Name: morphological and functional evaluation of axons and their synapses during axon death in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-03-16T13:00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всю лабораторию Neukomm за вклад. Эта работа была поддержана Швейцарским национальным научным фондом (SNSF) помощник профессора премии (грант 176855), Международный фонд исследований в параплегии (IRP, грант P180), SNSF Spark (грант 190919) и при поддержке Университета Лозанны и кафедры фундаментальных неврологий (Зтат де Во) в LJN.

<ol>
	<li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Nigrostriatal+Dopaminergic+Neurons+Form+Widely+Spread+and+Highly+Dense+Axonal+Arborizations+in+the+Neostriatum.">Single Nigrostriatal Dopaminergic Neurons Form Widely Spread and Highly Dense Axonal Arborizations in the Neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Wedel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monument+of+Inefficiency:+The+Presumed+Course+of+the+Recurrent+Laryngeal+Nerve+in+Sauropod+Dinosaurs.">A Monument of Inefficiency: The Presumed Course of the Recurrent Laryngeal Nerve in Sauropod Dinosaurs.</a> Acta Palaeontologica Polonica. 57 (2), 251-256 (2012).</li><li>Mariano, V., Dom&#237;nguez-Iturza, N., Neukomm, L. J., Bagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+mechanisms+of+circuit-integrated+axons.">Maintenance mechanisms of circuit-integrated axons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 53, 162-173 (2018).</li><li>Conforti, L., Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration:+an+emerging+axon+death+pathway+linking+injury+and+disease.">Wallerian degeneration: an emerging axon death pathway linking injury and disease.</a> Nature reviews Neuroscience. 15 (6), 394-409 (2014).</li><li>Neukomm, L. J., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+cellular+and+molecular+modes+of+axon+degeneration.">Diverse cellular and molecular modes of axon degeneration.</a> Trends in Cell Biology. 24 (9), 515-523 (2014).</li><li>Gustavsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+of+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">Cost of disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology: The Journal of the European College of Neuropsychopharmacology. 21 (10), 718-779 (2011).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 (1850).</li><li>Rosell, A. L., Neukomm, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+death+signalling+in+Wallerian+degeneration+among+species+and+in+disease.">Axon death signalling in Wallerian degeneration among species and in disease.</a> Open Biology. 9 (8), 190118 (2019).</li><li>Mack, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+injured+axons+and+synapses+is+delayed+by+a+Ube4b/Nmnat+chimeric+gene.">Wallerian degeneration of injured axons and synapses is delayed by a Ube4b/Nmnat chimeric gene.</a> Nature Neuroscience. 4 (12), 1199-1206 (2001).</li><li>Osterloh, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dSarm/Sarm1+is+required+for+activation+of+an+injury-induced+axon+death+pathway.">dSarm/Sarm1 is required for activation of an injury-induced axon death pathway.</a> Science. 337 (6093), 481-484 (2012).</li><li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+highwire+ubiquitin+ligase+promotes+axonal+degeneration+by+tuning+levels+of+nmnat+protein.">The highwire ubiquitin ligase promotes axonal degeneration by tuning levels of nmnat protein.</a> PLoS Biology. 10 (12), 1001440 (2012).</li><li>Neukomm, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+Death+Pathways+Converge+on+Axundead+to+Promote+Functional+and+Structural+Axon+Disassembly.">Axon Death Pathways Converge on Axundead to Promote Functional and Structural Axon Disassembly.</a> Neuron. 95 (1), 78-91 (2017).</li><li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons.">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).</li><li>Neukomm, L. J., Burdett, T. C., Gonzalez, M. A., Zuchner, S., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+forward+genetic+approach+for+identifying+axon+death+genes+in+Drosophila.">Rapid in vivo forward genetic approach for identifying axon death genes in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (27), 9965-9970 (2014).</li><li>Lu, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+degeneration+induces+glial+responses+through+Draper-TRAF4-JNK+signalling.">Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling.</a> Nature Communications. 8, 14355 (2017).</li><li>Lunn, E. R., Perry, V. H., Brown, M. C., Rosen, H., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+Wallerian+Degeneration+does+not+Hinder+Regeneration+in+Peripheral+Nerve.">Absence of Wallerian Degeneration does not Hinder Regeneration in Peripheral Nerve.</a> The European Journal of Neuroscience. 1 (1), 27-33 (1989).</li><li>Adalbert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+slow+Wallerian+degeneration+(Wld(S))+with+improved+preservation+of+neuromuscular+synapses.">A rat model of slow Wallerian degeneration (Wld(S)) with improved preservation of neuromuscular synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 21 (1), 271-277 (2005).</li><li>Martin, S. M., O'Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration+of+zebrafish+trigeminal+axons+in+the+skin+is+required+for+regeneration+and+developmental+pruning.">Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning.</a> Development. 137 (23), 3985-3994 (2010).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+Wld(S)+or+Nmnat2+in+Mauthner+Cells+by+Single-Cell+Electroporation+Delays+Axon+Degeneration+in+Live+Zebrafish.">Overexpression of Wld(S) or Nmnat2 in Mauthner Cells by Single-Cell Electroporation Delays Axon Degeneration in Live Zebrafish.