Name: morphological and functional evaluation of axons and their synapses during axon death in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-03-16T13:00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Vi vil gjerne takke hele Neukomm-laboratoriet for bidrag. Dette arbeidet ble støttet av en Swiss National Science Foundation (SNSF) Assistant Professor Award (stipend 176855), International Foundation for Research in Paraplegia (IRP, grant P180), SNSF Spark (stipend 190919) og ved støtte fra Universitetet i Lausanne og Institutt for grunnleggende nevrovitenskap (État de Vaud) til LJN.

1. Observasjon av axon morfologi under axon død i PNS
<ol><li>Vingeskade: delvis skade på aksonbunter<ol>
<li>Bruk 5 jomfrukvinner og 5 menn fra riktig genotype (Figur 4A, P0 generasjon) til å utføre kors ved romtemperatur (RT). Pass P0 inn i nye hetteglass hver 3-4 dager. Samle ferskt lukket voksen avkom (F1 generasjon) daglig og alder dem i 7-14 dager.</li>
		<li>Bedøve fluer på CO2 pads. Bruk mikrosaks til å kutte den spisse vingevenen omtrent midt på vingen (figur 1A). Bruk den ene vingen til skaden og den andre vingen som en alderstilpasset uskadet kontroll. Påfør en skade per vinge, og sørg for å få tilstrekkelige vinger skadet (ca. 15 vinger). MERK: Hele vingen kan skjæres gjennom, men det er tilstrekkelig å kutte bare den fremre vingevenen. Dette er den sterkeste delen av vingen.</li>
		<li>Gjenopprett fluene i matholdige hetteglass.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vingedisseksjon og visualisering av aksoner<ol>
<li>Spred 10 μL halokarbonolje 27 med en pipette langs et helt glasslysbilde (figur 1B).</li>
		<li>Klipp av de skadde, samt den uskadede kontrollvingen på ønskede tidspunkter (f.eks. 1 eller 7 dager etter skade). Bruk mikrosaks til å kutte, og pinsett for å ta tak i vingen. Monter maksimalt 4 vinger i halokarbonolje 27 (Figur 1B) og dekk dem med et deksellysbilde.</li>
		<li>Bilde vingen umiddelbart ved hjelp av et spinnende diskmikroskop. Få en rekke optiske seksjoner langs z-aksen med 0,33 μm trinnstørrelse og komprimer z-stabler i en enkelt fil for etterfølgende analyser. MERK: Ikke ta tak i den spisse vingevenen der cellekropper og aksoner er plassert. Ta tak i vingen i midten. Vevet i vinger er ikke løst; holde tiden fra montering vinger til bildebehandling disse under 8 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig01.jpg"> Figur 1: Observasjon av aksinmorfologi under aksondød i vingen. (A) Skjematisk fluevinge med to tynt GFP-merkede sensoriske nevroner, som også er separat angitt nedenfor. Skadestedet og observasjonsområdet er indikert. (B) Skjematisk oppsett for vingebildebehandling. Skadde og uskadde kontrollvinger (grå) monteres i halokarbonolje 27 (rød) på et glasslysbilde (lys blå) og dekket med et deksellysbilde (svart). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
2. Observasjon av Axon og Synapse Morfologi under Axon Death i CNS
<ol><li>Antenneablasjon: skade på hele aksonbunter<ol>
<li>Bruk 5 jomfrukvinner og 5 menn fra riktig genotype (Figur 5A, P0 generasjon) til å utføre kors på RT. Pass P0 i nye hetteglass hver 3-4 dager. Samle fersk tenlukket voksen avkom (F1 generasjon) daglig og la dem alder i 7 opptil 14 dager.</li>
		<li>Bedøve fluer på CO2 pads. Bruk pinsett til å ablate høyre 3rd antennesegment for ensidig ablasjon; eller både venstre og høyre 3rd antennesegmenter for bilateral ablasjon (figur 2A-C). Dette vil fjerne GFP-merkede nevronale cellelegemer, mens deres aksonale projeksjoner forblir i CNS. MERK: Antenneablasjon bryter hele aksonbunten. Hvis ensidig ablasjon utføres, fungerer aksonbunten på kontralateral side (den uforrerte antennen) som internkontroll. Pass på at du utfører tilstrekkelige antenneablasjoner (ca. 15 dyr).</li>
		<li>Gjenopprett fluene i matholdige hetteglass.</li>
	</ol></li>
	<li>Hjernedisseksjon og visualisering av aksoner<ol><li>Bland silikonelastomersokkelen (9 ml) og herdingsmiddel (1 ml) i et volumforhold på 10:1. Overfør hver 5 ml blanding til en 35 mm vevskulturplate, og reduser luft introdusert ved å blande med mild agitasjon i røykhetten over natten. Blandingen stivner innen 24 timer. MERK: Disseksjonsplatene må kun tilberedes én gang og kan brukes flere ganger.</li>
		<li>Bedøve fluer på CO2 pads og halshugge voksen hoder ved hjelp av to pinsett på ønskede tidspunkter (f.eks 1 eller 7 dager etter antenneablasjon). Bruk den ene pinsetten til å ta tak i nakken, og den andre pinsetten for å fikse thoraxen. Trekk nakken forsiktig av og hodet av thoraxen. MERK: La halshuggede hoder2 stå på CO 2-puten til ønsket nummer er oppnådd, men sørg for å gå videre til neste trinn innen 30 min.</li>
		<li>Overfør alle hoder til et 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml festeoppløsning som inneholder 4 % paraformaldehyd (PFA) og 0,1 % Triton X-100 i fosfatbufret saltvann (PBS) ved hjelp av pinsett som har blitt dyppet i fikseringsløsningen. MERK: Flyhoder holder seg godt på våte pinsett. Det gjør det mulig å overføre alle hoder lett inn i mikrocentrifugerøret.</li>
		<li>Fest hodene i 20 min med mild agitasjon ved RT. Sett mikrocentrifugerøret på is, hodene vil bevege seg til bunnen av mikrocentrifugerøret. Fjern supernatanten med en pipette og gjenta denne prosedyren med fem 2 min vask med 1 ml vaskebuffer som inneholder 0,1% Triton X-100 i PBS med mild agitasjon ved RT, for å fjerne gjenværende fikseringsløsning. MERK: Videoer om hvordan du dissekerer voksne Drosophila hjerner er lett tilgjengelig27.</li>
		<li>Overfør hodene med en glasspipette til en disseksjonsplate fylt med vaskebuffer. Bruk en pinsett til å gripe og trekke proboscis av hodet, mens du holder hodet med den andre pinsett. Dette vil etterlate et hull var proboscis var festet til eksoskjelettet.</li>
		<li>Bruk to pinsett til å fjerne eksoskjelettet mellom hullet og hvert sammensatte øye. Dette vil gjøre det mulig å åpne hodestrukturen med begge pinsettene, og å forsiktig skrape ut hjernen innenfor.</li>
		<li>Rengjør hver hjerne ved å fjerne luftrør eller fett fast til den (Figur 2D, topp). Når hjernen er rengjort, legg den i et nytt mikrosentrifugerør som inneholder 1 ml vaskebuffer på is. MERK: Skadede eller tapte optiske fliker vil ikke påvirke den olfaktoriske fliken i midten av hjernen (Figur 2D, topp).</li>
		<li>Erstatt vaskebufferen med 1 ml festeløsning når alle hjernene er samlet og akkumulert nederst i mikrocentrifugerøret. Fest hjernen i 10 min med gynge på RT, etterfulgt av fem 2 min vask i 1 ml vaskebuffer med gynge på RT.</li>
		<li>Påfør primære antistoffer (1:500) i vaskebuffer over natten med gynge ved 4 °C, etterfulgt av 10 vask over 2 timer ved bruk av 1 ml vaskebuffer med gynge ved RT.</li>
		<li>Påfør sekundære antistoffer (1:500) i vaskebuffer 2 h med gynge ved RT og pakk mikrocentrifugerøret i aluminiumsfolie for å blokkere lys. Hold mikrocentrifugerøret dekket med aluminiumsfolie for resten av prosedyren. Påfør ti vask med 1 ml vaskebuffer over 2 timer med gynge ved RT.</li>
