenetica gebruikt om antenneverzorging te activeren: het dient als uitlezing voor functioneel behoud van afgehakte axonen en hun synapsen12. Het verzorgingscircuit en de bijbehorende sensorische, inter- en motorneuron Gal4 drivers zijn grondig beschreven29,30. GMR60E02Gal4 labelt een subset van Johnston's orgaan (JO) sensorische neuronen, die nodig zijn en voldoende zijn voor het verzorgen van29,30. Voor antenneablatie zijn cellichamen van JO-neuronen ondergebracht in het2e antennesegment(figuur 2B). Een optogenetische setup kan gemakkelijk worden gebouwd vanaf nul, of een bestaande setup aangepast. Belangrijk is dat experimenten moeten worden uitgevoerd in een donkere kamer, en vliegen dus gevisualiseerd met een infrarood (IR) LED-spot. Bij het gebruik van CsChrimson als een kanaal, is het cruciaal om het voedsel te voorzien van alle trans-retinale en een rode LED-spot om JO neuronen te activeren29. Als alternatief, blauw lichtgevoelige kanalen en een blauwe LED-spot, of de TrpA1 kanaal en temperatuur kan worden gebruikt voor neuronale activering29,33. De kwantificering van grooming gedrag is al beschreven12,29.
Wanneer deze testen worden gebruikt om specifiek axondood te bestuderen, is het belangrijk op te merken dat het fenotype van morfologische of functionele conservering na verloop van tijd robuust moet zijn. Er zijn gevallen waarin axondood leidt tot een consistent maar minder uitgesproken fenotype in morfologische conservering34,35, en of een dergelijk fenotype zich vertaalt in functioneel behoud moet nog worden bepaald.
Axon dood fenotypes zijn ook waargenomen in neuronen tijdens de ontwikkeling van Drosophila larven, waar zenuwen werden verpletterd in plaats van gewond11,23. Hier richtten we ons specifiek op volwassen Drosophila neuronen die de ontwikkeling voltooiden. In deze context kan het gebruik van RNA interferentie36, of weefselspecifieke CRISPR/Cas937 gemakkelijk worden geïmplementeerd. Belangrijk is dat de bovenstaande technieken kunnen worden gebruikt in een axon dood onafhankelijke context: ze vergemakkelijken de karakterisering van neuronale onderhoudsfactoren38, axonal transport39, leeftijd-afhankelijke axonal mitochondriën verandert40, en morfologie van axonal mitochondria41.

De morfologische integriteit van neuronen is essentieel voor aanhoudende zenuwstelsel functie gedurende het hele leven. De overgrote meerderheid van het neuronale volume wordt genomen door axonen1,2; zo is levenslang onderhoud van bijzonder lange axonen een belangrijke biologische en bioenergetische uitdaging voor het zenuwstelsel. Meerdere axonal-intrinsieke en glia-extrinsieke ondersteunende mechanismen zijn geïdentificeerd, zorgen voor levenslange axonale overleving. Hun bijzondere waardevermindering resulteert in axondegeneratie3, wat een gemeenschappelijk kenmerk is van zenuwstelsels die worden uitgedaagd bij ziekten, en door mechanische of chemische krachten4,5. Echter, de onderliggende moleculaire mechanismen van axon degeneratie blijven slecht begrepen in elke context, waardoor de ontwikkeling van effectieve behandelingen om axon verlies uitdagend te blokkeren. De ontwikkeling van effectieve therapieën tegen deze neurologische aandoeningen is belangrijk, omdat ze een enorme last in onze samenleving creëren6.