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (15), 3319-3327 (2010).</li><li>Gilley, J., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+Nmnat2+is+an+essential+survival+factor+for+maintenance+of+healthy+axons.">Endogenous Nmnat2 is an essential survival factor for maintenance of healthy axons.</a> PLoS Biology. 8 (1), 1000300 (2010).</li><li>Babetto, E., Beirowski, B., Russler, E. V., Milbrandt, J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Phr1+ubiquitin+ligase+promotes+injury-induced+axon+self-destruction.">The Phr1 ubiquitin ligase promotes injury-induced axon self-destruction.</a> Cell Reports. 3 (5), 1422-1429 (2013).</li><li>Gerdts, J., Summers, D. W., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarm1-mediated+axon+degeneration+requires+both+SAM+and+TIR+interactions.">Sarm1-mediated axon degeneration requires both SAM and TIR interactions.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (33), 13569-13580 (2013).</li><li>Gerdts, J., Brace, E. J., Sasaki, Y., DiAntonio, A., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARM1+activation+triggers+axon+degeneration+locally+via+NAD++destruction.">SARM1 activation triggers axon degeneration locally via NAD+ destruction.</a> Science. 348 (6233), 453-457 (2015).</li><li>Bridge, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+crush+injuries--a+model+for+axonotmesis.">Nerve crush injuries--a model for axonotmesis.</a> Experimental Neurology. 127 (2), 284-290 (1994).</li><li>Maxwell, W. L., Bartlett, E., Morgan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+Degeneration+in+the+Optic+Nerve+Stretch-Injury+Model+of+Traumatic+Brain+Injury:+A+Stereological+Analysis.">Wallerian Degeneration in the Optic Nerve Stretch-Injury Model of Traumatic Brain Injury: A Stereological Analysis.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (11), 780-790 (2015).</li><li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity.">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Current Biology. 22 (7), 590-595 (2012).</li><li>. Janelia Farm Adult Drosophila Brain Dissection Available from: <a target="_blank" href="https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols">https://www.janelia.org/project-team/flylight/protocols</a> (2015)</li><li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mowiol+mounting+medium.">Mowiol mounting medium.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Seeds, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suppression+hierarchy+among+competing+motor+programs+drives+sequential+grooming+in+Drosophila.">A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila.</a> eLife. 3, 02951 (2014).</li><li>Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+command+circuit+for+grooming+movement+control.">A neural command circuit for grooming movement control.</a> eLife. 4, 08758 (2015).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Vosshall, L. B., Wong, A. M., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+sensory+map+in+the+fly+brain.">An olfactory sensory map in the fly brain.</a> Cell. 102 (2), 147-159 (2000).</li><li>Hampel, S., McKellar, C. E., Simpson, J. H., Seeds, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+activation+of+parallel+sensory+pathways+promotes+a+grooming+sequence+in+Drosophila.">Simultaneous activation of parallel sensory pathways promotes a grooming sequence in Drosophila.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Farley, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+Pebbled/RREB1+regulates+injury-induced+axon+degeneration.">Transcription factor Pebbled/RREB1 regulates injury-induced axon degeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 23 (6), (2018).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+depletion+of+ESCRT+protein+Vps4+underlies+injury-induced+autophagic+impediment+and+Wallerian+degeneration.">Rapid depletion of ESCRT protein Vps4 underlies injury-induced autophagic impediment and Wallerian degeneration.</a> Science Advances. 5 (2), 4971 (2019).</li><li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila.">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).</li><li>Port, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+resource+for+tissue-specific+CRISPR+mutagenesis+in+Drosophila.">A large-scale resource for tissue-specific CRISPR mutagenesis in Drosophila.</a> bioRxiv. 102, 636076 (2019).</li><li>Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+Lissencephaly-1+levels+augments+mitochondrial+transport+and+has+a+protective+effect+in+adult+Drosophila+neurons.">Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons.</a> Journal of Cell Science. 129 (1), 178-190 (2016).</li><li>Vagnoni, A., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cAMP/PKA/Kinesin-1+Axis+Promotes+the+Axonal+Transport+of+Mitochondria+in+Aging+Drosophila+Neurons.">A cAMP/PKA/Kinesin-1 Axis Promotes the Axonal Transport of Mitochondria in Aging Drosophila Neurons.</a> Current Biology. 28 (8), 1265-1272 (2018).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+mitophagy+independence+in+the+maintenance+of+axonal+mitochondria+during+normal+aging.">In vivo imaging reveals mitophagy independence in the maintenance of axonal mitochondria during normal aging.</a> Aging Cell. 16 (5), 1180-1190 (2017).</li><li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+S-Transferase+Regulates+Mitochondrial+Populations+in+Axons+through+Increased+Glutathione+Oxidation.">Glutathione S-Transferase Regulates Mitochondrial Populations in Axons through Increased Glutathione Oxidation.</a> Neuron. 103 (1), 52-65 (2019).</li></ol>

