Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R00 HD032636.

1. تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولى
<ol><li>إزالة الشمع وإعادة ترطيب شرائح FFPE مع 5 دقيقة مخصصة لكل من الخطوات التالية: xylene أو الكواشف المكافئة 3x ، 100٪ الإيثانول 2x ، 95٪ الإيثانول 1x ، 70٪ الإيثانول 1x ، 50٪ الإيثانول 1x ، والمياه المقطرة 2x. ملاحظة: يجب أن تظل الشرائح رطبة بدءًا من خطوة الإماهة هذه حتى ?...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

يعد التلطخ المناعي المتعدد مفيدًا لفحص التوطين الخلوي لمستضدين أو أكثر. هذه التقنية المستخدمة على نطاق واسع تعطي نتائج مقنعة للتوطين عندما تكون الأجسام المضادة الأولية مترافقة مع مراسلين مختلفين (تلطيخ مباشر). ومع ذلك ، فإن تلطيخ مباشر عادة ما يوفر إشارات أضعف مقارنة بتلطيخ غير مباشر ، وا...

في التلطخ المناعي المتعدد، يمكن أن يوفر تلطيخ مباشر باستخدام الأجسام المضادة الأولية المترافقة نتائج مفيدة. دون استخدام الأجسام المضادة الثانوية، وطريقة تلطيخ المباشر لديه خطر منخفض من إشارات توطين كاذبة من التفاعل عبر الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن المراسلين المترافقين (الفلوروفور ، الإنزيمات) أو البيوتين على الأجسام المضادة الأولية يحدون من استخدامه في المستقبل. بدلاً من ذلك، عادة ما يوفر تلطيخ المناعة غير المباشر إشارات أقوى باستخدام جسم مضاد أولي غير مُجرَّد بجسم مضاد ثانوي مُلصق. من الناحية المثالية ، يجب أن تأتي الأجسام المضادة الأولية غير المنقطعة المنتية المستخدمة في تلطيخ المناعة المتعدد من أنواع مضيفة مختلفة لتجنب تفاعل الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن المزيج المناسب من الأجسام المضادة الأولية من الأنواع المضيفة المختلفة غير متاح دائمًا.
وقد وضعت عدة طرق للقضاء على خطر الجسم المضاد الثانوي تتفاعل مع الأجسام المضادة الأولية غير المرغوب فيها. طريقة واحدة شائعة هي استخدام الأجسام المضادة أحادية F (ab) لمنع أي epitopes ملزمة المتبقية على أول مجمع الأجسام المضادة الأولية قبل تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية الثانية1. تجريد الأجسام المضادة ، والتي تشبه الشريط وإعادة سبر من ورقة لطخة الغربية ، يزيل مجمع الأجسام المضادة الملطخة سابقا دون تجريد ترسب جزيئات المراسل ة القابلة للكشف مثل 3،3'diaminobenzidine رباعي هيدروكلوريد (DAB)2 وترسب التيراميد الفلورسنت3. مع هذه الطريقة، يمكن أن تظهر جزيئات المراسل بألوان مختلفة نتيجة متعددة على نفس الشريحة. يمكن أيضًا تحقيق تلطيخ تعدد الأجسام من خلال الإزالة الكاملة للطبقات المودعة سابقًا من الأجسام المضادة ومحاذاة الصور التي تم الحصول عليها لاحقًا من الأجسام المضادة الأخرى4،5. هذه الأساليب تعطي جميع نتائج موثوق بها، على الرغم من أن كل طريقة لها حدودها وتتطلب إما إجراءات معقدة أو نظام تصوير خاص.
يُظهر البروتوكول الحالي تطبيق طريقة تجريد الأجسام المضادة باستخدام المخازن المؤقتة المتاحة بشكل شائع. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي المتعدد على أقسام الغدة الكظرية للفأرة (FFPE) الثابتة البارافين (FFPE) مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية غير المسماة من نفس النوع المضيف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