Door letsel veroorzaakte axondegeneratie dient als een eenvoudig model om te bestuderen hoe doorgesneden axonen hun eigen demontage uitvoeren. Ontdekt door en vernoemd naar Augustus Waller in 1850, Wallerian degeneratie (WD) is een overkoepelende term die bestaat uit twee verschillende, moleculair scheidbare processen7. Ten eerste, na axonalletsel, axonen gescheiden van hun cel lichamen actief uitvoeren van hun eigen zelfvernietiging (axon dood) door middel van een evolutionair bewaard gebleven axon dood signalering cascade binnen een dag na letsel8. Ten tweede, omringende glia en gespecialiseerde fagocyten betrekken en duidelijk de daaruit voortvloeiende axonalpuin binnen drie tot vijf dagen. De demping van axon doodsignalering resulteert in afgehakte axonen die weken9,10,11,12, terwijl de verzwakking van glia-engulfment culmineert in axonal puin dat weken in vivo13,14,15voortduurt .
Onderzoek bij vliegen, muizen, ratten en zebravis bleek verschillende evolutionair geconserveerde en essentiële bemiddelaars van axon dood signalering8. Axon dood mutanten bevatten afgehakte axonen en synapsen die niet axon dood ondergaan; ze blijven morfologisch en functioneel bewaard gedurende weken, bij afwezigheid van cellichaam steun9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. De ontdekking en karakterisering van deze bemiddelaars leidde tot de definitie van een moleculair pad dat axondood uitvoerde. Belangrijk is dat axondeathsignalering niet alleen wordt geactiveerd wanneer de axon24,25wordt gesneden, geplet of uitgerekt ; het lijkt ook een bijdrage te leveren aan verschillende diermodellen van neurologische aandoeningen (bijvoorbeeld wanneer axonen op een letselonafhankelijke manier ontaarden4, maar met een reeks gunstige resultaten4,8). Daarom, begrijpen hoe axon dood axon degeneratie uitvoert na letsel zou kunnen bieden inzichten dan een eenvoudige schade model; het zou ook doelstellingen voor therapeutische interventie kunnen verstrekken.
De fruitvlieg Drosophila melanogaster (Drosophila) heeft bewezen een waardevol systeem voor axon dood signalering. Onderzoek in de vlieg bleek vier essentiële evolutionair geconserveerde axon dood genen: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 en axundead (axed)12. De wijziging van deze bemiddelaars - verlies-van-functie mutaties van hiw, dsarm en axed, en over-expressie van dnmnat - krachtig blokkeert axon dood voor de levensduur van de vlieg. Terwijl afgehakte wilde type axonen ondergaan axon dood binnen 1 dag, afgesneden axonen en hun synapsen ontbreekt hiw, dsarm of axed blijven niet alleen morfologisch, maar ook functioneel bewaard voor weken. Of functionele conservering ook kan worden bereikt door hoge niveaus van dnmnat moet nog worden bepaald.
Hier presenteren we drie eenvoudige en recent ontwikkelde protocollen om axondood te bestuderen (bijvoorbeeld de morfologie en functie van afgehakte axonen en hun synapsen in de loop van de tijd) bij afwezigheid van cellichaamsondersteuning. We laten zien hoe verzwakte axondood resulteert in afgehakte axonen die morfologisch bewaard zijn gebleven met een hiw-verlies-van-functie mutatie(hiw∙N) en hoe verzwakte axondood resulteert in afgehakte axonen en synapsen die ten minste 7 dagen functioneel bewaard blijven met overexpressie van dnmnat (dnmnatOE). hiw Deze protocollen maken het mogelijk om individuele axonale en synaptische morfologie in het centrale of perifere zenuwstelsel (respectievelijk CNS en PNS)13,14, te observeren, terwijl het functioneel behoud van afgehakte axonen en hun synapsen in het CNS kan worden gevisualiseerd door het gebruik van een eenvoudige optogenetische opstelling in combinatie met grooming als gedragsuitlezing12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tweezers (high precision, ultra fine)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78520-5</td>
			<td>Antennal ablation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72933-04</td>
			<td>Wing injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086.0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>AA00008032E00MNT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCC1240M</td>
			<td>Camera setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Retaining Ring for &#216;1&#34; Lens Tubes and Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm 1/1.2&#34; C mount Lens</td>
			<td>Tamron</td>
			<td>M112FM25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 1&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M850L3</td>
			<td>IR LED spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 2&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Retaining Ring for &#216;1&#34; Lens Tubes and Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M660L4</td>
			<td>Red LED spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 2&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KPS101</td>
