Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
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1. Staining avec le premier anticorps
<ol><li>Décire et réhydrater les glissières FFPE avec 5 min allouées à chacune des étapes suivantes : xylène ou réactifs équivalents 3x, 100 % éthanol 2x, 95 % éthanol 1x, 70 % éthanol 1x, 50 % éthanol 1x et eau distillée 2x. REMARQUE : Les glissières doivent rester humides à partir de cette étape de réhydratation jusqu’à l’accumulation dans l’étape finale.</li>
	<li>Pour la récupération facultative de l’antigène, placez les lames dans 275 ml de so...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

Multiplex immunostaining est utile pour examiner la colocalisation cellulaire de deux ou plusieurs antigènes. Cette technique largement utilisée donne des résultats convaincants de colocalisation lorsque les anticorps primaires sont conjugués avec différents journalistes (coloration directe). Cependant, la coloration directe fournit habituellement des signaux plus faibles par rapport à la coloration indirecte, ce qui implique des anticorps secondaires conjugués pour détecter les anticorps primaires. Dans la color...

Dans l’immunostaining multiplex, la coloration directe utilisant des anticorps primaires conjugués peut fournir des résultats informatifs. Sans utiliser d’anticorps secondaires, la méthode de coloration directe présente un faible risque de faux signaux de colocalisation provenant de la réactivité croisée des anticorps. Cependant, les reporters conjugués (fluorophore, enzymes) ou la biotine sur l’anticorps primaire limitent son utilisation future. Alternativement, l’immunostaining indirect fournit habituellement des signaux plus forts en utilisant un anticorps primaire non conjugué avec un anticorps secondaire étiqueté. Idéalement, les anticorps primaires non conjugués utilisés dans l’immunostaining multiplex devraient provenir de différentes espèces hôtes pour éviter la réactivité croisée des anticorps. Cependant, la combinaison appropriée d’anticorps primaires provenant de différentes espèces hôtes n’est pas toujours disponible.
Plusieurs méthodes ont été établies pour éliminer le risque que l’anticorps secondaire réagisse avec un anticorps primaire indésirable. Une méthode courante est l’utilisation d’un anticorps monomeric F(ab) pour bloquer les épitopes de liaison restants sur le premier complexe d’anticorps primaires avant de coloration avec le deuxième anticorps primaire1. Le décapage des anticorps, qui est similaire à la bande et à la résondance d’une feuille de tache occidentale, enlève le complexe d’anticorps précédemment taché sans dépouiller le dépôt de molécules de reporter détectables telles que le tétrahydrochlorure de 3,3'-diaminobenzidine (DAB)2 et le dépôt fluorescent de tyramide3. Avec cette méthode, les molécules de reporter dans différentes couleurs peuvent montrer un résultat multiplexe sur la même diapositive. La coloration multiplexe est également réalisable par l’élimination complète des couches précédemment déposées d’anticorps et l’alignement des images acquises ultérieurement à partir d’autres anticorps4,5. Ces méthodes donnent toutes des résultats fiables, bien que chaque méthode ait ses limites et nécessite soit des procédures compliquées, soit un système d’imagerie spécial.
Le protocole actuel montre l’application d’une méthode de décapage des anticorps avec l’utilisation de tampons couramment disponibles. Ce protocole peut être utilisé pour effectuer des taches immunofluorescentes multiplex sur des sections surrénales de souris intégrées à la paraffine (FFPE) avec deux anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

Immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour montrer le modèle d’expression cellulaire d’une protéine donnée. L’immunostaining multiplex permet l’étiquetage à l’aide de plusieurs anticorps primaires. Pour minimiser la réactivité croisée des anticorps, l’immunostaining multiplex à l’aide de taches indirectes nécessite des anticorps primaires non étiquetés provenant de différentes espèces hôtes. Cependant, la combinaison appropriée de différents anticorps d’espèces n’est pas toujours disponible. Ici, nous décrivons une méthode d’utilisation des anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte (par exemple, dans ce cas, les deux anticorps sont du lapin) pour l’immunofluorescence multiplex sur les sections surrénales de souris formalin-fixes (FFPE). Cette méthode utilise la même procédure et les réactifs utilisés dans l’étape de récupération d’antigène pour dépouiller l’activité du complexe d’anticorps primaire précédemment taché. Des glissières ont été souillées avec le premier anticorps primaire utilisant un protocole d’immunostaining général suivi d’une étape de liaison avec un anticorps secondaire biotinylated. Ensuite, une méthode de développement de signal avidin-biotine-peroxidase a été utilisée avec le fluorophore-tyramide comme substrat. L’immunoactivité du premier complexe primaire d’anticorps a été dépouillée par immersion dans une solution de citrate de sodium bouillante au micro-ondes pendant 8 min. Le dépôt insoluble de fluorophore-tyramide est resté sur l’échantillon, ce qui a permis à la glissière d’être tachée avec d’autres anticorps primaires. Bien que cette méthode élimine la plupart des faux signaux positifs, un certain fond de la réactivité croisée des anticorps peut rester. Si les échantillons sont enrichis en biotine endogène, un anticorps secondaire conjugué par peroxidase peut être utilisé pour remplacer l’anticorps secondaire biotinylated pour éviter le faux positif de la biotine endogène récupérée.

Les résultats ont été obtenus à partir d’échantillons traités avec toutes les étapes décrites, y compris l’étape de récupération d’antigène 1.2. Tous les anticorps secondaires utilisés ici ont été biotinylated. Fluorophore-tyramide a été utilisé pour développer des signaux à partir des premiers et deuxièmes anticorps primaires. Des images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’un cube FITC (pour la fluorescence verte), d?...

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Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Plusieurs méthodes différentes ont été établies pour l’immunostaining multiplex utilisant des anticorps primaires de la même espèce hôte. Ici, nous décrivons l’utilisation du décapage micro-ondes d’anticorps et du fluorophore-tyramide pour bloquer la réactivité croisée d’anticorps pendant l’immunostaining multiplex sur les sections surrénales paraffines formalin-fixes de paraffine.

Micro-ondes et Fluorophore-Tyramide pour l’immunostaining multiplex sur les surrénales de souris - utilisation d’anticorps primaires non conjugués de la même espèce hôte