يستخدم تلطيخ المناعة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لإظهار نمط التعبير الخلوي لبروتين معين. يسمح تلطيخ المناعة المتعدد بالوسم باستخدام أجسام مضادة أولية متعددة. لتقليل التفاعل عبر الأجسام المضادة، يتطلب تلطيخ المناعة المتعدد باستخدام تلطيخ غير مباشر أجسامًا مضادة أولية غير محددة من أنواع مضيفة مختلفة. ومع ذلك ، فإن المزيج المناسب من الأجسام المضادة الأنواع المختلفة ليست متاحة دائما. هنا، نصف طريقة استخدام الأجسام المضادة الأولية غير المسماة من نفس الأنواع المضيفة (على سبيل المثال، في هذه الحالة كلا الأجسام المضادة هي من أرنب) لمثبطات المناعة المتعددة على الفورلين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ (FFPE) أقسام الأدرينالين الماوس. تستخدم هذه الطريقة نفس الإجراء والكواشف المستخدمة في خطوة استرجاع المستضد لتجريد نشاط مجمع الأجسام المضادة الأولية الملطخ سابقًا. كانت الشرائح ملطخة بالأجسام المضادة الأولية الأولى باستخدام بروتوكول تلطيخ مناعي عام متبوع بخطوة ملزمة بجسم مضاد ثانوي حيوي. ثم، تم استخدام طريقة تطوير إشارة avidin-biotin-peroxidase مع فلوروفور-تيراميد كركيزة. تم تجريد النشاط المناعي لأول مجمع الأجسام المضادة الأولية من خلال الغمر في محلول سيترات الصوديوم المغلي بالموجات الدقيقة لمدة 8 دقيقة. وبقي ترسب الفلوروفور-التيراميد غير القابل للذوبان على العينة، مما سمح بتلطيخ الشريحة بالأجسام المضادة الأولية الأخرى. على الرغم من أن هذا الأسلوب يلغي معظم الإشارات الإيجابية الكاذبة، قد تبقى بعض الخلفية من تفاعل الأجسام المضادة. إذا تم إثراء العينات بالبيوتين الذاتي، يمكن استخدام جسم ثانوي مترافق مع البيروكسيديز ليحل محل الجسم المضاد الثانوي الحيوي لتجنب الإيجابية الكاذبة من البيوتين الذاتي ة المنتفية.

تم الحصول على النتائج من عينات عولجت بجميع الخطوات الموصوفة بما في ذلك خطوة استرجاع المستضد 1.2. جميع الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة هنا كانت biotinylated. تم استخدام فلوروفور-تيراميد لتطوير إشارات من الأجسام المضادة الأولية الأولى والثانية. تم التقاط الصور باستخدام مجهر ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at 

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

وقد تم وضع عدة طرق مختلفة لتلطيخ المناعة المتعددة باستخدام الأجسام المضادة الأولية من نفس الأنواع المضيفة. هنا ، نصف استخدام تجريد الأجسام المضادة بوساطة الميكروويف وفلوروفور -التياراميد لمنع تفاعل الأجسام المضادة أثناء تلطيخ المناعة المتعدد على أقسام الغدة الكظرية للفئران الثابتة من البارافين الثابتة.

الميكروويف والفلوروفور- التيراميد للتلطيخ المناعي المتعدد على الغدة الكظرية للفأر - باستخدام الأجسام المضادة الأولية غير المُهمة من نفس الأنواع المضيفة