		<li>Fjern supernatanten og bruk en enkelt dråpe antifadereagens for å dekke hjernen i mikrocentrifugerøret. Inkuber hjernen i minst 30 min ved 4 °C før du forbereder dem for montering og bildebehandling.</li>
		<li>Forbered et deksel lysbilde, stick lab tape på den, og kutte ut en "T"-lignende form fra båndet (Figur 2D, bunn). Den resulterende plassen fungerer som et område der28 hjerneholdig antifadereagen28 vil bli pipetted inn i, helst inn i begge kamrene. MERK: Bruk en pipettespiss på 20-200 μL der 3 mm av spissen er kuttet av for å utvide åpningen av pipetten. Dette vil gjøre det mulig å pipette hjerneholdig eagens. Dekk forsiktig hjernen med et deksellysbilde.</li>
		<li>Bruk leire til å forberede to små jevne ruller. Pass på at leirerullene ikke er høyere enn høyden på et glasslysbilde. Fest leirerullene på glasslysbildet (Figur 2D, bunn). Plasser det hjerneholdige dekselet skyve smørbrød på leireruller. MERK: GFP-merkede aksoner og deres synapser er plassert foran hjernen. Det er derfor lettere å se dem fra forsiden. Men hjernen vil enten med ansiktet opp, eller med ansiktet ned på dekselet lysbilde sandwich. Clay ruller tjene som sandwich holdere, og under bildebehandling, kan sandwich en snus opp ned. Dette vil gjøre det mulig å skaffe bilder fra forsiden fra hver hjerne.</li>
		<li>Få en rekke optiske seksjoner langs z-aksen med 1,0 μm trinnstørrelse ved hjelp av et konfokalmikroskop, og komprimer z-stabler i en enkelt fil for påfølgende analyser, for å vurdere antall aksonale projeksjoner som gjenstår intakt.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig02.jpg"> Figur 2: Observasjon av akson og synapse morfologi under axon død i hjernen. (A) Sidevisning av et skjematisk flyhode med GFP-merkede cellelegemer, aksoner og synapser. (B) Høy forstørrelse ser forstørrelse av GPF-merkede olfaktoriske reseptornevroner og deres aksoner og synapser. Cellekropper er plassert i 3rd antennesegmentet, og deres aksoner prosjektet i CNS. Axons danner synapser i en glomerulus i venstre olfactory lobe, krysser midtlinjen og danner synapser i glomerulus på den kontralaterale olfactory lobe. (C) Eksempler på flyhoder med ensidig antenneablasjon. Topp: Uskadet kontroll. Midten: Ablation av 3rd antennesegmentet. Bunn: Ablation av 2nd (og dermed også 3rd) antennesegmentet. (D) Hjernen forberedelse. Topp: Skjematisk dissekert fluehjerne med indikerte olfaktoriske fliker og aksonale projeksjoner innen synsfeltet. Bunn: Skjematisk oppsett for hjerneavbildning. To leireruller (grønn) er montert på et glasslysbilde (lyseblå), de bærer en cover slide sandwich, som inneholder fluehjerner (grå). Hjernen er montert i antifade reagens(lilla), omgitt av en lab tape (oransje), og dekket av to cover lysbilder (svart). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
3. Grooming Indusert av Optogenetics som en avlesning for Axon og Synapse Funksjon
<ol><li>Optogenetisk oppsett<ol>
<li>Utfør det optogenetiske eksperimentet i et mørkt rom. Kontroller at oppsettet består av en 850 nm infrarød (IR) LED-spotlight for å belyse fluer i mørket (Figur 3A), en blinkende 660 nm rød LED-spotlight for å aktivere nevroner som uttrykker CsChrimson, og et monokromt kamera med et 700 nm longpass-filter, som forhindrer opptak av rødt lys blinker.</li>
		<li>Bruk en 3D-skriver til å generere et lite sirkulært atferdskammer med en diameter på 1 cm, dekk det med et deksellysbilde, og plasser en 860 nm emitter koblet til den røde LED-rampelyset ved siden av kammeret (figur 3B). MERK: Emitteren angir når den røde LED-rampelyset er på, og dermed aktivere nevronene.</li>
		<li>Monter LED-spotlights og kameraet på toppen av kammeret (Figur 3A, C).</li>
		<li>Aktiver nevroner med 10 Hz blinker i løpet av 10 s. Varigheten av aktiveringen kan justeres i henhold til eksperimentell design.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbereder fluer for optogenetikk<ol>
<li>Smelt fly mat i en mikrobølgeovn. Etter at maten er avkjølt, før størkning, tilsett 1:100 av 20 mM alle trans-retinal i etanol (EtOH) til en endelig konsentrasjon på 200 μM. Bland godt, og hell maten umiddelbart i tomme hetteglass. MERK: Unngå å legge til all trans-retinal til varm mat, dette kan resultere i mindre effektiv optogenetikk.</li>
		<li>Dekk hetteglass som inneholder størknet mat med plugger eller bomullsballer. Pakk hetteglass med aluminiumsfolie. Deretter oppbevarer du de matholdige hetteglassene i et mørkt, kaldt rom.</li>
		<li>Bruk 5 jomfrukvinner og 5 hanner (Figur 6A, generasjon P0) fra høyre genotype for å utføre kors ved RT. Pass P0 i nye hetteglass hver 3–4 dag. Samle fersk tenlukket voksen avkom (generasjon F1) på en daglig base og la dem alder i 7 opptil 14 dager i aluminium-dekket hetteglass som inneholder 200 μM alle trans-retinal i flymat.</li>
		<li>Samle fluer ved å tappe dem fra matholdige hetteglass i et tomt hetteglass uten mat. Avkjøl hetteglasset ned i isholdig vann i ca. 30 s. Fluer vil sovne. Sett individuelle fluer raskt inn i små kamre dekket med et deksel lysbilde (Figur 3B). MERK: Så snart fluene varmes opp, våkner de. Det er avgjørende å raskt spre individuelle fluer i enkeltkamre hver. Unngå CO2 pads for å bedøve fluer, dette vil påvirke deres oppførsel.</li>
		<li>Utfør optogenetikk for å fremkalle antennespleie. Her består protokollen av følgende intervaller: 30 s hvor det røde lyset er fraværende, etterfulgt av 10 s med rødlyseksponering ved 10 Hz. Gjenta denne prosedyren tre ganger totalt, etterfulgt av et ekstra 30 s intervall hvor det røde lyset er fraværende12,29,30. MERK: Denne protokollen kan justeres i henhold til eksperimentellpreferanse.</li>
		<li>Samle individuelle fluer fra hvert kammer på CO2 pads. Utsett dem for antenneskade. Ødere både venstre og høyre2. antennesegmenter (figur 2C). Dette vil fjerne cellekroppene til Johnstons organ (JO) nevroner, mens aksonale projeksjoner forblir i CNS. Gjenopprett fluene i aluminiumsdekkede hetteglass som inneholder 200 μM alle trans-retinal. MERK: For antennestell forårsaket av optogenetikk, er sensoriske nevroncellelegemer plassert i 2nd antennesegmentet (figur 2C).</li>
		<li>På tilsvarende tidspunkt (f.eks. 7 dager etter antenneablasjon), flyr motivet til en annen stellanalyse (gå tilbake til trinn 3.2.4).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig03.jpg"> Figur 3: Optogenetisk oppsett for å indusere pleie som avlesning for akson- og synapsefunksjon. (A) Illustrasjon av monterte komponenter som kreves for optogenetikk. Infrarød (IR) LED-spotlight, kamera og rød LED-spotlight (fra henholdsvis venstre til høyre). Komponentene, inkludert en detaljert beskrivelse, er oppført i materialtabellen. (B) Toppvisning illustrasjon av et atferdskammer inkludert en IR emitter for å indikere rød LED spotlight aktivering. (C) Illustrasjon av ett enkelt monteringsoppsett. Totalt tre monteringsoppsett kreves for henholdsvis de to LED-spotlightene og kameraet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<ol>
