Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at

Dit werk wordt ondersteund door NIH R00 HD032636.

1. Vlekken met het eerste antilichaam
<ol><li>Dewax en rehydrate FFPE dia's met 5 min toegewezen aan elk van de volgende stappen: xyleen of gelijkwaardige reagentia 3x, 100% ethanol 2x, 95% ethanol 1x, 70% ethanol 1x, 50% ethanol 1x, en gedestilleerd water 2x. OPMERKING: Dia's moeten vochtig blijven vanaf deze rehydratiestap tot de montage in de laatste stap.</li>
	<li>Voor het optioneel ophalen van antigeen plaatst u de glijbanen in 275 mL kokende natriumcitraatoplossing (10 mM, pH = 6,0) gedurende 8 min. Om de opl...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

Multiplex immunostaining is nuttig om de cellulaire colokalisatie van twee of meer antigenen te onderzoeken. Deze veel gebruikte techniek geeft overtuigende colokalisatie resultaten wanneer primaire antilichamen worden geconjugeerd met verschillende verslaggevers (directe kleuring). Echter, directe kleuring biedt meestal zwakkere signalen in vergelijking met indirecte vlekken, waarbij geconjugeerde secundaire antilichamen om de primaire antilichamen te detecteren. Bij indirecte kleuring is een hoogwaardig multiplex immun...

In multiplex immunostaining, directe vlekken met behulp van geconjugeerde primaire antilichamen kan informatieve resultaten opleveren. Zonder gebruik te maken van secundaire antilichamen, de directe kleuring methode heeft een laag risico van valse colokalisatie signalen van antilichaam cross-reactiviteit. Echter, de geconjugeerde verslaggevers (fluorophore, enzymen) of biotine op het primaire antilichaam beperken het toekomstige gebruik ervan. Als alternatief geeft indirecte immunovlekken meestal sterkere signalen met behulp van een ongeconjugeerd primair antilichaam met een gelabeld secundair antilichaam. Idealiter moeten ongeconjugeerde primaire antilichamen die worden gebruikt in multiplex immunostaining afkomstig zijn van verschillende gastheersoorten om cross-reactiviteit van antilichamen te voorkomen. De juiste combinatie van primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten is echter niet altijd beschikbaar.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld om het risico te elimineren dat het secundaire antilichaam reageert met een ongewenst primair antilichaam. Een veel voorkomende methode is het gebruik van een F(ab) monomeric antilichaam om eventuele resterende bindende epitopen op het eerste primaire antilichaamcomplex te blokkeren voordat het wordt bevlekken met het tweede primaire antilichaam1. Antilichaam strippen, die vergelijkbaar is met de strip en reprobe van een westerse vlek blad, verwijdert de eerder gekleurde antilichaam complex zonder strippen van de afzetting van detecteerbare reporter moleculen zoals 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 en de fluorescerende tyramide afzetting3. Met deze methode kunnen reportermoleculen in verschillende kleuren een multiplexresultaat op dezelfde dia weergeven. De multiplex kleuring is ook haalbaar door de volledige verwijdering van de eerder gedeponeerde lagen antilichamen en de uitlijning van vervolgens verworven beelden van andere antilichamen4,5. Deze methoden geven allemaal betrouwbare resultaten, hoewel elke methode zijn beperkingen heeft en ingewikkelde procedures of een speciaal beeldvormingssysteem vereist.
Het huidige protocol toont de toepassing van een antilichaam strippen methode met het gebruik van algemeen beschikbare buffers. Dit protocol kan worden gebruikt voor het uitvoeren van multiplex immunofluorescente vlekken op formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties met twee niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