			<td>LED control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1530/M</td>
			<td>Mount base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>UPH75/M</td>
			<td>Mount, 3x (IR LED, red LED, cam)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1.20&#34; Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RC/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR40/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Posts, 5 mm Hex</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH6MS16</td>
			<td>screws for mount onto base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>782604-01</td>
			<td>Red LED spotlight controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer</td>
			<td>TT Electronics/BI</td>
			<td>P230-2EC22BR20K</td>
			<td>fintuner for indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR (860nm) emitter, 100 mA radial</td>
			<td>Osram</td>
			<td>475-1365-ND</td>
			<td>Red light indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cable</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP antibodies</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-901-215</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Dylight anti-Chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM7a, B</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_785</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRT19A[hs-neo]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiw[&#916;N]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_51637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hs-FLP[12]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_1929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tub-Gal80[LL1]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_55135</td>
			<td>2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-Gal4[12B]</td>
			<td>Kyoto</td>
			<td>RRID:Kyoto_108492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-HA::dnmnat</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_39702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-mCD8::GFP[LL5]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ase-FLP[2d]</td>
			<td>Freeman laboratory</td>
			<td>Neukomm et al., 2014 (PNAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyO</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_2555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpr1-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_25083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR22a-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_9952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ey-FLP[6]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5577</td>
			<td>3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMR60E02-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_39250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM3,Sb,e</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_3644</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of axons and their synapses during axon death in drosophila melanogaster

Axon degeneratie is een gedeelde functie in neurodegeneratieve ziekte en wanneer zenuwstelsels worden uitgedaagd door mechanische of chemische krachten. Ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan axondegeneratie blijft echter beperkt. Door letsel veroorzaakte axondegeneratie dient als een eenvoudig model om te bestuderen hoe doorgesneden axonen hun eigen demontage uitvoeren (axondood). In de afgelopen jaren, een evolutionair bewaard gebleven axon dood signalering cascade is geïdentificeerd van vliegen tot zoogdieren, die nodig is voor de gescheiden axon te ontaarden na letsel. Omgekeerd, verzwakte axon dood signalering resulteert in morfologische en functionele behoud van afgehakte axonen en hun synapsen. Hier presenteren we drie eenvoudige en recent ontwikkelde protocollen die het mogelijk maken voor de observatie van axonale morfologie, of axonale en synaptische functie van afgehakte axonen die zijn afgesneden van het neuronale cellichaam, in de fruitvlieg Drosophila. Morfologie kan worden waargenomen in de vleugel, waar een gedeeltelijke verwonding resulteert in axon dood naast elkaar van niet-gewonde controle axonen binnen dezelfde zenuwbundel. Als alternatief kan axonale morfologie ook worden waargenomen in de hersenen, waar de hele zenuwbundel axondood ondergaat die wordt veroorzaakt door de ablatie van antennes. Functioneel behoud van afgehakte axonen en hun synapsen kan worden beoordeeld door een eenvoudige optogenetische benadering in combinatie met een post-synaptisch grooming gedrag. We presenteren voorbeelden met behulp van een highwire verlies-van-functie mutatie en door over-uitdrukken dnmnat, beide in staat om axon dood vertragen voor weken tot maanden. Belangrijk is dat deze protocollen kunnen worden gebruikt dan letsel; ze vergemakkelijken de karakterisering van neuronale onderhoudsfactoren, axonal transport en axonalmitochondriën.

