Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
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1. Färbung mit dem ersten Antikörper
<ol><li>FFPE-Dias mit 5 min auf jede der folgenden Schritte zuteilen: Xylol oder gleichwertige Reagenzien 3x, 100% Ethanol 2x, 95% Ethanol 1x, 70% Ethanol 1x, 50% Ethanol 1x und destilliertes Wasser 2x. HINWEIS: Folien sollten von diesem Rehydrierungsschritt bis zur Montage im letzten Schritt feucht bleiben.</li>
	<li>Für den optionalen Antigen-Abruf die Dias in 275 ml kochende Natriumcitratlösung (10 mM, pH = 6,0) für 8 min legen. Um die Lösung am Kochen zu halten, legen S...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

Multiplex-Immunostaining ist nützlich, um die zelluläre Kolokalisierung von zwei oder mehr Antigenen zu untersuchen. Diese weit verbreitete Technik liefert überzeugende Kolokalisierungsergebnisse, wenn primäre Antikörper mit verschiedenen Reportern konjugiert werden (direkte Färbung). Jedoch, direkte Färbung bietet in der Regel schwächere Signale im Vergleich zu indirekten Färbung, die konjugierte sekundäre Antikörper beinhaltet, um die primären Antikörper zu erkennen. Bei der indirekten Färbung beruht ein ...

Bei multipleximmunostaining kann die direkte Färbung mit konjugierten Primärantikörpern informative Ergebnisse liefern. Ohne sekundäre Antikörper hat die direkte Färbemethode ein geringes Risiko für falsche Kolokalisierungssignale durch Antikörper-Kreuzreaktivität. Die konjugierten Reporter (Fluorophor, Enzyme) oder Biotin auf dem primären Antikörper begrenzen jedoch seine zukünftige Verwendung. Alternativ liefert die indirekte Immunfärbung in der Regel stärkere Signale, indem ein nicht konjugierter Primärantikörper mit einem markierten sekundären Antikörper verwendet wird. Idealerweise sollten nicht konjugierte primäre Antikörper, die in Multiplex-Immunostainierung verwendet werden, von verschiedenen Wirtsarten stammen, um Antikörper-Kreuzreaktivität zu vermeiden. Die geeignete Kombination von Primärantikörpern verschiedener Wirtsarten ist jedoch nicht immer verfügbar.
Es wurden mehrere Methoden eingeführt, um das Risiko zu beseitigen, dass der sekundäre Antikörper mit einem unerwünschten primärantikörper reagiert. Eine gängige Methode ist die Verwendung eines monomeren F(ab) Antikörpers, um alle verbleibenden Bindungsepitope auf dem ersten primären Antikörperkomplex zu blockieren, bevor der zweite primäre Antikörper1gefärbt wird. Das Abisolieren von Antikörpern, das dem Streifen und der Reprobe eines westlichen Fleckenblattes ähnelt, entfernt den zuvor gebeizten Antikörperkomplex, ohne die Ablagerung nachweisbarer Reportermoleküle wie 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB)2 und die fluoreszierende Tyramidabscheidung3zu entfernen. Mit dieser Methode können Reportermoleküle in verschiedenen Farben ein Multiplex-Ergebnis auf derselben Folie anzeigen. Die Multiplexfärbung ist auch durch die vollständige Entfernung der zuvor abgelagerten Antikörperschichten und die Ausrichtung nachträglich aufgenommener Bilder von anderen Antikörpernerreichbar 4,5. Diese Methoden liefern alle zuverlässige Ergebnisse, obwohl jede Methode ihre Grenzen hat und entweder komplizierte Verfahren oder ein spezielles Bildgebungssystem erfordert.
Das vorliegende Protokoll zeigt die Anwendung einer Antikörper-Stripping-Methode unter Verwendung allgemein verfügbarer Puffer. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten mit zwei nicht beschrifteten primär antikörpern den gleichen Wirtsarten durchzuführen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