	<li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Nigrostriatal+Dopaminergic+Neurons+Form+Widely+Spread+and+Highly+Dense+Axonal+Arborizations+in+the+Neostriatum.">Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Wedel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monument+of+Inefficiency:+The+Presumed+Course+of+the+Recurrent+Laryngeal+Nerve+in+Sauropod+Dinosaurs.">A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs.</a> Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).</li><li>Mariano, V., Dom&#237;nguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+mechanisms+of+circuit-integrated+axons.">Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).</li><li>Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration:+an+emerging+axon+death+pathway+linking+injury+and+disease.">Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease.</a> Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).</li><li>Neukomm, L. J., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+cellular+and+molecular+modes+of+axon+degeneration.">Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration.</a> Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).</li><li>Gustavsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">Cost of disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).</li><li>Rosell, A. L., Neukomm, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+death+signalling+in+Wallerian+degeneration+among+species+and+in+disease.">Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease.</a> Open Biology. 9 (8), 190118 (2019).</li><li>Mack, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+injured+axons+and+synapses+is+delayed+by+a+Ube4b/Nmnat+chimeric+gene.">Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene.</a> Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).</li><li>Osterloh, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dSarm/Sarm1+is+required+for+activation+of+an+injury-induced+axon+death+pathway.">dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway.</a> Science. 337 (6093), 481-484 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biology. 10 (12), 1001440 (2012).</li><li>Neukomm, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+Death+Pathways+Converge+on+Axundead+to+Promote+Functional+and+Structural+Axon+Disassembly.">Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly.</a> Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).</li><li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons.">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).</li><li>Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+forward+genetic+approach+for+identifying+axon+death+genes+in+Drosophila.">Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).</li><li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling.">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nature Communications. 8, 14355 (2017).</li><li>Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Wallerian+Degeneration+does+not+Hinder+Regeneration+in+Peripheral+Nerve.">Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve.</a> The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).</li><li>Adalbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+slow+Wallerian+degeneration+(Wld(S))+with+improved+preservation+of+neuromuscular+synapses.">A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137 (23), 3985-3994 (2010).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Wld(S)+or+Nmnat2+in+Mauthner+Cells+by+Single-Cell+Electroporation+Delays+Axon+Degeneration+in+Live+Zebrafish.">Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).</li><li>Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Nmnat2+is+an+essential+survival+factor+for+maintenance+of+healthy+axons.">Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons.</a> PLoS Biology. 8 (1), 1000300 (2010).</li><li>Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phr1+ubiquitin+ligase+promotes+injury-induced+axon+self-destruction.">The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction.</a> Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).</li><li>Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarm1-mediated+axon+degeneration+requires+both+SAM+and+TIR+interactions.">Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).</li><li>Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARM1+activation+triggers+axon+degeneration+locally+via+NAD++destruction.">SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction.</a> Science. 348 (6233), 453-457 (2015).</li><li>Bridge, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+crush+injuries--a+model+for+axonotmesis.">Nerve crush injuries--a model for axonotmesis.</a> Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).</li><li>Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+Degeneration+in+the+Optic+Nerve+Stretch-Injury+Model+of+Traumatic+Brain+Injury:+A+Stereological+Analysis.">Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).</li><li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).</li><li>. Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection Available from: <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2015)</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mowiol+mounting+medium.">Mowiol mounting medium.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> eLife. 3, 02951 (2014).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> eLife. 4, 08758 (2015).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain.">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102 (2), 147-159 (2000).</li><li>Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+activation+of+parallel+sensory+pathways+promotes+a+grooming+sequence+in+Drosophila.">Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Farley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Pebbled/RREB1+regulates+injury-induced+axon+degeneration.">Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+depletion+of+ESCRT+protein+Vps4+underlies+injury-induced+autophagic+impediment+and+Wallerian+degeneration.">Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration.</a> Science Advances. 5 (2), 4971 (2019).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila.">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> bioRxiv. 102, 636076 (2019).</li><li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons.">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).</li><li>Vagnoni, A., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cAMP/PKA/Kinesin-1+Axis+Promotes+the+Axonal+Transport+of+Mitochondria+in+Aging+Drosophila+Neurons.">A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons.</a> Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+mitophagy+independence+in+the+maintenance+of+axonal+mitochondria+during+normal+aging.">In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging.</a> Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+S-Transferase+Regulates+Mitochondrial+Populations+in+Axons+through+Increased+Glutathione+Oxidation.">Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation.</a> Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.