Hierboven beschreven we drie methoden om de morfologie en functie van afgehakte axonen en hun synapsen te bestuderen. De eerste methode maakt het mogelijk om individuele axonen in de PNS met hoge resolutie te observeren. Het vereist klonen gegenereerd door de MARCM techniek14,31. Hier voerden we kruisen uit om wild type en highwire mutant MARCM klonen te genereren(figuur 4A). Een eenvoudige snede in het midden van de vleugel veroorzaakt axonletsel van neuronen gehuisvest distale (bijvoorbeeld aan de buitenkant van de vleugel), terwijl proximale neuronen (bijvoorbeeld tussen de cut site en de thorax) blijven ongedeerd. Deze aanpak maakt het mogelijk om axon dood naast elkaar van niet-gewonde controle axonen in dezelfde zenuwbundel(figuur 1A, figuur 4B) te observeren. Hier gebruikten we een genetische achtergrond wat resulteerde in lage aantallen GFP-gelabelde klonen (bijvoorbeeld twee in elk experiment14). We presenteren voorbeelden van 1 en 7 dagen na letsel van wilde type axonen, om voorbeelden te geven van controle axonen, axonen ondergaan axon dood, en axonal fragmenten worden gewist door de omliggende glia, respectievelijk. Daarnaast herhaalden we axonal letsel bij highwire mutanten waar we de uitkomst 7 dagen na letsel analyseerden.
Niet-gewonde controlevleugels herbergen twee wild-type klonen, dus twee GFP-gelabelde wild-type axonen (Figuur 4B, wild type, ongewonde controle). Een dag na het snijden van het midden van de vleugel door het gebruik van micro-schaar, axon dood wordt geïnduceerd in GFP-gelabelde axonen waar cellichamen zijn distale aan de cut site, terwijl axonen van proximally gehuisvest cellichamen dienen als een interne controle binnen dezelfde zenuw bundel(Figuur 4B, wild type, 1 dag na letsel). Let op de axonal puin spoor in het bovenste deel aangegeven door de pijl. 7 dagen na axonalletsel, GFP-gelabeldaxonal puin wordt gewist door de omliggende glia, terwijl GFP gelabeld niet-gewonde controle axonen blijven in de zenuwbundel(Figuur 4B, wild type, 7 dagen na letsel, pijl). Highwire highwire mutant axonen die 7 dagen zijn doorgesneden, blijven daarentegen morfologisch bewaard, in overeenstemming met eerdere bevindingen11,14 (Figuur 4B, highwire, 7 dagen na letsel, pijl). Deze resultaten tonen de krachtige visuele resolutie van de Drosophila vleugel. Axon dood kan worden waargenomen side-by-side van niet-gewonde controles in dezelfde zenuwbundel. Terwijl wilde axonen ondergaan axon dood binnen 1 dag na letsel en de daaruit voortvloeiende puin wordt gewist binnen 7 dagen, axon dood deficiënte highwire mutanten blijven morfologisch bewaard gedurende 7 dagen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig04.jpg"> Figuur 4: Aanpak om axondood van GFP-gelabelde sensorische neuronaxen in de vleugel te bestuderen. (A) Schematische kruisen om wild type en highwire klonen te genereren in de vleugel (P0 en F1 generatie, respectievelijk). Maagdelijke vrouwtjes zijn aan de linkerkant, mannetjes aan de rechterkant. Zie Tabel met materialen voor genotypedetails. (B) Voorbeelden van controle en gewonde GFP-gelabelde axonen. Het gezichtsveld is aangegeven in (figuur 1A). Van links naar rechts: niet-gewonde wild type controle axonen, wilde type axonen 1-daagse post letsel, wilde type axonen 7 dagen na letsel, highwire mutant axonen 7 dagen na letsel, respectievelijk. Pijlen geven afgesneden axonen aan, Schaalbalk = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De tweede methode beschrijft hoe hele axonbundels die projecteren in het CNS visualiseren waar ze synapsen vormen, die behoren tot neuronen die zowel in linker- als rechterantennes zijn gehuisvest(figuur 2A-C). Hier voerden we kruisen uit om wild type en highwire mutant MARCM klonen te genereren(figuur 5A). Niet-gewonden, GFP-gelabelde axonen