Immunostaining wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om het cellulaire expressiepatroon van een bepaald eiwit aan te tonen. Multiplex immunostaining maakt etikettering met behulp van meerdere primaire antilichamen mogelijk. Om cross-reactiviteit van antilichamen te minimaliseren, vereist multiplex immunostaining met indirecte kleuring niet-gelabelde primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten. De juiste combinatie van verschillende soortenantilichamen is echter niet altijd beschikbaar. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten (bijvoorbeeld, in dit geval zijn beide antilichamen van konijn) voor multiplex immunofluorescentie op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties. Deze methode maakt gebruik van dezelfde procedure en reagentia die in de antigeenterugwinningsstap worden gebruikt om de activiteit van het eerder gekleurde primaire antilichaamcomplex te ontdoen. Dia's werden gekleurd met het eerste primaire antilichaam met behulp van een algemeen immunostaining protocol gevolgd door een bindende stap met een biotinylated secundair antilichaam. Vervolgens werd een avidin-biotine-peroxidase signaal ontwikkelingsmethode gebruikt met fluorophore-tyramide als substraat. De immunoactiviteit van het eerste primaire antilichaamcomplex werd gestript door onderdompeling in een microgolfkokende natriumcitraatoplossing voor 8 min. De onoplosbare fluorophore-tyramideafzetting bleef op het monster staan, waardoor de dia kon worden vastgehouden met andere primaire antilichamen. Hoewel deze methode elimineert de meeste vals-positieve signalen, sommige achtergrond van antilichaam cross-reactiviteit kan blijven. Als de monsters zijn verrijkt met endogene biotine, kan een geperoxideerd secundair antilichaam worden gebruikt ter vervanging van het biogetinylated secundair einlichaam om het vals-positieve van teruggewonnen endogene biotine te voorkomen.

De resultaten werden verkregen uit monsters die werden behandeld met alle beschreven stappen, waaronder de stap 1.2 voor het ophalen van antigeen. Alle secundaire antilichamen die hier werden gebruikt waren biotinylated. Fluorophore-tyramide werd gebruikt om signalen te ontwikkelen van de eerste en tweede primaire antilichamen. Beelden werden vastgelegd met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een FITC kubus (voor groene fluorescentie), een TxRED kubus (voor Cy3) en een DA...

Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at 

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Er zijn verschillende methoden vastgesteld voor multiplex immunostaining met primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort. Hier beschrijven we het gebruik van microgolf-gemedieerde antilichaam strippen en van fluorophore-tyramide om antilichaam cross-reactiviteit te blokkeren tijdens multiplex immunostaining op formaline-vaste paraffine-embedded muis bijnier secties.

Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

Immunostaining wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om de locatie van een eiwit van belang te identificeren. Multiplex immunostaining kan meerdere doelen op hetzelfde monster detecteren met behulp van verschillende primaire antilichamen. Het voordeel van deze methode is het gebruik van algemeen beschikbare buffers om antilichaam kruisreactiviteit te elimineren waardoor immunostaining met behulp van twee of meer niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort.Het aantonen van de procedure zal Sophia Zheng, een afgestudeerde student, en Qiongxia Lyu, een bezoekende geleerde van mijn lab. Voor het beitsen, de-wax en rehydraat formaline vaste paraffine-embedded dia's met vijf minuten onderdompes in elke oplossing zoals aangegeven. Na de tweede gedestilleerde wateronderdompeling, plaats de glijbanen in 275 milliliter kokende natrium citraat oplossing op de bodem van een pipet tip box met een deksel en plaats de doos in een 700 watt magnetron op 75%vermogen gedurende acht minuten.Open aan het einde van de behandeling het deksel en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur voordat u de glijbanen wast met drie vijf minuten durende wasbeurten van verse PBST in een Coplin-pot. Om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, schudt u na de laatste wasbeurt de overtollige PBST van elke dia en bedekt u de dia's met een voldoende volume van een geschikte blokkeringsoplossing. Na 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer, schud de overtollige blokkeren oplossing van elke dia en voeg 250 microliter van de eerste primaire antilichaam van belang aan elk monster.Om te voorkomen dat monsters uitdrogen, kunnen de dia's worden bedekt met een stuk paraffinefilm. Na een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer, was de glijbanen drie keer met verse PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Schud de overtollige PBST af en bedek elke dia snel met 250 microliters van een geschikte secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van een uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBST zoals aangetoond en voeg 250 microliters van vers bereide streptavidin mierikswortel peroxidase aan elke dia. Na 30 minuten op kamertemperatuur, was de glijbanen drie keer in verse PBST. Schud vervolgens de overtollige PBST af en bedek elke dia met 250 microliters van vers bereide fluorofofoof-tyramide oplossing.Een minuut later, dompel de glijbanen in verse PBST, gevolgd door drie twee minuten wasbeurten in verse PBST. Breng na de laatste wasbeurt een paar druppels van een één-op-één glycerol-naar-PBS-oplossing aan op de secties en controleer op de aanwezigheid van een fluorescentiesignaal door fluorescentiemicroscopie. Om het eerste antilichaamcomplex te strippen, plaatst u de antilichaamgelabelde dia's gedurende ten minste acht minuten in 275 milliliter kokende natriumcitraatoplossing, zoals aangetoond.Open aan het einde van de behandeling het deksel en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur voordat u de glijbanen drie keer met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt wast. Om te vlekken voor het tweede doeleiwit van belang, na het blokkeren van niet-specifieke binding zoals aangetoond, etiketteerde elk monster met 250 microliter van het tweede primaire antilichaam van belang bij vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend was je de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in verse PBST per wasbeurt voordat je elke dia bedekt met 250 microliters van een geschikte secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBST zoals aangetoond en voeg 250 microliters van vers bereide streptavidin mierikswortel peroxidase aan elke dia. Om het signaal voor het tweede doeleiwit van belang te ontwikkelen, behandel de dia's na drie PBST-wasbeurten met de fluorofofofreed tyramide in een ander fluorescentiespectrum. Om de ontwikkeling van het tyramidesignaal te stoppen, dompelt u de dia's onder in PBST.Bevlek vervolgens de monsters met een geschikte nucleaire kleurstof. Voor beeldvorming door fluorescentie microscopie, monteer elke nucleaire kleurstof gelabeld dia met een druppel van een geschikte montage medium in een coverslip. Gebruik de 4X doelstelling om het weefsel op de dia te lokaliseren.Schakel over naar de 10X-doelstelling voor beeldvorming en pas de belichtingstijd aan op 100 tot 400 milliseconden met de lichtbron tussen 40 en 80%-intensiteit. Verkrijg vervolgens afbeeldingen in elk kanaal zonder het podium te verplaatsen. De afbeeldingen van elk kanaal kunnen worden samengevoegd tot een fluorescerende afbeelding.Zonder te strippen tussen de eerste en secundaire antilichaam kleuring, de tweede kleuring voor tyrosine hydroxylase zal pikken signalen van het eerste doel eiwit van belang wat resulteert in een vals positieve tyrosine hydroxylase kleuring, bijvoorbeeld in dit monster in de bijnierschors. Om de antilichaam kruisreactiviteit in de mierikswortelperoxidase te verwijderen vanaf de eerste immunostaining, kan een minuut en acht minuten microgolf-gemedieerde strippen worden uitgevoerd wat resulteert in schone dubbele kleuringsresultaten. Er wordt geen significant signaal opgenomen in negatieve controlemonsters.Acht minuten strippen in kokende citraat buffer is ook voldoende om antilichaam cross-reactiviteit te elimineren voor veel antilichamen vaak gebruikt in de bijnier. In sommige gevallen is een zwak vals-positief signaal echter nog steeds detecteerbaar en een toename van 20 minuten naar de microgolfbehandeling kan de kruisreactiviteit van het antilichaam nog steeds niet volledig verwijderen. Tijdens fluorescentiebeeldvorming is het belangrijk om het stadium niet te verplaatsen bij het schakelen van kanalen.Het kan echter nodig zijn om de focus aan te passen om duidelijke beelden van elk kanaal te verkrijgen. Zorg ervoor dat u voor elk kanaal de belichtingstijd aanpast om ervoor te zorgen dat de signalen op de juiste manier worden belicht zonder overbelichte pixels of gebieden in de afbeeldingen. Tijdens de kleuringsprocedure is het belangrijk om de dia's gehydrateerd te houden van de ontwas en de dia's kunnen meerdere keren worden gestript met dezelfde stripmethoden om multiplex-vlekken mogelijk te maken.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor<em&gt; In Vitro</em&gt; Myelination Testen

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Genererende Primaire fibroblastculturen van Mouse Oor en de Staart Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Geïnduceerde pluripotente stamcellen Generation van Blood Cells Met behulp van Sendai Virus en Centrifugeren

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Hele-cel patch-klem opnames van geïsoleerde primaire epitheliale cellen uit de epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetische manipulatie van primaire muis intestinale Organoïden met behulp van magnetische nanodeeltjes transductie virale vectoren voor bevroren snijden

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...