Protokollene som er beskrevet her tillater robust og reproduserbar observasjon av morfologi samt funksjon av aksoner og deres synapser atskilt fra deres cellekropper i Drosophila. Vingeanalysen forenkler observasjonen av axondød side om side av uskadede kontrollaksoner i PNS14, mens anmantenneanalysen letter observasjonen av hele nervebunter av GFP-merkede aksoner og deres synapser, for å vurdere både morfologi og funksjon i hjernen (CNS)12. Det er kritiske skritt og visse fordeler for hver tilnærming til å studere morfologi som må tas i betraktning når du utformer eksperimenter.
For å observere aksinmorfologi i PNS i vingen, kan eksperimenter lett utføres, på grunn av gjennomsiktigheten av vingen: det gjør det mulig å omgå disseksjon og immunohistochemistry. Men på grunn av mangel på fiksering, må vingene avbildes umiddelbart etter montering14. For tiden brukes to forskjellige Gal4-drivere ofte, enten ok371Gal4 eller dpr1Gal4, og begge referansene tilbyr forskjellige tilnærminger for å kvantifisere degenerasjon14,26. Sparsom merking av noen nevroner anbefales, ved hjelp av Mosaic Analysis with a Repressible Cell (MARCM)14,31, da oppløsningen av aksonal morfologi er enestående. I motsetning er observasjon av synapser ikke mulig i vinger, de ligger i ventral nerveledningen inne i thoraxen til fluene. Videre kan ytterligere aksonale markører ikke visualiseres av immunohistochemistry: den voksaktige skjellaget gjør det umulig for diffusjon av fikseringsmidler og antistoffer inn i underliggende vev.
For å observere akson og synapse morfologi i CNS, må hjernedeksjoner utføres. De tilbyr fordelen av å visualisere flere aksonale og synaptiske markører ved bruk av immunohistochemistry, og synapser kan observeres sammen med aksoner i samme synsfelt10,13. En stor samling av karakterisert olfactory reseptor neuron (ORN) Gal4 drivere er lett tilgjengelig32, og ofte er OR22aGal4 driveren av valget. For antenneablasjon er cellelegemer av OR22a nevroner plassert i 3rd segmentet (Figur 2B). En fluorescensintensitetsbasert kvantifisering brukes til å kvantifisere degenerasjonen av enten aksoner eller synapser13. Omvendt er eksperimenter tidkrevende på grunn av hjernedisseksjon og antistofffarging.
For å visualisere aksonal og synaptisk funksjon etter axotomy, brukes optogenetikk til å utløse antennestell: det fungerer som en avlesning for funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser12. Grooming krets og tilsvarende sensoriske, inter- og motorneuron Gal4 drivere har blitt grundig beskrevet29,30. GMR60E02Gal4 merker en undergruppe av Johnstons organ (JO) sensoriske nevroner, som er nødvendige og tilstrekkelige til å pleie29,,30. For antenneablasjon er cellelegemer av JO-nevroner plassert i 2nd antennesegmentet (Figur 2B). Et optogenetisk oppsett kan lett bygges fra bunnen av, eller et eksisterende oppsett justert. Viktigere, eksperimenter må utføres i et mørkt rom, og fluer dermed visualisert med en infrarød (IR) LED spotlight. Når du bruker CsChrimson som kanal, er det avgjørende å levere maten med alle trans-retinal og en rød LED spotlight for å aktivere JO nevroner29. Alternativt kan blå lysefølsomme kanaler og en blå LED-spotlight, eller TrpA1-kanalen og temperaturen brukes til nevronal aktivering29,,33. Kvantifiseringen av pleieatferd er allerede beskrevet12,29.
Når disse analysene brukes til å spesifikt studere aksondød, er det viktig å merke seg at fenotypen av morfologisk eller funksjonell bevaring bør være robust over tid. Det er tilfeller der aksondød fører til en konsekvent, men mindre uttalt fenotype i morfologisk bevaring34,35, og om en slik fenotype oversettes til funksjonell bevaring gjenstår å bli bestemt.
Axon død fenotyper har også blitt observert i nevroner under utvikling av Drosophila larver, hvor nerver ble knust i stedet for skadet11,23. Her fokuserte vi spesielt på voksne Drosophila nevroner som fullførte utviklingen. I denne sammenheng kan bruk av RNA-interferens36, eller vevsspesifikk CRISPR/Cas937 lett implementeres. Viktigere, ovennevnte teknikker kan brukes i en akson død uavhengig kontekst: de letter karakterisering av nevronale vedlikeholdsfaktorer38, aksonal transport39, aldersavhengig aksonal mitokondrier endringer40, og morfologi av aksonal mitokondrier41.

Den morfologiske integriteten til nevroner er avgjørende for vedvarende nervesystemet funksjon gjennom hele livet. Det store flertallet av det nevronale volumet er tatt av aksoner1,2; dermed livslang vedlikehold av spesielt lange aksoner er en stor biologisk og bioenergetic utfordring for nervesystemet. Flere aksonale iboende og glial-extrinsic støtte mekanismer er identifisert, noe som sikrer livslang aksonal overlevelse. Deres svekkelse resulterer i akson degenerasjon3, som er et vanlig trekk ved nervesystemet blir utfordret i sykdom, og av mekaniske eller kjemiske krefter4,5. Imidlertid forblir de underliggende molekylære mekanismene for aksondegenerasjon dårlig forstått i enhver sammenheng, noe som gjør utviklingen av effektive behandlinger for å blokkere aksonerstap utfordrende. Utviklingen av effektive terapier mot disse nevrologiske forholdene er viktig, da de skaper en enorm byrde i vårt samfunn6.