en hun synapsen kunnen worden gevisualiseerd in de loop van dagen tot weken, bij afwezigheid van letsel (Figuur 5B, Wild type, ongewonde controle). Als alternatief kunnen dieren worden onderworpen aan3e antennesegment ablatie, en afgesneden GFP-gelabelde axonen en hun synapsen kunnen worden waargenomen tijdens een tijdcursus over uren tot dagen. We concentreerden ons op 7 dagen na de ablatie van de antenne, omdat op dit moment, axonen en hun synapsen hebben ondergaan axon dood, en het resulterende puin wordt gewist door de omliggende glia. Als eenzijdige ablatie van de juiste antenne wordt uitgevoerd, wordt de juiste axonbundel doorgesneden en zal het uit elkaar vallen en wordt het resulterende puin 7 dagen na letsel volledig opgeruimd(figuur 5B, wild type, eenzijdige ablatie, 7 dagen na letsel, pijlen), in overeenstemming met eerdere bevindingen13. Als alternatief kunnen zowel de rechter- als de linkerantennes worden ablated, die zowel axonbundels zullen verbreken, en 7 dagen na letsel zijn axonen en hun synapsen verdwenen(figuur 5B, wild type, bilaterale ablatie, 7 dagen na letsel, pijl). Eenzijdige ablatie van de juiste antennes in highwire mutanten leidt daarentegen tot afgehakte axonen die 7 dagen na letsel bewaard blijven, in overeenstemming met eerdere bevindingen11,14 (Figuur 5B, highwire, eenzijdige ablatie, 7 dagen na letsel, pijl). Deze resultaten tonen aan dat afgehakte wild-type axonen axon dood ondergaan en het resulterende puin wordt gewist binnen 7 dagen, terwijl axon dood deficiënte highwire mutanten niet axon dood ondergaan en blijven morfologisch bewaard gedurende 7 dagen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig05.jpg"> Figuur 5: Aanpak om axon dood van GFP-gelabelde sensorische neuron axonen in de hersenen te bestuderen. (A) Schematische kruisen om wild type en highwire klonen in de hersenen te genereren (P0 en F1 generatie, respectievelijk). Maagdelijke vrouwtjes zijn aan de linkerkant, mannetjes aan de rechterkant. Zie Tabel met materialen voor genotypedetails. (B) Voorbeelden van controle en gewonde GFP-gelabelde axonen. Van links naar rechts: niet-gewonde wild type controles, wilde type 7 dagen post eenzijdige antennel ablatie, wilde type 7 dagen post bilaterale antenneablatie, en highwire mutanten 7 dagen post eenzijdige antennel ablatie, respectievelijk. Pijlen geven afgesneden axonbundels aan, Schaalbalk = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
De derde methode maakt het mogelijk voor de observatie van functionele bewaring van afgehakte axonen en hun synapsen in de CNS. Het is gebaseerd op de manipulatie van een subset van JO neuronen gehuisvest in de2e antenne segment die voldoende zijn om antenne verzorging induceren. Expressie van een rood verschoven channelrhodopsine (CsChrimson) in JO neuronen, gecombineerd met voedingssupplementen van alle trans-retinale, is voldoende om een eenvoudige post-synaptische grooming gedrag ontlokken bij rood licht blootstelling12,30. Hier voerden we kruisen uit om wild type JO-neuronen te genereren, en JO-neuronen die dnmnat (dnmnatOE)(figuur 6A)over-uitdrukken. Wild type vliegen of vliegen met JO neuronen met verzwakte axon dood(dnmnatOE),beide haven een krachtige grooming gedrag voor letsel. Echter, 7 dagen na letsel (bijvoorbeeld bilaterale ablatie van het2e antennesegment), grooming niet wordt opgewekt door optogenetica in wilde vliegen als gevolg van letsel-geïnduceerde axon en synapsde degeneratie, terwijl dieren met verzwakte axon dood blijven verzorgen (Figuur 6B, Film 1,2). Verzwakte axondood is daarom in staat om 7 dagen lang streng afgehakte axonen en hun synapsen te behouden.