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

يستخدم علم المناعة على نطاق واسع في البحوث الطبية الحيوية لتحديد موقع البروتين من الفائدة. يمكن الكشف عن مناعة متعددة متعددة أهداف متعددة على نفس العينة باستخدام أجسام مضادة أولية مختلفة. وتتمثل فائدة هذه الطريقة في استخدام المخازن المؤقتة المتاحة عادة للقضاء على نشاط الأجسام المضادة الذي يسمح بالمناعة باستخدام جسمين أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية غير المُسمَّاة من نفس الأنواع المضيفة.ومن خلال هذا الإجراء، ستكون صوفيا تشنغ، طالبة الدراسات العليا، وتشيونغشيا ليو، وهي باحثة زائرة في مختبري. قبل تلطيخ، دي الشمع و rehydrate الشرائح البارافين ثابتة جزءا لا يتجزأ مع الانغماس لمدة خمس دقائق في كل حل كما هو مبين. بعد الغمر الثاني للمياه المقطرة، ضع الشرائح في 275 ملليلتر من محلول سترات الصوديوم المغلي على الجزء السفلي من صندوق تلميح ماصة مع غطاء ووضع الصندوق في ميكروويف 700 واط بقدرة 75٪ لمدة ثماني دقائق.في نهاية العلاج، افتح الغطاء واسمح للمحلول بأن يبرد في درجة حرارة الغرفة قبل غسل الشرائح بثلاثة غسلات لمدة خمس دقائق من PBST الطازجة في جرة كوبلين. لمنع أي مواقع غير محددة ملزمة ، بعد آخر غسل يهز PBST الزائدة من كل شريحة وتغطية الشرائح مع حجم كاف من حل حظر المناسبة. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة، اهز محلول الحجب الزائد من كل شريحة وأضف 250 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية الأولى ذات الأهمية لكل عينة.لمنع العينات من الجفاف، قد تكون مغطاة الشرائح من قبل قطعة من فيلم البارافين. بعد حضانة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية في غرفة مرطبة، وغسل الشرائح ثلاث مرات مع PBST الطازجة لمدة خمس دقائق لكل غسل. تخلص من PBST الزائدة ثم تغطية بسرعة كل شريحة مع 250 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST الطازجة كما هو موضح وإضافة 250 ميكرولترات من اكرسيد الفجل streptavidin إعداد حديثا إلى كل شريحة. بعد 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST الطازجة. ثم التخلص من PBST الزائدة وتغطية كل شريحة مع 250 ميكرولترات من محلول الفلوروهور-tyramide الطازجة.دقيقة واحدة في وقت لاحق ، غمر الشرائح في PBST الطازجة تليها ثلاثة يغسل لمدة دقيقتين في PBST الطازجة. بعد الغسيل الأخير، تطبيق بضع قطرات من واحد إلى واحد حل الجلسرين إلى برنامج تلفزيوني إلى الأقسام والتحقق من وجود إشارة الفلورانس عن طريق المجهر الفلوريسنس. لتجريد أول مركب مضاد، ضع الشرائح المسماة بالأجسام المضادة في 275 ملليلتر من محلول سيترات الصوديوم المغلي لمدة ثماني دقائق على الأقل كما هو موضح.في نهاية العلاج، افتح الغطاء واترك الحل يبرد لدرجة حرارة الغرفة قبل غسل الشرائح ثلاث مرات مع PBST لمدة خمس دقائق لكل غسل. لطخة للبروتين الهدف الثاني من الفائدة، بعد عرقلة للربط غير محددة كما هو موضح، تسمية كل عينة مع 250 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية الثانية من الفائدة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، غسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في PBST الطازجة في غسل قبل تغطية كل شريحة مع 250 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح ثلاث مرات في PBST الطازجة كما هو موضح وإضافة 250 ميكرولترات من اكرسيد الفجل streptavidin إعداد حديثا إلى كل شريحة. لتطوير إشارة للبروتين الهدف الثاني من الفائدة، بعد ثلاثة يغسل PBST، علاج الشرائح مع تيراميد الفلورو مترافق في طيف فلوري مختلف. لوقف تطوير إشارة tyramide ، submerge الشرائح في PBST.ثم وصمة العينات مع صبغة نووية مناسبة. للتصوير عن طريق المجهر الفلوريسنس، جبل كل صبغة نووية تسمية الشريحة مع قطرة من وسيلة تركيب مناسبة في غطاء. استخدام الهدف 4X لتحديد مكان الأنسجة على الشريحة.قم بالتبديل إلى الهدف 10X للتصوير وضبط وقت التعرض إلى 100 إلى 400 مللي ثانية مع مصدر الضوء بين 40 إلى 80٪ شدة. ثم الحصول على الصور في كل قناة دون تحريك المرحلة. يمكن دمج الصور من كل قناة لتشكيل صورة فلورية متعددة.دون تجريد بين تلطيخ الأجسام المضادة الأولى والثانوية ، فإن التلطخ الثاني للهيدروكسيل التيروزين سيلتقط إشارات من البروتين المستهدف الأول من الاهتمام مما يؤدي إلى تلطيخ هيدروكسيلاسي إيجابي زائف ، على سبيل المثال في هذه العينة داخل قشرة الغدة الكظرية. لإزالة الأجسام المضادة عبر النشاط في بيروكسيديز الفجل من أول مناعي، يمكن إجراء تجريد لمدة دقيقة وثماني دقائق بواسطة الميكروويف مما يؤدي إلى نتائج تلوين مزدوجة نظيفة. يتم التقاط أي إشارة هامة في عينات التحكم السلبية.تجريد لمدة ثماني دقائق في عازلة سيترات الغليان هو أيضا كافية للقضاء على الأجسام المضادة عبر التفاعل للعديد من الأجسام المضادة المستخدمة عادة في الغدة الكظرية. في بعض الحالات، إشارة إيجابية كاذبة ضعيفة لا يزال يمكن الكشف عنها، ومع ذلك، وزيادة 20 دقيقة لمعالجة الميكروويف لا يزال قد لا إزالة تماما الأجسام المضادة عبر التفاعل. أثناء التصوير المفلور، من المهم عدم تحريك المرحلة عند تبديل القنوات.ومع ذلك، قد يكون من الضروري إعادة ضبط التركيز للحصول على صور واضحة لكل قناة. لكل قناة، تأكد من ضبط وقت التعرض للتأكد من أن الإشارات مكشوفة بشكل مناسب بدون وحدات بكسل أو مناطق مكشوفة في الصور. أثناء إجراء تلطيخ، من المهم للحفاظ على الشرائح رطب من إزالة الصبح والشرائح يمكن تجريدها باستخدام نفس أساليب تجريد عدة مرات للسماح تلطيخ متعددة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة إلى خلايا انتقائي تنبيغ الابتدائية دبقية قليلة التغصن السلائف ل<em&gt; في المختبر</em&gt; فحوصات تكون الميالين

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

تغليف الجينات المحفزة للخلايا الجذعية باستخدام فوهة المشارك المحوري

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

عن طريق عزل الميتوكوندريا من كميات الحد الأدنى من الفأر العضلات الهيكلية لارتفاع صفيحة ميكروسكوبية الإنتاجية قياسات الجهاز التنفسي

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

الثقافات توليد الخلايا الليفية الأولية من ماوس الأذن والذيل الأنسجة

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

الناجم المحفزة الجيل الخلايا الجذعية من خلايا الدم عن طريق سينداي الفيروسات والطرد المركزي

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

باستخدام الثقافات Neurosphere الأولية لدراسة الابتدائية سيليا

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

خلية كاملة التصحيح المشبك تسجيلات من الخلايا الظهارية الأولية المعزولة من البربخ

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

إعداد الأنسجة وتلطيخ المناعة من أنسجة الفئران القحفية والعظام غير الصائق

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...