Skadeindusert aksondegenerasjon fungerer som en enkel modell for å studere hvordan avkuttede aksoner utfører sin egen demontering. Wallerian degeneration (WD) ble oppdaget av og oppkalt etter Augustus Waller i 1850, og er et paraplybegrep som består av to forskjellige, molekylært separerbare prosesser7. Først, etter aksonal skade, aksoner atskilt fra sine cellelegemer aktivt utføre sin egen selvdestruksjon (axon død) gjennom en evolusjonært bevart akson død signalering kaskade innen en dag etter skade8. For det andre, omkringliggende glia og spesialiserte phagocytes engasjere og fjerne den resulterende aksonal rusk innen tre til fem dager. Demling av aksonen død signalering resulterer i avskårne aksoner som forblir bevart i uker9,10,11,12, mens demling av glial engulfment kulminerer i aksonal rusk som vedvarer i uker in vivo13,14,15.
Forskning på fluer, mus, rotter og sebrafisk avslørte flere evolusjonært bevarte og essensielle meklere av aksondød signalering8. Axon død mutanter inneholder avkuttede aksoner og synapser som ikke klarer å gjennomgå axon død; de forblir morfologisk og funksjonelt bevart i uker, i fravær av celle kroppen støtte9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. Oppdagelsen og karakteriseringen av disse meklerne førte til definisjonen av en molekylær vei som utfører aksondød. Viktigere, axon død signalering aktiveres ikke bare når aksonen er kuttet, knust eller strukket24,25; det synes også å være en bidragsyter i distinkte dyremodeller av nevrologiske tilstander (f.eks. hvor aksoner degenererer på en skadeuavhengig måte4, men med en rekke gunstige resultater4,8). Derfor kan det å forstå hvordan axondød utfører aksondegenerasjon etter skade, gi innsikt utover en enkel skademodell; det kan også gi mål for terapeutisk intervensjon.
Fruktfluen Drosophila melanogaster (Drosophila) har vist seg å være et uvurderlig system for axon død signalering. Forskning i fly viste fire essensielle evolusjonært bevarte akson død gener: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 og aksondøde (axed)12. dsarm Modifikasjonen av disse meklerne – funksjonstap av hiw, dsarm og axed, og over-uttrykk av dnmnat - blokkerer axon død for flyens levetid. Mens avskårne vill type aksoner gjennomgå axon død innen 1 dag, avskårne aksoner og deres synapser mangler hiw, dsarm eller axed forblir ikke bare morfologisk, men også funksjonelt bevart i flere uker. Hvorvidt funksjonell bevaring kan også oppnås gjennom høye nivåer av dnmnat gjenstår å bli bestemt.
Her vil vi presentere tre enkle og nylig utviklede protokoller for å studere axon død (f.eks morfologi og funksjon av avkuttede aksoner og deres synapser over tid) i fravær av celle kroppen støtte. Vi viser hvordan fortenuert aksondød resulterer i avskårne aksoner som er morfologisk bevart med en hiw tap av funksjon mutasjon (hiwN) og hvordan attenuated axon død resulterer i avskårne aksoner og synapser som forblir funksjonelt bevart i minst 7 dager med over-uttrykk av dnmnat (dnmnatOE). Disse protokollene tillater observasjon av individuell aksonal og synaptisk morfologi enten i det sentrale eller perifere nervesystemet (henholdsvis CNS og PNS)13,14, mens funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser i CNS kan visualiseres ved bruk av et enkelt optogenetisk oppsett kombinert med grooming som en atferdsavlesning12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tweezers (high precision, ultra fine)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78520-5</td>
			<td>Antennal ablation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72933-04</td>
			<td>Wing injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086.0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>AA00008032E00MNT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCC1240M</td>
			<td>Camera setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Retaining Ring for &#216;1&#34; Lens Tubes and Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm 1/1.2&#34; C mount Lens</td>
			<td>Tamron</td>
			<td>M112FM25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 1&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M850L3</td>
			<td>IR LED spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 2&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Retaining Ring for &#216;1&#34; Lens Tubes and Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M660L4</td>
			<td>Red LED spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 2&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KPS101</td>
			<td>LED control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1530/M</td>
			<td>Mount base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>UPH75/M</td>
			<td>Mount, 3x (IR LED, red LED, cam)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1.20&#34; Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RC/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR40/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Posts, 5 mm Hex</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH6MS16</td>
			<td>screws for mount onto base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>782604-01</td>
			<td>Red LED spotlight controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer</td>
			<td>TT Electronics/BI</td>
			<td>P230-2EC22BR20K</td>
			<td>fintuner for indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR (860nm) emitter, 100 mA radial</td>
			<td>Osram</td>
			<td>475-1365-ND</td>
			<td>Red light indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cable</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP antibodies</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-901-215</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Dylight anti-Chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM7a, B</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_785</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRT19A[hs-neo]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiw[&#916;N]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_51637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hs-FLP[12]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_1929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tub-Gal80[LL1]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_55135</td>
			<td>2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-Gal4[12B]</td>
			<td>Kyoto</td>
			<td>RRID:Kyoto_108492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-HA::dnmnat</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_39702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-mCD8::GFP[LL5]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ase-FLP[2d]</td>
			<td>Freeman laboratory</td>
			<td>Neukomm et al., 2014 (PNAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyO</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_2555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpr1-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_25083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR22a-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_9952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ey-FLP[6]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5577</td>
			<td>3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMR60E02-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_39250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM3,Sb,e</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_3644</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of axons and their synapses during axon death in drosophila melanogaster

Axon degenerasjon er en felles funksjon i nevrodegenerativ sykdom og når nervesystemet utfordres av mekaniske eller kjemiske krefter. Vår forståelse av de molekylære mekanismene som ligger til grunn for aksondegenerasjon, er imidlertid fortsatt begrenset. Skadeindusert aksondegenerasjon fungerer som en enkel modell for å studere hvordan avkuttede aksoner utfører sin egen demontering (axon død). I løpet av de siste årene har en evolusjonært bevart akson dødsignalisering kaskade blitt identifisert fra fluer til pattedyr, noe som kreves for at den separerte aksonen skal degenerere etter skade. Omvendt, detenuated axon død signalering resulterer i morfologiske og funksjonelle bevaring av avskårne aksoner og deres synapser. Her presenterer vi tre enkle og nylig utviklede protokoller som tillater observasjon av aksonal morfologi, eller aksonal og synaptisk funksjon av avkuttede aksoner som har blitt avskåret fra nevronal cellekropp, i fruktfluen Drosophila. Morfologi kan observeres i vingen, hvor en delvis skade resulterer i axon død side om side av uskadet kontroll aksoner innenfor samme nerve bunt. Alternativt kan aksonal morfologi også observeres i hjernen, hvor hele nervebunten gjennomgår aksondød utløst av antenneablasjon. Funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser kan vurderes av en enkel optogenetisk tilnærming kombinert med en post-synaptisk grooming atferd. Vi presenterer eksempler ved hjelp av en highwire tap av funksjon mutasjon og ved å overuttrykke dnmnat, begge i stand til å forsinke axon død i uker til måneder. Viktigere, disse protokollene kan brukes utover skade; De letter karakteriseringen av nevronale vedlikeholdsfaktorer, aksonal transport og aksonal mitokondrier.