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig06.jpg"> Figuur 6: Aanpak om axonale en synaptische functie te visualiseren na axotomie. (A) Schematische kruisen om wilde type en dnmnat over-uitdrukkenjo sensorische neuronen (P0 en F1 generatie, respectievelijk) te genereren. Maagdelijke vrouwtjes zijn aan de linkerkant, mannetjes aan de rechterkant. Zie Tabel met materialen voor genotypedetails. (B) Individuele ethogrammen van grooming gedrag veroorzaakt door optogenetica. Top: individuele ethogrammen van wild type vliegt voor en 7 dagen na de blessure (blauw). Bodem: individuele ethogrammen van vliegen over-uitdrukken dnmnat (dnmnatOE)in JO neuronen voor en 7 dagen na letsel (rood). Elke bak geeft ten minste 1 grooming gedrag binnen 1 s. De zwarte lijn geeft de som van alle bakken weer. (C) Kwantificering van grooming gedrag. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, p > 0,001 (eenrichtingsANOVA, meervoudige vergelijking met tukey's post hoc-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Film 1: Representatieve wilde type grooming gedrag ontlokt door optogenetica voor en 7 dagen na antennel ablatie. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_1_wild_type.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Film 2: Representatief grooming gedrag ontlokt door optogenetica in vliegen over-uitdrukken dnmnat in JO neuronen voor en 7 dagen na antennel ablatie. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_2_nmnat.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Hier bieden we protocollen om drie eenvoudige door verwondingen veroorzaakte axondegeneratie (axondood) tests in Drosophila melanogaster uit te voeren om het morfologische en functionele behoud van afgehakte axonen en hun synapsen te evalueren.

Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Het algemene doel van dit Drosophila letsel protocol is om zowel het behoud van axonale en synaptische morfologie, evenals synaptische functie van axonen en hun synapsen observeren. Deze tests kunnen ook worden gebruikt om neuronale onderhoudsfactoren te karakteriseren, axonaal transport te bestuderen of axale organellen in intacte axonen te analyseren. De gedeeltelijke vleugel letseltest zorgt voor de observatie van gewonde axonen ondergaan degeneratie naast elkaar met ongewonde controle axonen binnen dezelfde zenuwbundel in de Drosophila vleugel.Deze schadetest kan gemakkelijk vooraf worden beoefend in wilde vliegen door het toepassen van een snede ruwweg in het midden van de vleugel met micro-schaar. De interne schade maakt de beoordeling van axale morfologie en door het gebruik van optogenetica mogelijk om functionele bewaring van axon en hun synapsen te visualiseren. Antenneablatie vereist vaste handen.Het wordt ook aanbevolen om de verwijdering van de antennes in wilde vliegen vooraf te oefenen. Bij verslaving is elke beschikbare optogenetica-setup geschikt voor het activeren van de neuronen in vliegen met hoed. Anders kan een eenvoudige setup gemakkelijk worden opgebouwd vanaf nul.Om te beginnen, gebruik maken van vijf maagdelijke vrouwtjes en vijf mannetjes uit de juiste genotype om kruisen uit te voeren bij kamertemperatuur. Breng de P0-generatie om de drie tot vier dagen over in nieuwe flesjes. Verzamel vers afgeschermde volwassen nakomelingen F1 generatie dagelijks in nieuwe flesjes en leeftijd ze voor zeven tot 14 dagen.Gebruik na verdovende middelen een microschaar om de binnenvleugelader ruwweg in het midden van de vleugel te snijden. Gebruik een vleugel voor de blessure en de andere vleugel als een leeftijd geëmatched niet-gewonde controle. Breng een blessure per vleugel en zorg ervoor dat 15 vleugels gewond te krijgen.Herstel de vliegen in voedsel met flesjes. Vervolgens, met een pipet, verspreid 10 microliters van halocarbon olie 27 langs een hele glazen glijbaan. Een of zeven dagen na letsel, gebruik micro-schaar af te snijden van de gewonde en de