Авторы заявляют, что им нечего раскрывать.

Описанные здесь протоколы позволяют надежное и воспроизводимое наблюдение морфологии, а также функцию аксонов и их синапсов, отделенных от их клеточных тел в Дрозофиле. Обзор крыла облегчает наблюдение аксона смерти бок о бок невредимых аксонов управления в PNS14, в то время как антенный анализ облегчает наблюдение целых нервных пучков GFP помечены аксоны и их синапсы, для оценки морфологии и функции в головном мозге (CNS)12. Есть критические шаги и определенные преимущества для каждого подхода к изучению морфологии, которые должны быть приняты во внимание при разработке экспериментов.
Для наблюдения аксоновой морфологии в PNS в крыле, эксперименты могут быть легко выполнены, из-за прозрачности крыла: это позволяет обойти рассечение и иммуногистохимии. Однако, из-за отсутствия фиксации, крылья должны быть изображены сразу после монтажа14. В настоящее время часто используются два различных драйвера Gal4, либо ok371Gal4 или dprd1Gal4,и обе ссылки предлагают различные подходы к количественной оценке дегенерации14,26. Разрежение маркировки нескольких нейронов рекомендуется, с помощью "Мозаики Анализ с репрессивным маркером клеток (MARCM)"14,31, как разрешение аксональной морфологии является беспрецедентным. В отличие от этого, наблюдение синапсов не представляется возможным в крыльях, они расположены в брюшной нервной шнур внутри грудной клетки мух. Кроме того, дополнительные аксональные маркеры не могут быть визуализированы иммуногистохимией: восковая кутикула делает невозможным распространение фиксатов и антител в подлежащую ткани.
Для наблюдения аксона и синапсовой морфологии в ЦНС, вскрытие мозга должны быть выполнены. Они предлагают преимущество визуализации дополнительных аксональных и синаптических маркеров с помощью иммуногистохимии, а синапсы можно наблюдать вместе с аксонами в том же поле зрения10,13. Большая коллекция характеризуется обонятельный рецептор нейрона (ORN) Gal4 драйверов легко доступны32, и часто, OR22aGal4 является драйвером выбора. Для абляции антенны, тела клетки нейронов OR22a размещаются в3-м сегменте(рисунок 2B). Флуоресценция интенсивности на основе количественной оценки дегенерации либо аксонов или синапсов13. И наоборот, эксперименты отнимают много времени из-за вскрытия мозга и окрашивания антител.
Для визуализации аксональной и синаптической функции после акотомии, оптогенетика используется для запуска антенного ухода: она служит считыванием для функционального сохранения отрубленные аксоны и их синапсы12. Схема ухода и соответствующие сенсорные, между и motorneuron Gal4 водители были тщательно описаны29,30. GMR60E02Gal4 этикетки подмножество органов Джонастона (JO) сенсорных нейронов, которые необходимы и достаточно для ухода29,30. Для абляции антенны, тела клетки нейронов JO размещаются в2-й сегмент антенны(рисунок 2B). Оптогенетической установки можно легко построить с нуля, или существующие настройки скорректированы. Важно отметить, что эксперименты должны быть выполнены в темной комнате, и мухи таким образом визуализированы с инфракрасным (ИК) светодиодный прожектор. При использовании CsChrimson в качестве канала, очень важно поставлять пищу со всеми транс-ретиналя и красный светодиодный прожектор, чтобы активировать JO нейронов29. Кроме того, синие светочувствительные каналы и синий светодиодный прожектор, или канал TrpA1 и температура может быть использована для активации нейронов29,33. Количественная оценка поведения ухода уже описано12,29.
Когда эти анализы используются для специального изучения смерти аксона, важно отметить, что фенотип морфологического или функционального сохранения должен быть надежным с течением времени. Есть случаи, когда смерть аксона приводит к последовательной, но менее выраженный фенотип в морфологическом сохранении34,35, и является ли такой фенотип переводит в функциональное сохранение еще предстоит определить.
Фенотипы смерти Аксон также наблюдались в нейронах во время развития личинок Дрозофилы, где нервы были раздавлены, а не ранены11,23. Здесь мы специально сосредоточились на взрослых нейронах Дрозофилы, которые завершили разработку. В этом контексте, использование РНК-интерференции36, или ткани конкретных CRISPR/Cas937 может быть легко реализована. Важно отметить, что вышеуказанные методы могут быть использованы в аксон смерти независимого контекста: они облегчают характеристику нейрональных факторов обслуживания38, аксональный транспорт39, возраст-зависимых аксональных митохондрий изменения40, и морфологии аксональной митохондрии41.