Ovenfor beskrev vi tre metoder for å studere morfologien og funksjonen til avkuttede aksoner og deres synapser. Den første metoden gjør det mulig for høyoppløselig observasjon av individuelle aksoner i PNS. Det krever kloner generert av MARCM teknikk14,31. Her utførte vi kors for å generere vill type og highwire mutant MARCM kloner (Figur 4A). Et enkelt kutt i midten av vingen induserer aksonskade av nevroner som ligger distale (f.eks. på yttersiden av vingen), mens proksimale nevroner (f.eks. mellom kuttstedet og thoraxen) forblir uskadet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å observere axon død side om side av uskadet kontroll aksoner i samme nerve bunt (Figur 1A, Figur 4B). Her brukte vi en genetisk bakgrunn som resulterte i lavt antall GFP-merkede kloner (f.eks. to i hvert eksperiment14). Vi presenterer eksempler på 1 og 7 dager etter skade av villtype aksoner, for å gi eksempler på kontrollaksoner, aksoner som gjennomgår aksondød, og aksonale fragmenter blir ryddet av omkringliggende glia, henholdsvis. I tillegg gjentok vi aksonalskade hos highwire mutanter hvor vi analyserte utfallet 7 dager etter skade.
Uskadde kontrollvinger har to ville kloner, og dermed to GFP-merkede ville aksoner (Figur 4B, vill type, uskadet kontroll). En dag etter å ha kuttet midten av vingen ved bruk av mikrosaks, induseres axondød i GFP-merkede aksoner hvor cellelegemer er distale til klippestedet, mens aksoner fra proksiale husede cellelegemer tjener som en intern kontroll innenfor samme nervebunt (Figur 4B, vill type, 1 dag etter skade). Legg merke til aksonalavfallssporet i den øvre delen som er angitt av pilen. 7 dager etter aksonalskade, er GFP-merket aksonalt avfall ryddet av omkringliggende glia, mens GFP merket uskadet kontrollaksoner forblir i nervebunten (Figur 4B, vill type, 7 dager etter skade, pil). I motsetning forblir highwire mutant aksoner som har blitt kuttet i 7 dager morfologisk bevart, i samsvar med tidligere funn11,14 (Figur 4B, highwire, 7 dager etter skade, pil). Disse resultatene viser den kraftige visuelle oppløsningen til Drosophila-fløyen. Axon død kan observeres side om side av uskadede kontroller i samme nervebunt. Mens villtype aksoner gjennomgår aksondød innen 1 dag etter skade og det resulterende rusket er ryddet innen 7 dager, forblir axon død mangelfullhighwire mutanter morfologisk bevart i 7 dager.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig04.jpg"> Figur 4: Tilnærming til å studere axon død av GFP-merkede sensoriske nevronaksoner i vingen. (A) Skjematiske krysser for å generere vill type og highwire kloner i vingen (P0 og F1 generasjon, henholdsvis). Jomfru kvinner er til venstre, menn til høyre. Se Materialtabellen for informasjon om genotype. (B) Eksempler på kontroll og skadde GFP-merkede aksoner. Synsfeltet er angitt i (Figur 1A). Fra venstre til høyre: uskadet vill type kontroll aksoner, vill type aksoner 1-dagers post skade, vill type aksoner 7 dager etter skade, highwire mutant aksoner 7 dager etter skade, henholdsvis. Piler indikerer avkuttede aksoner, skalafelt = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.</a>
Den andre metoden beskriver hvordan du visualiserer hele aksonbunter som projiserer inn i CNS hvor de danner synapser, som tilhører nevroner som ligger i både venstre og høyre antenner (Figur 2A-C). Her utførte vi kors for å generere vill type og highwire mutant MARCM kloner (Figur 5A). Uskadet, GFP-merkede aksoner og deres synapser kan visualiseres i løpet av dager til uker, i fravær av skade (Figur 5B, Vill type, uskadet kontroll). Alternativt kan dyr bli utsatt for 3rd antennesegmentablasjon, og avkuttede GFP-merkede aksoner og deres synapser kan observeres i løpet av et tidskurs over timer til dager. Vi fokuserte på 7 dager etter antenneablasjon, fordi på dette tidspunktet har aksoner og deres synapser gjennomgått axon død, og resulterende rusk er ryddet av omkringliggende glia. Hvis ensidig ablasjon av høyre antenne utføres, blir høyre aksonbunt avkuttet og demonteres og det resulterende rusket er helt ryddet 7 dager etter skade (Figur 5B, vill type, ensidig ablasjon, 7 dager etter skade, piler), i samsvar med tidligere funn13. Alternativt kan både høyre og venstre antenner ablated, som vil bryte både aksonbunter, og 7 dager etter skade, aksoner og deres synapser forsvant (Figur 5B, vill type, bilateral ablasjon, 7 dager etter skade, pil). I motsetning resulterer ensidig ablasjon av høyre antenner i highwire mutanter i avkuttede aksoner som forblir bevart 7 dager etter skade, i samsvar med tidligere funn11,14 (Figur 5B, highwire, ensidig ablasjon, 7 dager etter skade, pil). Disse resultatene viser at avkuttede ville aksoner gjennomgår aksondød og det resulterende rusket er ryddet innen 7 dager, mens axon død mangelfullhighwire mutanter ikke klarer å gjennomgå akson død og forbli morfologisk bevart i 7 dager.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig05.jpg"> Figur 5: Tilnærming til å studere axon død av GFP-merkede sensoriske nevronaksoner i hjernen. (A) Skjematiske krysser for å generere vill type og highwire kloner i hjernen (P0 og F1 generasjon, henholdsvis). Jomfru kvinner er til venstre, menn til høyre. Se Materialtabellen for informasjon om genotype. (B) Eksempler på kontroll og skadde GFP-merkede aksoner. Fra venstre til høyre: uskadet vill type kontroller, vill type 7 dager post ensidig antenne ablasjon, vill type 7 dager etter bilateral antenne ablasjon, og highwire mutanter 7 dager post ensidig antenne ablation, henholdsvis. Piler indikerer avkuttede aksonbunter, skalafelt = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.</a>