niet-gewonde controle vleugel.Gebruik een pincet om de vleugel in het midden te grijpen, monteer maximaal vier vleugels in de halocarbon olie 27 en bedek ze met een cover slide. Afbeeldingen van GFP gelabelde neuronen in de vleugel kunnen gemakkelijk worden verkregen met een draaiende schijf. De aanschaftijd moet echter binnen acht minuten na het monteren van de vleugels worden uitgevoerd omdat de schotel niet is gefixeerd.Beeld de vleugel onmiddellijk met behulp van een draaiende schijf microscoop. Verwerf een reeks optische secties langs de Z-as met een stapgrootte van 0,33 micrometer en comprimeer Z-stacks in één bestand voor latere analyses. Kruis vijf maagdelijke vrouwtjes en vijf mannetjes uit het juiste genotype en verzamel de F1-generatie zoals voorheen.Gebruik na verdovende middelen een pincet om het rechter derde antennesegment te oblate voor eenzijdige ablatie of zowel linker- als rechter derde antennesegmenten voor bilaterale ablatie. Dit verwijdert GFP gelabelde neuronale cellichamen, terwijl hun axonale projecties blijven in de CNS. Afhankelijk van de GFP gelabelde neuronen gebruikt in de techniek, is het belangrijk om te weten of de cellichamen zijn gehuisvest in de derde of in de tweede antenne segment voor de daaropvolgende schade test.Herstel de vliegen in voedsel met flesjes. Na verdovende middelen, gebruik pincet om de nek en een andere pincet te grijpen om de thorax te repareren. Trek voorzichtig de nek en het hoofd van de thorax.Met behulp van pincet die zijn ondergedompeld in de vaststelling oplossing, breng alle hoofden in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met een milliliter van de vaststelling oplossing van 4%paraformaldehyde en 0,1 triton X100 in PBS. Bevestig de koppen gedurende 20 minuten met zachte agitatie bij kamertemperatuur. Zet vervolgens de microcentrifugebuis op ijs en de hoofden trekken naar de bodem van de microcentrifugebuis.Verwijder de supernatant met een pipet en voeg een milliliter wasbuffer toe met 0,1% triton X100 in PBS. Plaats de buis op een draaiwiel op kamertemperatuur om twee minuten te wassen. Herhaal de was vier keer extra om de restbevestigingsoplossing te verwijderen.Na de voorbereiding van de hersenen, het verkrijgen van een cover dia, stick lab tape op, en knip een T-achtige vorm van de tape. Gebruik een 20 tot 200 microliter pipetpunt waarbij drie millimeter van de punt is afgesneden om de opening van de pipet te verbreden. Pipette de hersenen met antifade reagens op de dia en bedek de hersenen met een cover slide.Gebruik klei om twee kleine zelfs rollen voor te bereiden. Zorg ervoor dat de kleirollen niet hoger zijn dan de hoogte van een glazen schuif. Plak de kleirollen op de glazen glijbaan en plaats de hersenen met deksel dia sandwich op de klei rollen.Ga verder volgens het manuscript. Om de vliegen voor te bereiden op optogenetica, eerst smelten vliegen voedsel in een magnetron. Nadat het voedsel afkoelt, voeg u vóór stolling 20 millimolar alle trans-Retinale in ethanol toe aan een uiteindelijke concentratie van 200 micromolar.Meng goed en giet het voedsel onmiddellijk in lege flesjes. Bedek de flesjes met het gestolde voedsel met pluggen of katoenen ballen. Wikkel de flesjes met aluminiumfolie.Bewaar vervolgens het voedsel met flesjes in een donkere koude kamer. Gebruik vijf maagdelijke vrouwtjes en vijf mannetjes van het juiste genotype om kruisen uit te voeren bij kamertemperatuur en verzamel F1-generatie zoals eerder in met aluminium bedekte flesjes met 200 micromolar alle trans-Retinale in vliegvoedsel. Verzamel vervolgens de vliegen door ze af te tappen uit voedsel met flesjes in een lege flacon zonder voedsel.Koel de flacon ongeveer 30 seconden af in ijs met water. Vliegen vallen in slaap. Nu, snel individuele vliegen in kleine kamers