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

L’immunostaining est largement utilisé dans la recherche biomédicale pour identifier l’emplacement d’une protéine d’intérêt. L’immunostaining multiplexe peut détecter plusieurs cibles sur le même échantillon à l’aide d’anticorps primaires différents. L’avantage de cette méthode est l’utilisation de tampons couramment disponibles pour éliminer la réactivité croisée des anticorps permettant l’immunostaining à l’aide de deux ou plusieurs anticorps primaires non étiquetés de la même espèce hôte.Sophia Zheng, étudiante diplômée, et Qiongxia Lyu, chercheur invité de mon laboratoire, démontreront la procédure. Avant de tacher, de-cirer et de réhydrater les diapositives intégrées à la paraffine fixées à la formaline avec des immersions de cinq minutes dans chaque solution comme indiqué. Après la deuxième immersion d’eau distillée, placez les glissières dans 275 millilitres de solution bouillante de citrate de sodium au fond d’une boîte à pointes pipette avec couvercle et placez la boîte dans un four à micro-ondes de 700 watts à 75 % de puissance pendant huit minutes.À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez refroidir la solution à température ambiante avant de laver les glissières avec trois lavages de cinq minutes de PBST frais dans un bocal Coplin. Pour bloquer les sites de fixation non spécifiques, après le dernier lavage secouer l’excès de PBST de chaque diapositive et couvrir les diapositives avec un volume suffisant d’une solution de blocage appropriée. Après 30 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée, secouez la solution de blocage excédentaire de chaque glissière et ajoutez 250 microlitres du premier anticorps primaire d’intérêt à chaque échantillon.Pour éviter que des échantillons ne se dessèchent, les diapositives peuvent être recouvertes d’un morceau de film de paraffine. Après une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius dans une chambre humidifiée, lavez les glissières trois fois avec du PBST frais pendant cinq minutes par lavage. Secouez l’excès de PBST puis couvrez rapidement chaque toboggan avec 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure dans une chambre humidifiée à température ambiante.À la fin de l’incubation, lavez les glissières trois fois dans le PBST frais tel que démontré et ajoutez 250 microlitres de peroxyde de raifort streptavidine fraîchement préparé à chaque diapositive. Après 30 minutes à température ambiante, lavez les glissières trois fois dans du PBST frais. Ensuite, secouez l’excès de PBST et couvrez chaque toboggan de 250 microlitres de solution fluorophore-tyramide fraîchement préparée.Une minute plus tard, submergez les glissières dans le PBST frais suivi de trois lavages de deux minutes dans le PBST frais. Après le dernier lavage, appliquez quelques gouttes d’une solution glycérol-pbs en tête-à-tête aux sections et vérifiez la présence d’un signal de fluorescence par microscopie de fluorescence. Pour dépouiller le premier complexe d’anticorps, placez les glissières étiquetées anticorps dans 275 millilitres de solution bouillante de citrate de sodium pendant au moins huit minutes, comme démontré.À la fin du traitement, ouvrez le couvercle et laissez refroidir la solution à température ambiante avant de laver les glissières trois fois avec le PBST pendant cinq minutes par lavage. Pour tacher la deuxième protéine cible d’intérêt, après blocage pour la liaison non spécifique comme démontré, étiquetez chaque échantillon avec 250 microlitres du deuxième anticorps primaire d’intérêt à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les glissières trois fois pendant cinq minutes en PBST frais par lavage avant de couvrir chaque toboggan de 250 microlitres d’une solution d’anticorps secondaire appropriée pour une incubation d’une heure à température ambiante.À la fin de l’incubation, lavez les glissières trois fois dans le PBST frais tel que démontré et ajoutez 250 microlitres de peroxyde de raifort streptavidine fraîchement préparé à chaque diapositive. Pour développer le signal de la deuxième protéine cible d’intérêt, après trois lavages PBST, traiter les diapositives avec le tyramide conjugué fluorophore dans un spectre de fluorescence différent. Pour arrêter le développement du signal tyramide, submergez les glissières dans PBST.Ensuite, teindre les échantillons avec un colorant nucléaire approprié. Pour l’imagerie par microscopie par fluorescence, montez chaque colorant nucléaire étiqueté glisser avec une goutte d’un milieu de montage approprié dans un coverslip. Utilisez l’objectif 4X pour localiser le tissu sur la lame.Passez à l’objectif 10X pour l’imagerie et ajustez le temps d’exposition à 100 à 400 millisecondes avec la source lumineuse entre 40 et 80% d’intensité. Obtenez ensuite des images dans chaque canal sans déplacer la scène. Les images de chaque canal peuvent être fusionnées pour former une image fluorescente multiplexe.Sans décapage entre la première et la coloration secondaire d’anticorps, la deuxième coloration pour l’hydroxylase de tyrosine ramassera des signaux de la première protéine cible d’intérêt ayant pour résultat une coloration faussement positive d’hydroxylase de tyrosine, par exemple dans cet échantillon dans le cortex surrénalien. Pour éliminer la réactivité croisée des anticorps dans le peroxyde de raifort du premier décapage à micro-ondes d’une minute et de huit minutes, il est possible d’effectuer un décapage propre à double coloration. Aucun signal significatif n’est capté dans les échantillons de contrôle négatifs.Le décapage de huit minutes dans le tampon bouillant de citrate est également suffisant pour éliminer la réactivité croisée d’anticorps pour beaucoup d’anticorps couramment utilisés dans la glande surrénale. Dans certains cas, un faible signal faux positif est encore détectable, cependant, et une augmentation de 20 minutes au traitement par micro-ondes peut encore ne pas enlever complètement la réactivité croisée de l’anticorps. Pendant l’imagerie par fluorescence, il est important de ne pas déplacer la scène lors de la commutation des canaux.Toutefois, il peut être nécessaire de réajuster l’accent pour obtenir des images claires de chaque canal. Pour chaque canal, assurez-vous d’ajuster le temps d’exposition pour vous assurer que les signaux sont correctement exposés sans pixels ou zones surexposés dans les images. Au cours de la procédure de coloration, il est important de garder les diapositives hydratées de la dé-épilation et les diapositives peuvent être dépouillées en utilisant les mêmes méthodes de décapage à plusieurs reprises pour permettre la coloration multiplexe.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

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