Морфологическая целостность нейронов имеет важное значение для устойчивой работы нервной системы на протяжении всей жизни. Подавляющее большинство объема нейронов берется аксонами1,,2; таким образом, пожизненное содержание особо длинных аксонов является основным биологическим и биоэнергетическим вызовом для нервной системы. Были выявлены несколько аксонально-внутренних и глиально-внутренних механизмов поддержки, обеспечивающих пожизненное выживание аксональных. Их ухудшение приводит к дегенерации аксона3, которая является общей чертой нервной системы оспаривается в болезни, и механические или химические силы4,5. Тем не менее, основные молекулярные механизмы дегенерации аксона остаются плохо изучены ни в одном контексте, что делает разработку эффективных методов лечения для блокирования потери аксона сложной задачей. Развитие эффективных методов лечения от этих неврологических заболеваний имеет важное значение, так как они создают огромное бремя в нашем обществе6.
Травма индуцированной аксон дегенерации служит простой моделью для изучения того, как разорванные аксоны выполнять свои собственные разборки. Обнаруженный и названный в честь Августа Уоллера в 1850 году, Валлерианская дегенерация (WD) является зонтичным термином, который включает в себя два различных, молекулярно отделяемых процессов7. Во-первых, после аксональной травмы, аксоны отделены от их клеточных тел активно выполнять свои собственные самоуничтожения (аксон смерти) через эволюционно сохранены аксон смерти сигнализации каскад в течение одного дня после травмы8. Во-вторых, окружающие глии и специализированные фагоциты занимаются и очищать полученный аксональный мусор в течение трех-пяти дней. Затухание аксона смерти сигнализации приводит к разорванной аксонов, которые остаются сохраненными в течениенедели 9,10,11,12, в то время как затугание глиального поглощения завершается аксонального мусора, который сохраняется в течение нескольких недель в vivo13,14,15.
Исследования на мух, мышей, крыс и зебры показали несколько эволюционно сохраненных и основных посредников аксон смерти сигнализации8. Мутации смерти Аксона содержат отрубленые аксоны и синапсы, которые не могут подвергнуться смерти аксона; они остаются морфологически и функционально сохраняются в течение нескольких недель, при отсутствии поддержки клеточного тела9,,10,,12,,13,,16,,17,,18,,19,,20,,21,,22,23. Открытие и характеристика этих посредников привели к определению молекулярного пути, исполняющего смерть аксона. Важно отметить, что аксон смерти сигнализации активируется не только тогда, когда аксон разрезан, измельчен или растягивается24,25; он также, как представляется, вклад в различных животных моделей неврологических заболеваний (например, где аксоны вырождаются в травмы независимым образом4, но с рядом полезных результатов4,8). Таким образом, понимание того, как аксон смерти выполняет аксон дегенерации после травмы может предложить понимание за пределами простой модели травмы; она могла бы также предусматривать целевые показатели для терапевтического вмешательства.
Плодовая муха Drosophila melanogaster (Drosophila) оказалась бесценной системой для сигнализации смерти аксона. Исследования в лету показали четыре основных эволюционно сохраненных генов смерти аксона: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 и axundead (axed)12. Модификация этих посредников - потеря функции мутаций hiw, dsarm и топором,и чрезмерное выражение dnmnat - мощно блокирует смерть аксона для продолжительности жизни мухи. В то время как разорванные аксоны дикого типа подвергаются смерти аксона в течение 1 дня, разорванные аксоны и их синапсы, не имеющие приветопта, dsarm или axed остаются не только морфологически, но и функционально сохранены в течение нескольких недель. Может ли также быть достигнуто функциональное сохранение за счет высоких уровней dnmnat еще предстоит определить.
Здесь мы представим три простых и недавно разработанных протокола для изучения смерти аксона (например, морфология и функция разорванных аксонов и их синапсов с течением времени) при отсутствии поддержки клеточного тела. Мы демонстрируем, как ослабленный аксон смерти приводит к разорванной аксонов, которые морфологически сохраняются с hiw потери функции мутации(приветN) и как ослабленный аксон смерти приводит к разорванной аксонов и синапсов, которые остаются функционально сохраняются в течение по крайней мере 7 дней с чрезмерной экспрессии dnmnat (dnmnatOE). Эти протоколы позволяют наблюдать отдельные аксональные и синаптические морфологии либо в центральной, или периферической нервной системы (ЦНС и PNS, соответственно)13,14, в то время как функциональное сохранение отрубленных аксонов и их синапсов в ЦНС может быть визуализирована с помощью простой оптогенетической установки в сочетании с уходом как поведенческие считывания12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tweezers (high precision, ultra fine)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>78520-5</td>
			<td>Antennal ablation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge)</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72933-04</td>
			<td>Wing injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086.0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slips, Thickness 1</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>BB02400600A113MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td>AA00008032E00MNT10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>DCC1240M</td>
			<td>Camera setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Retaining Ring for &#216;1&#34; Lens Tubes and Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mm 1/1.2&#34; C mount Lens</td>
			<td>Tamron</td>
			<td>M112FM25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1A36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 1&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M850L3</td>
			<td>IR LED spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 2&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>FELH0850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Retaining Ring for &#216;1&#34; Lens Tubes and Mounts</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>M660L4</td>
			<td>Red LED spotlight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspheric Condenser Lens, &#216;25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>ACL2520U-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 (1.035&#34;-40) Coupler, External Threads, 0.5&#34; Long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1T2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SM1 Lens Tube Without External Threads, 2&#34; Long, Two Retaining Rings Included</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KPS101</td>
			<td>LED control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LEDD1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB1530/M</td>
			<td>Mount base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>UPH75/M</td>
			<td>Mount, 3x (IR LED, red LED, cam)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;1.20&#34; Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SM1RC/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR40/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-Angle Clamp for &#216;1/2&#34; Posts, 5 mm Hex</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH6MS16</td>
			<td>screws for mount onto base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>782604-01</td>
			<td>Red LED spotlight controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer</td>
			<td>TT Electronics/BI</td>
			<td>P230-2EC22BR20K</td>
			<td>fintuner for indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR (860nm) emitter, 100 mA radial</td>
			<td>Osram</td>
			<td>475-1365-ND</td>
			<td>Red light indicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cable</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-trans retinal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Vwr</td>
			<td>20821.296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halocarbon Oil 27</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>Merk</td>
			<td>81381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer base</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184 silicone elastomer curing agent</td>
			<td>Dow Corning Corp</td>
			<td>4019862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP antibodies</td>
			<td>Rockland</td>
			<td>600-901-215</td>
			<td>Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Dylight anti-Chicken</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab96947</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM7a, B</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_785</td>
			<td>X chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FRT19A[hs-neo]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_1709</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hiw[&#916;N]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_51637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hs-FLP[12]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_1929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tub-Gal80[LL1]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w[1118]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_55135</td>
			<td>2nd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-Gal4[12B]</td>
			<td>Kyoto</td>
			<td>RRID:Kyoto_108492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-HA::dnmnat</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_39702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5xUAS-mCD8::GFP[LL5]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ase-FLP[2d]</td>
			<td>Freeman laboratory</td>
			<td>Neukomm et al., 2014 (PNAS)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyO</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_2555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dpr1-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_25083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR22a-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_9952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ey-FLP[6]</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_5577</td>
			<td>3rd chromosome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMR60E02-Gal4</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_39250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TM3,Sb,e</td>
			<td>BDSC</td>
			<td>RRID:BDSC_3644</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