bedekt een cover dia om optogenetica uit te voeren.Voer in een donkere kamer het protocol uit dat bestaat uit 30 seconden waar het rode licht afwezig is, gevolgd door 10 seconden blootstelling aan rood licht op 10 Hertz. Herhaal deze procedure drie keer in totaal gevolgd door een extra interval van 30 seconden waarbij het rode lampje afwezig is. Verzamel individuele vliegen uit elke kamer op kooldioxide pads.Om ze te onderwerpen aan antenneletsel, ablate zowel de linker en rechter tweede antenne segmenten. Dit verwijdert de cellichamen van Johnston's orgaanneuronen, terwijl de axonale projecties in het CNS blijven. Herstel de vliegen in met aluminium bedekte flesjes met 200 millimolar allemaal trans-Retinal.Op overeenkomstige tijdstippen, bijvoorbeeld zeven dagen na de antenneablatie, onderwerp de vliegen aan een andere grooming test. In dit protocol werden drie methoden gepresenteerd om de morfologie en functie van afgehakte axonen en hun synapsen te bestuderen. De eerste methode zorgt voor hoge resolutie observatie van individuele axonen in het perifere zenuwstelsel.De schematische kruisen om wild-type en highwire klonen in de vleugel te genereren wordt hier getoond. De controle in gewonde GFP gelabelde axonen worden ook gepresenteerd met pijlen die wijzen op afgehakte axonen. De tweede benadering om axon dood van GFP gelabeld sensorische neuron axonen in de hersenen te bestuderen wordt gepresenteerd.Schematische kruisen om wild-type en highwire klonen in de hersenen te genereren wordt hier getoond. Voorbeelden van controle in gewonde GFP gelabelde axonen worden gepresenteerd met pijlen die aangeeft afgesneden axon bundels. De derde methode toont de benadering om axonale en synaptische functie na axotomie te visualiseren.De schematische kruisen om wild-type en dnmnat te genereren over-uitdrukken van Johnston's orgaan sensorische neuronen wordt hier getoond. Wild-type vliegen zijn vliegen met Johnston's orgaanneuronen met verzwakte axon dood. Beiden koesterden een krachtig grooming gedrag voor de verwonding.Echter, zeven dagen na letsel, grooming niet worden opgewekt door optogenetica in wilde vliegen, terwijl de dieren met verzwakte axon dood bleef verzorgen. Hier gebruiken we verlies van functiemutaties of onze expressie van genen om het behoud van axonale morfologie of synaptische functie waar te nemen. Andere aanpassingsmethoden kunnen worden toegepast, zoals knock down RNA interferentie of weefsel specifieke CRISPR-Cas9 bemiddelde knock-outs.Deze methoden kunnen worden gebruikt in een schade onafhankelijke context. Ze zorgen voor de observatie en karakterisering van neuronale onderhoudsfactoren tijdens veroudering, axonaal transport en axonale organellen in intacte axonen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo visualisatie van synaptische blaasjes Binnen Drosophila larven Segmentale Axonen

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologische Analyse van de Drosophila Larvale Perifere sensorische neuron dendrieten en axonen het gebruik van genetische Mozaïeken

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulatie van Escape Gedrag in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Bepaling van de Spontane bewegingsactiviteit in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Ongecompliceerd Assay voor de kwantificering van Sociale Avoidance in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Functionele en morfologische beoordeling van Diafragma Innervatie door diafragma Motor Neuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Aandoeningen van de sociale ruimte in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foerageren Path-length Protocol<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larven

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...