Den tredje metoden gjør det mulig å observere funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser i CNS. Det er avhengig av manipulering av en undergruppe av JO nevroner plassert i 2nd antennesegmentet som er tilstrekkelig til å indusere antennespleie. Uttrykk for en rød-forskjøvet channelrhodopsin (CsChrimson) i JO nevroner, kombinert med kosttilskudd av alle trans-retinal, er tilstrekkelig til å fremkalle en enkel post-synaptisk grooming atferd på rødt lys eksponering12,30. Her utførte vi kors for å generere vill type JO nevroner, og JO nevroner over-uttrykker dnmnat (dnmnatOE) (Figur 6A). Vill type fluer eller fluer som inneholder JO nevroner med dempert axon død(dnmnatOE),begge har en potent grooming atferd før skade. Imidlertid, 7 dager etter skade (f.eks bilateral ablasjon av 2nd antennesegmentet), grooming ikke kan frembringes av optogenetics i vill type fluer på grunn av skade-indusert akson og synapse degenerasjon, mens dyr med dempert axon død fortsetter å brudgommen (Figur 6B, Movie 1,2). Fortenuated axon death er derfor i stand til å funksjonelt bevare avkuttede aksoner og deres synapser i 7 dager.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig06.jpg"> Figur 6: Tilnærming til å visualisere aksonal og synaptisk funksjon etter aksotomi. (A) Skjematiske krysser for å generere vill type og dnmnat over-uttrykkende JO sensoriske nevroner (P0 og F1 generasjon, henholdsvis). Jomfru kvinner er til venstre, menn til høyre. Se Materialtabellen for informasjon om genotype. (B) Individuelle ethograms av grooming atferd indusert av optogenetikk. Topp: individuelle ethograms av vill type flyr før og 7 dager etter skade (blå). Bunn: individuelle ethograms av fluer over-uttrykkednmnat (dnmnatOE) i JO nevroner før og 7 dager etter skade (rød). Hver hylle indikerer minst 1 pleieatferd innen 1 s. Den svarte linjen angir summen av alle hyller. (C) Kvantifisering av grooming atferd. Data vises som gjennomsnittlig ± standardavvik, p > 0,001 (enveis ANOVA, flere sammenligninger med Tukeys post hoc-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Film 1: Representativ vill type grooming atferd fremkalt av optogenetics før og 7 dager etter antenneablasjon. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_1_wild_type.mp4" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Film 2: Representativ pleieatferd fremkalt av optogenetikk i fluer over-uttrykkende dnmnat i JO nevroner før og 7 dager etter antenneablasjon. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_2_nmnat.mp4" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Her gir vi protokoller for å utføre tre enkle skadeinduserte aksondegenerasjon (axon død) analyser i Drosophila melanogaster for å evaluere morfologisk og funksjonell bevaring av avkuttede aksoner og deres synapser.

Morfologisk og funksjonell evaluering av axoner og deres synapser under Axon Death i Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Det overordnede målet med denne Drosophila skade protokollen er å observere både bevaring av aksonal og synaptisk morfologi, samt synaptisk funksjon av aksoner og deres synapser. Disse analysene kan også brukes til å karakterisere nevronale vedlikeholdsfaktorer, studere aksonal transport eller analysere aksonale organeller i intakte aksoner. Den delvise vingeskadeanalysen gjør det mulig å observasjon av skadde aksoner som gjennomgår degenerasjon side om side med uskadede kontrollaksoner i samme nervebunt i Drosophila-fløyen.Denne skadeanalysen kan lett praktiseres på forhånd i villtypefluer ved å bruke et kutt omtrent midt i vingen med mikrosaks. Den indre skaden gjør det mulig å vurdering av aksonal morfologi og ved bruk av optogenetikk for å visualisere funksjonell bevaring av akson og deres synapser. Antenneablasjon krever stødige hender.Det anbefales også å øve på fjerning antennene i villtype fluer på forhånd. I avhengighet er ethvert tilgjengelig optogenetics-oppsett egnet for å aktivere nevronene i fly med lue. Ellers kan et enkelt oppsett lett bygges fra bunnen av.Til å begynne med, bruk fem jomfrukvinner og fem menn fra riktig genotype for å utføre kors ved romtemperatur. Overfør P0-generasjonen til nye hetteglass hver tredje til fjerde dag. Samle nyeclosed voksen avkom F1 generasjon daglig i nye hetteglass og alder dem i syv til 14 dager.Etter bedøvelse, bruk mikrosaks for å kutte den indre vingevenen omtrent midt i vingen. Bruk den ene vingen for skaden og den andre vingen som en alder matchet uskadet kontroll. Påfør en skade per vinge og sørg for å få 15 vinger skadet.Gjenopprett fluene i mat som inneholder hetteglass. Deretter, med en pipette, spre 10 mikroliter halokarbonolje 27 langs et helt glasssklie. En eller syv dager etter skade, bruk mikrosaks til å kutte av de skadde samt den uskadede kontrollvingen.Bruk pinsett til å gripe vingen i midten, montere maksimalt fire vinger i halokarbonoljen 27 og dekke dem med et dekselsklie. Bilder av GFP merkede nevroner i vingen kan lett kjøpes med en spinnende disk. Imidlertid må oppkjøpstiden utføres innen mindre enn åtte minutter etter montering av vingene fordi parabolen ikke er fast.Bilde vingen umiddelbart ved hjelp av et spinnende diskmikroskop. Skaff deg en rekke optiske seksjoner langs Z-aksen med 0,33 mikrometertrinnstørrelse og komprimer Z-stabler til en enkelt fil for etterfølgende analyser. Kryss fem jomfrukvinner og fem menn fra riktig genotype og samle F1 generasjon som tidligere.Etter bedøvelse, bruk pinsett for å oblate høyre tredje antennesegment for ensidig ablasjon eller både venstre og høyre tredje antennesegmenter for bilateral ablasjon. Dette fjerner GFP merket nevronale cellelegemer mens deres aksonale projeksjoner forblir i CNS. Avhengig av GFP merket nevroner som brukes i teknikken, er det viktig å vite om cellelegemene er plassert i tredje eller i det andre antennesegmentet for den påfølgende skadeanalysen.Gjenopprett fluene i mat som inneholder hetteglass. Etter bedøvelse, bruk pinsett for å ta tak i nakken og en annen