morphological and functional evaluation of axons and their synapses during axon death in drosophila melanogaster

Дегенерация Аксона является общей особенностью в нейродегенеративных заболеваний и когда нервная система оспаривается механических или химических сил. Однако наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе дегенерации аксона, остается ограниченным. Травма индуцированной аксон дегенерации служит простой моделью для изучения того, как разорванные аксоны выполнять свои собственные разборки (аксон смерти). За последние годы, эволюционно сохраненные аксон смерти сигнализации каскад был определен от мух и млекопитающих, который необходим для разделенного аксона выродиться после травмы. И наоборот, ослабленная смерть аксона приводит к морфологической и функциональной консервации отрубленных аксонов и их синапсов. Здесь мы представляем три простых и недавно разработанных протокола, которые позволяют наблюдать аксональной морфологии, или аксональной и синаптической функции разорванных аксонов, которые были отрезаны от нервного тела клетки, в плодовой мухе Дрозофила. Морфология может наблюдаться в крыле, где частичная травма приводит к смерти аксона бок о бок невредимых аксонов управления в одном и том же нервном пучка. Кроме того, аксональной морфологии также может наблюдаться в головном мозге, где весь нервный пучок подвергается аксон смерти вызвано антенной абляции. Функциональное сохранение разорванных аксонов и их синапсов можно оценить с помощью простого оптогенетического подхода в сочетании с пост-синаптической груминг поведением. Мы представляем примеры с использованием высокой потери функции мутации и чрезмерного выражения dnmnat, как способны задержки аксон смерти в течение нескольких недель до нескольких месяцев. Важно отметить, что эти протоколы могут быть использованы сверх травмы; они облегчают характеристику факторов поддержания нейронов, аксонального транспорта и аксональных митохондрий.

Выше мы описали три метода изучения морфологии и функции разорванных аксонов и их синапсов. Первый метод позволяет осуществлять наблюдение с высоким разрешением отдельных аксонов в PNS. Для этого нужны клоны, генерируемые техникой MARCM14,,31. Здесь мы выполнили кресты для создания дикого типа и highwire мутант клонов MARCM(Рисунок 4A). Простой разрез в середине крыла вызывает аксон травмы нейронов размещены дистальные (например, на внешней стороне крыла), в то время как проксимальные нейроны (например, между разрезом и грудной клетки) остаются невредимыми. Такой подход делает возможным наблюдать аксон смерти бок о бок невредимых аксонов управления в том же нервном пучка(Рисунок 1A, Рисунок 4B). Здесь мы использовали генетический фон, в результате чего в низком количестве GFP помечены клонов (например, два в каждом эксперименте14). Мы представляем примеры 1 и 7 дней после повреждения аксонов дикого типа, чтобы привести примеры управления аксонами, аксонами, подвергаемыми аксонной смертью, и аксональными фрагментами, очищаемыми окружающими глиями, соответственно. Кроме того, мы повторили highwire аксональную травму у мутантов, где проанализировали результат через 7 дней после травмы.
Неповрежденные крылья управления гавани два дикого типа клонов, таким образом, два GFP-маркированных диких типа аксонов(Рисунок 4B, дикий тип, невредимым управления). На следующий день после резки середине крыла с помощью микро-ножницы, аксон смерти индуцируется в GFP-маркированных аксонов, где клеточные тела дистальные к разрезу, в то время как аксоны из проксимически расположенных клеточных органов служат внутренним контролем в рамках того же нервного пучка (Рисунок 4B, дикий тип, 1 день после травмы). Обратите внимание на след аксонального мусора в верхней части, указанной стрелкой. 7 дней после травмы аксона, GFP помечены аксонального мусора очищается окружающих глии, в то время как GFP помечены невредимым управления аксоны остаются в нервной расслоение (Рисунок 4B, дикий тип, 7 дней после травмы, стрелка). В отличие от этого, highwire мутант аксоны, которые были разорваны в течение 7 дней остаются морфологически сохранены, в соответствии с предыдущими выводами11,14 (Рисунок 4B, highwire, 7 дней после травмы, стрелка). Эти результаты демонстрируют мощное визуальное разрешение крыла Дрозофилы. Аксон смерти можно наблюдать бок о бок невредимых элементов управления в том же нервном пучка. В то время как аксоны дикого типа подвергаются смерти аксона в течение 1 дня после травмы, и в результате мусор очищается в течение 7 дней, аксон смерти дефицитных мутантов highwire остаются морфологически сохранены в течение 7 дней.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig04.jpg"> Рисунок 4: Подход к изучению аксона смерти GFP помечены сенсорные нейронные аксоны в крыле. (A) Схематические кресты для создания дикого типа и highwire клонов в крыле (P0 и F1 поколения, соответственно). Девственницы слева, самцы справа. Смотрите таблицу материалов для деталей генотипа. (B) Примеры контроля и поврежденных аксонов с маркировкой GFP. Поле зрения указано в(рисунок 1А). Слева направо: невредимые дикие аксоны управления типом, дикие аксоны типа 1-дневный пост травмы, дикий тип аксонов 7 дней после травмы, highwire мутанта аксоны 7 дней после травмы, соответственно. Стрелки указывают на отрубленных аксонов, шкала бар No 5 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Второй метод описывает, как визуализировать целые аксонные пучки, проецируя в ЦНС, где они образуют синапсы, которые принадлежат к нейронам, размещенным в левой и правой антеннах(рисунок 2A-C). Здесь мы выполнили кресты для создания дикого типа и highwire мутант клонов MARCM(Рисунок 5A). Неповрежденные, GFP-маркированные аксоны и их синапсы могут быть визуализированы в течение нескольких дней до нескольких недель, при отсутствии травмы(рисунок 5B, Дикий тип, неповрежденный контроль). Кроме того, животные могут быть подвергнуты3-й антенный сегмент абляции, и разорвал GFP помечены аксоны и их синапсы могут наблюдаться в течение времени курса в течение нескольких часов до нескольких дней. Мы сосредоточились на 7 дней после абляции антенны, потому что в этот момент точки, аксоны и их синапсы претерпели аксон смерти, и в результате мусорочищается окружающих глии. Если односторонняя абляция правой антенны выполняется, то правый аксон расслоение отрубается и будет разбирать и в результате мусора полностью очищается 7 дней после травмы(Рисунок 5B, дикий тип, одностороннее ablation, 7 дней после травмы, стрелки), в соответствии с предыдущими выводами13. Кроме того, как правая, так и левая антенны могут быть абляции, которая будет разорвать как аксон расслоения, и 7 дней после травмы, аксоны и их синапсы исчезли(Рисунок 5B, дикий тип, двусторонняя абляция, 7 дней после травмы, стрелка). В отличие от этого, одностороннее абляции правых антенн в мутантов highwire приводит к разорванной аксонов, которые остаются сохраненными 7 дней после травмы, в соответствии с предыдущими выводами11,14 (Рисунок 5B, Highwire, односторонней абляции, 7 дней после травмы, стрелка). Эти результаты показывают, что разорванные аксоны дикого типа подвергаются смерти аксона и в результате мусора очищается в течение 7 дней, в то время как аксон смерти дефицитных мутантов провода не могут пройти аксон смерти и остаются морфологически сохранились в течение 7 дней.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig05.jpg"> Рисунок 5: Подход к изучению аксона смерти GFP помечены сенсорные нейронные аксоны в головном мозге. (A) Схематические кресты для создания дикого типа и highwire клонов в головном мозге (P0 и F1 поколения, соответственно). Девственницы слева, самцы справа. Смотрите таблицу материалов для деталей генотипа. (B) Примеры контроля и поврежденных аксонов с маркировкой GFP. Слева направо: невредимые дикие элементы управления типа, дикий тип 7 дней после односторонней абляции антенны, дикий тип 7 дней после двусторонней абляции антенны, и мутанты высокого провода 7 дней после односторонней абляции антенны, соответственно. Стрелки указывают на разорванные аксонные пучки, шкала бар No 10 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Третий метод позволяет наблюдать за функциональным сохранением отрубленых аксонов и их синапсов в ЦНС. Он опирается на манипуляции подмножество нейронов JO размещены в2-й сегмент антенны, которые являются достаточными, чтобы вызвать антенны холить. Выражение красно-сдвигаканала каналродопсина (CsChrimson) в НЕЙРОНах JO, в сочетании с пищевыми добавками всех транс-ретинал, достаточно, чтобы вызвать простой пост-синаптический уход поведение на красный свет воздействия12,30. Здесь мы выполнили кресты для создания диких нейронов типа JO, и НЕЙРОНы JO чрезмерно выражать dnmnat (dnmnatOE)(Рисунок 6A). Дикий тип мух или мух, содержащих JO нейронов с ослабленной смерти аксон(dnmnatOE), как гавань мощное поведение ухода до травмы. Тем не менее, 7 дней после травмы (например, двусторонняя абляция2-го сегмента антенны), уход не может быть вызвано оптогенетики в диком типе мух из-за травмы индуцированной аксон и синапсдевых дегенерации, в то время как животные с ослабленной аксон смерти продолжают жениха(Рисунок 6B, фильм 1,2). Таким образом, ослабленная смерть аксона способна функционально сохранять разорванные аксоны и их синапсы в течение 7 дней.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig06.jpg"> Рисунок 6: Подход к визуализации аксональной и синаптической функции после акотомии. (A) Схематические кресты для создания дикого типа и dnmnat чрезмерного выражения JO сенсорных нейронов (P0 и F1 поколения, соответственно). Девственницы слева, самцы справа. Смотрите таблицу материалов для деталей генотипа. (B) Индивидуальные этограммы ухода поведение индуцированных оптогенетики. Вверху: отдельные этиграммы дикого типа летают до и через 7 дней после травмы (синий). Внизу: отдельные этиграммы мух, перевыражающих dnmnat (dnmnatOE) в нейронах JO до и через 7 дней после травмы (красный). Каждый ящик указывает по крайней мере 1 уход поведение в течение 1 с. Черная линия указывает сумму всех бункеров. (C) Количественная оценка поведения ухода. Данные отображаются в p качестве среднего стандартного отклонения, р.gt; 0.001 (одностороннее ANOVA, несколько сравнений с послехокастого теста Tukey). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Фильм 1: Представитель дикого типа ухода поведение вызвано оптогенетики до и 7 дней после антенной абляции. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_1_wild_type.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.</a>
Фильм 2: Представитель ухода поведение вызвано оптогенетики у мух над-выражения dnmnat в JO нейронов до и 7 дней после антенны абляции. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_2_nmnat.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster at JoVE.com