pinsett for å fikse thoraxen. Trekk forsiktig nakken og hodet av thoraxen.Ved hjelp av pinsett som har blitt dyppet i festeløsningen, overfører du alle hoder til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør som inneholder en milliliter festeløsning på 4% paraformaldehyd og 0,1 triton X100 i PBS. Fest hodene i 20 minutter med mild agitasjon ved romtemperatur. Legg deretter mikrocentrifugerøret på is og hodene beveger seg til bunnen av mikrocentrifugerøret.Fjern det overnaturlige med en pipette og legg til en milliliter vaskebuffer som inneholder 0,1 % triton X100 i PBS. Plasser røret på et dreiehjul ved romtemperatur for å vaske i to minutter. Gjenta vasken fire ekstra ganger for å fjerne restfesteløsning.Etter å ha forberedt hjernen, få et deksel lysbilde, stick lab tape på den, og kutte ut en T som form fra båndet. Bruk en pipettespiss på 20 til 200 mikroliter der tre millimeter av spissen er avskåret for å utvide åpningen av pipetten. Pipette hjernen inneholder antifade reagens på lysbildet og dekke hjernen med et deksel lysbilde.Bruk leire til å forberede to små jevne ruller. Sørg for at leirerullene ikke er høyere enn høyden på et glasssklie. Stick leire ruller på glasssklie og plassere hjernen inneholder deksel lysbilde sandwich på leire ruller.Fortsett i henhold til manuskriptet. For å forberede fluene for optogenetikk, smelt først flymat i en mikrobølgeovn. Etter at maten er avkjølt, før størkning, tilsett 20 millimolar alle trans-Retinal i etanol til en endelig konsentrasjon på 200 mikromos.Bland godt og hell maten umiddelbart i tomme hetteglass. Dekk hetteglassene som inneholder størknet mat med plugger eller bomullsboller. Pakk hetteglassene med aluminiumsfolie.Deretter oppbevarer du maten som inneholder hetteglass i et mørkt kaldt rom. Bruk fem jomfrukvinner og fem menn fra riktig genotype til å utføre kors ved romtemperatur og samle F1 generasjon som tidligere i aluminium dekket hetteglass som inneholder 200 mikromos alle trans-Retinal i flymat. Deretter samler du fluene ved å tappe dem fra mat som inneholder hetteglass i et tomt hetteglass uten mat.Avkjøl hetteglasset ned i is som inneholder vann i ca. 30 sekunder. Fluer sovner. Nå, raskt sette individuelle fluer i små kamre dekket et deksel lysbilde for å utføre optogenetikk.I et mørkt rom utfører du protokollen bestående av 30 sekunder der det røde lyset er fraværende, etterfulgt av 10 sekunder med eksponering for rødt lys ved 10 Hertz. Gjenta denne prosedyren tre ganger totalt etterfulgt av et ekstra 30 sekunders intervall der det røde lyset er fraværende. Samle individuelle fluer fra hvert kammer på karbondioksidputer.For å utsette dem for antenneskade, ablate både venstre og høyre andre antennesegmenter. Dette fjerner cellelegemene til Johnstons organnevroner mens aksonære projeksjoner forblir i CNS. Gjenopprett fluene i aluminiumsbelagte hetteglass som inneholder 200 millimolar alle trans-Retinal.På tilsvarende tidspunkter, for eksempel syv dager etter antennel ablasjon, utsette fluene til en annen grooming analyse. I denne protokollen ble tre metoder presentert for å studere morfologien og funksjonen til avskårne aksoner og deres synapser. Den første metoden gjør det mulig for høyoppløselig observasjon av individuelle aksoner i det perifere nervesystemet.De skjematiske kors for å generere vill-type og highwire kloner i vingen er vist her. Kontrollen i skadde GFP-merkede aksoner presenteres også med piler som indikerer avkuttede aksoner. Den andre tilnærmingen til å studere axon død av GFP merket sensoriske neuron aksoner i hjernen presenteres.Skjematiske kors for å generere vill-type og highwire kloner i hjernen er vist her. Eksempler på kontroll i skadde GFP-merkede aksoner presenteres med piler som indikerer avkuttede aksonbunter. Den tredje metoden demonstrerer tilnærmingen til å visualisere aksonal og synaptisk funksjon etter akotomi.De skjematiske korsene for å generere villtype og dnmnat over-uttrykke Johnstons organsensoriske nevroner er vist her. Wild-type fluer er fluer som inneholder Johnstons organnevroner med dempede axon død. Begge hadde en potent grooming oppførsel før skade.Men syv dager etter skade, grooming klarte ikke å bli fremkalt av optogenetikk i vill-type fluer, mens dyrene med dempede axon død fortsatte å stelle. Her bruker vi tap av funksjonsmutasjoner eller vårt uttrykk for gener for å observere bevaring av aksonal morfologi eller synaptisk funksjon. Andre modifiserende metoder kan brukes, for eksempel slå ned RNA-interferens eller vevsspesifikke CRISPR-Cas9 medierte utslag.Disse metodene kan brukes i en skadeuavhengig sammenheng. De tillater observasjon og karakterisering av nevronale vedlikeholdsfaktorer under aldring, aksonal transport og aksonale organeller i intakte aksoner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morfologisk analyse av Drosophila Larve perifer sensorisk Neuron dendritter og Axoner bruke Genetic Mosaikk

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulering av Escape Behavior i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Fastsettelse av Spontan Locomotor aktivitet i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Enkel analyse for Kvantifisering av Social Avhold i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Funksjonell og Morfologisk Vurdering av Membran Innervasjon av phrenic motoriske nerveceller

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Forhold som påvirker sosiale rom i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Utnytte Kombinert Metoder for å definere rollen til plasmamembranen Levering Under Axon Forgrening og neuronal morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Sti lengde Protokoll for<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larver

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...