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Здесь мы предоставляем протоколы для выполнения трех простых травм индуцированной аксон дегенерации (аксон смерти) анализы в Drosophila меланогастер для оценки морфологического и функционального сохранения отрубленный аксонов и их синапсов.

Морфологическая и функциональная оценка аксонов и их синапсов во время смерти Аксона в Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Общая цель этого протокола травмы Drosophila заключается в том, чтобы наблюдать как сохранение аксональной и синаптической морфологии, а также синаптической функции аксонов и их синапсов. Эти анализы также могут быть использованы для характеристики факторов поддержания нейронов, изучения аксонального транспорта или анализа аксональных органелл в нетронутых аксонах. Частичный анализ травмы крыла позволяет для наблюдения раненых аксонов, проходящих дегенерацию бок о бок с невредимыми аксонами управления в том же нервном пучок в крыле Drosophila.Эта травма анализа можно легко практиковать заранее в диких мух типа, применяя разрез примерно в середине крыла с микро-ножницами. Внутренняя травма позволяет оценить аксональной морфологии и с помощью оптогенетики визуализировать функциональное сохранение аксона и их синапсов. Антеннель абляции требует устойчивых рук.Также рекомендуется заранее практиковать удаление антенн у мух дикого типа. При зависимости любая доступная установка оптогенетики подходит для активации нейронов в мухе со шляпой. В противном случае, простая настройка может быть легко построена с нуля.Для начала используйте пять девственных самок и пять самцов из правильного генотипа для выполнения крестов при комнатной температуре. Передача поколения P0 в новые флаконы каждые три-четыре дня. Собирайте свежевыбитое взрослое потомство поколения F1 ежедневно в новые флаконы и старейте их в течение семи-14 дней.После обезболировки используйте микро-ножницы, чтобы вырезать внутреннюю вену крыла примерно в середине крыла. Используйте одно крыло для травмы, а другое крыло, как возраст соответствует невредимым контроля. Применить одну травму на крыло и убедитесь, что получить 15 крыльев ранения.Восстановите мух в пище, содержащей флаконы. Далее, с пипеткой, распространение 10 микролитров галоуглеродного масла 27 вдоль целого стеклянного слайда. Один или семь дней после травмы, использовать микро-ножницы, чтобы отрезать раненых, а также невредимым крылом управления.Используйте пинцет, чтобы захватить крыло в центре, смонтировать максимальные четыре крыла в галоуглеродное масло 27 и покрыть их крышкой слайда. Изображения GFP помечены нейронов в крыле можно легко приобрести с вращающимся диском. Тем не менее, время приобретения должно быть выполнено менее чем через восемь минут после монтажа крыльев, потому что блюдо не фиксируется.Изображение крыла сразу же с помощью вращающегося дискового микроскопа. Приобрети ряд оптических секций вдоль оси q с размером шага 0,33 микрометра и сдавлимите стеки в один файл для последующего анализа. Крест пять девственных самок и пять мужчин из правого генотипа и собирать F1 поколения, как и раньше.После анестезии используйте пинцет для расширения правого третьего сегмента антенны для односторонней абляции или как левого, так и правого третьего сегментов антенн для двусторонней абляции. Это удаляет GFP помечены нейрональных клеток органов в то время как их аксональные проекции остаются в ЦНС. В зависимости от GFP помечены нейронов, используемых в технике, важно знать, являются ли тела клеток размещены в третьем или во втором сегменте антенны для последующего анализа травмы.Восстановите мух в пище, содержащей флаконы. После анестезии используйте пинцет, чтобы схватить шею и другой пинцет, чтобы исправить грудную клетку. Аккуратно потяните шею и отоголову от грудной клетки.Используя пинцет, которые были окунуты в фиксаторный раствор, перенесите все головки в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку, содержащую один миллилитр фиксируя раствора 4%paraformaldehyde и 0,1 тритона X100 в PBS. Зафиксите головки в течение 20 минут с нежным возбуждением при комнатной температуре. Затем положите трубку микроцентрифуга на лед и головы тяготеют к нижней части микроцентрифуг трубки.Удалите супернатант с пипеткой и добавьте один миллилитр стирального буфера, содержащего 0,1%тритон X100 в PBS. Поместите трубку на поворотное колесо при комнатной температуре для мытья в течение двух минут. Повторите мыть четыре дополнительных раза, чтобы удалить остаточный раствор фиксации.После подготовки мозгов, получить крышку слайд, придерживаться лаборатории ленты на нем, и вырезать T, как форма из ленты. Используйте наконечник пипетки от 20 до 200 микролитров, где три миллиметра наконечника были отрезаны, чтобы расширить отверстие пипетки. Pipette мозг, содержащий антифад реагент на слайде и покрыть мозги с крышкой слайд.Используйте глину, чтобы подготовить два небольших 3 рулонах. Убедитесь, что глиняные рулоны не выше высоты стеклянной горки. Stick глины рулонах на стеклянную горку и место мозга, содержащего крышку слайд бутерброд на глиняные рулоны.Продолжить в соответствии с рукописью. Чтобы подготовить мух к оптогенетике, сначала растопить мухомолетную пищу в микроволновой печи. После того, как пища остынет, перед затвердевание, добавить 20 миллимоляров все транс-retinal в этаноле до окончательной концентрации 200 микромолей.Хорошо перемешать и залить пищу сразу в пустые флаконы. Обложка флаконы, содержащие затверденные продукты питания с пробками или ватные шарики. Оберните флаконы алюминиевой фольгой.Затем храните продукты, содержащие флаконы, в темной холодной комнате. Используйте пять девственных самок и пять самцов из правого генотипа для выполнения крестов при комнатной температуре и сбора F1 поколения, как ранее в алюминиевых флаконах, содержащих 200 микромолейных все транс-retinal в лету пищи. Затем соберите мух, нажав их из пищи, содержащей флаконы в пустой флакон без пищи.Охладить флакон во льду, содержащем воду, в течение примерно 30 секунд. Мухи засыпают. Теперь быстро поместите отдельных мух в небольшие камеры, покрытые крышкой слайд для выполнения оптогенетики.В темной комнате выполните протокол, состоящий из 30 секунд, где отсутствует красный свет, а затем 10 секунд воздействия красного света на 10 Герц. Повторите эту процедуру три раза в общей сложности с последующим дополнительным 30-секундный интервал, где красный свет отсутствует. Сбор отдельных мух из каждой камеры на двуокиси углерода колодки.Чтобы подвергать их повреждению антенны, аблат как левый, так и правый второй сегмент антенны. Это удаляет клеточные тела нейронов органа Джонстона в то время как аксональные проекции остаются в ЦНС. Восстановить мух в алюминиевых покрытых флаконов, содержащих 200 миллимолейра все транс-Retinal.В соответствующих точках времени, например, семь дней после абляции антенны, подвергать мух другой уход анализа. В этом протоколе были представлены три метода для изучения морфологии и функции отрубленных аксонов и их синапсов. Первый метод позволяет высокое разрешение наблюдения отдельных аксонов в периферической нервной системе.Схематические кресты для создания клонов дикого типа и хайвайра в крыле показаны здесь. Контроль в травмированных GFP помечены аксоны также представлены стрелы с указанием отрубленных аксонов. Представлен второй подход к изучению аксоновой смерти GFP с маркировкой сенсорных нейронных аксонов в головном мозге.Схематические кресты для генерации диких и высокопроводных клонов в мозге показаны здесь. Примеры контроля в травмированных аксонов GFP представлены стрелками, указывающими на отрезанные аксоновы. Третий метод демонстрирует подход к визуализации аксональной и синаптической функции после аксотомии.Схематические кресты для генерации дикого типа и dnmnat чрезмерного выражения органа Джонастона сенсорных нейронов показано здесь. Мухи дикого типа — мухи, содержащие органные нейроны Джонстона с затухаемой аксоновой смертью. Оба укрывал мощный уход поведение до травмы.Тем не менее, семь дней после травмы, уход не удалось добиться от оптогенетики в диких мух типа, в то время как животные с затухаем аксон смерти продолжали жениха. Здесь мы используем потерю функциональных мутаций или наше выражение генов для наблюдения за сохранением аксональной морфологии или синаптической функции. Другие методы изменения могут быть применены, такие как сбить РНК-интерференции или ткани конкретных CRISPR-Cas9 опосредованного выбить выходы.Эти методы могут быть использованы в травме независимого контекста. Они позволяют для наблюдения и характеристики факторов поддержания нейронов во время старения, аксонального транспорта, и аксональные органеллы в нетронутых аксонов.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

В естественных условиях Визуализация синаптических пузырьков В дрозофилы личинок Сегментные Аксоны

Elucidating the mechanisms of axonal transport has shown to be very important in determining how defects in long distance transport affect different ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Морфологический анализ Drosophila Личинок периферийных сенсорных дендритов нейронов и аксонов с использованием генетических Мозаики

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Optogenetic Стимулирование Побег поведения в<em&gt; Дрозофилы</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Определение спонтанную двигательную активность в<em&gt; Дрозофилы</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Простой Анализ для количественного определения социального избегания у<em&gt; Дрозофилы</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Функциональная и морфологическая оценка диафрагмы иннервации диафрагмального по мотонейронов

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

Условия, влияющие на социальное пространство в<em&gt; Дрозофилы</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в ​​Axon ветвление и морфогенеза нейронов

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Foraging Протокол Путь длиной для<em&gt; Дрозофилы</em&gt; личинки

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...