Immunostaining ist weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung verwendet, um die zelluläre Expression Muster eines bestimmten Proteins zu zeigen. Multiplex-Immunostainierung ermöglicht die Etikettierung mit mehreren primären Antikörpern. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität zu minimieren, erfordert multiplexe Immunfärbung mit indirekter Färbung unbeschriftete Primärantikörper verschiedener Wirtsarten. Die geeignete Kombination verschiedener Artenantikörper ist jedoch nicht immer verfügbar. Hier beschreiben wir eine Methode zur Verwendung unbeschrifteter Primärantikörper derselben Wirtsart (z.B. in diesem Fall stammen beide Antikörper von Kaninchen) zur Multiplex-Immunfluoreszenz auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Mausnebennierenabschnitten. Bei dieser Methode wird das gleiche Verfahren und die gleichen Reagenzien verwendet, die im Antigen-Retrieval-Schritt verwendet werden, um die Aktivität des zuvor gebeizten Primärantikörperkomplexes zu entfernen. Die Dias wurden mit dem ersten primären Antikörper mit einem allgemeinen Immunfleckenprotokoll befleckt, gefolgt von einem Bindungsschritt mit einem biotinylierten Sekundärantikörper. Dann wurde eine Avidin-Biotin-Peroxidase-Signalentwicklungsmethode mit Fluorophor-Tyramid als Substrat verwendet. Die Immunaktivität des ersten primären Antikörperkomplexes wurde durch Eintauchen in eine Mikrowellen-Koch-Natriumcitratlösung für 8 min abgestreift. Die unlösliche Fluorophor-Tyramid-Ablagerung blieb auf der Probe, wodurch der Schlitten mit anderen primären Antikörpern gefärbt werden konnte. Obwohl diese Methode die meisten falsch positiven Signale eliminiert, kann ein gewisser Hintergrund von Antikörper-Cross-Reaktivität bleiben. Wenn die Proben mit endogenem Biotin angereichert sind, kann ein peroxidasekonjugierter Sekundärantikörper verwendet werden, um den biotinylierten Sekundärantikörper zu ersetzen, um das falsche Positiv aus wiedergewonnenem endogenem Biotin zu vermeiden.

Die Ergebnisse wurden aus Proben gewonnen, die mit allen beschriebenen Schritten einschließlich des Antigen-Abrufschritts 1.2 behandelt wurden. Alle hier verwendeten sekundären Antikörper wurden biotinyliert. Fluorophor-Tyramid wurde verwendet, um Signale aus dem ersten und zweiten primären Antikörper zu entwickeln. Die Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop mit einem FITC-Würfel (für grüne Fluoreszenz), einem TxRED-Würfel (für Cy3) und einem DAPI-Würfel (für DAPI) aufge...

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Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Für multipleX-Immunostaining mit primärer Antikörper aus der gleichen Wirtsart wurden verschiedene Methoden etabliert. Hier beschreiben wir die Verwendung von Mikrowellen-vermittelten Antikörper-Stripping und von Fluorophor-Tyramid, um Antikörper-Kreuzreaktivität während multiplex-immunostaining auf formalinfixierten Paraffin-eingebetteten Mausnebennierenabschnitten zu blockieren.

Microwaving und Fluorophor-Tyramid für Multiplex-Immunostainierung auf Maus-Adrenals – Verwendung von unkonjugierten Primärantikörpern aus den gleichen Wirtsarten

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

Immunostaining ist weit verbreitet in der biomedizinischen Forschung verwendet, um den Standort eines Proteins von Interesse zu identifizieren. Multiplex-Immunostaining kann mehrere Ziele auf derselben Probe mit verschiedenen primären Antikörpern erkennen. Der Vorteil dieser Methode ist die Verwendung allgemein verfügbarer Puffer zur Eliminierung der Antikörper-Kreuzreaktivität, die eine Immunfärbung mit zwei oder mehr nicht gekennzeichneten Primärantikörpern derselben Wirtsart ermöglicht.Demonstriert wird das Verfahren von Sophia Zheng, einer Doktorandin, und Qiongxia Lyu, einer Gastwissenschaftlerin meines Labors. Vor der Färbung, de-Wachs und rehydrieren formalin-fixierte Paraffin-eingebettete Dias mit fünfminütigen Eintauchen in jede Lösung wie angegeben. Nach dem zweiten destillierten Wassereintauchen die Dias in 275 Milliliter kochender Natriumcitratlösung auf den Boden einer Pipettenkippe mit Deckel legen und die Box acht Minuten lang in eine 700-Watt-Mikrowelle bei 75% Leistung legen.Öffnen Sie am Ende der Behandlung den Deckel und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Dias mit drei fünfminütigen Wärten von frischem PBST in einem Coplin-Glas waschen. Um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, schütteln Sie nach dem letzten Waschen den überschüssigen PBST von jedem Dia und bedecken die Dias mit einem ausreichenden Volumen einer geeigneten Blockierlösung. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer befeuchteten Kammer die überschüssige Blockierlösung von jedem Dia schütteln und 250 Mikroliter des ersten primären Antikörpers von Interesse in jede Probe hinzufügen.Um ein Austrocknen der Proben zu verhindern, können die Dias mit einem Stück Paraffinfolie bedeckt sein. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer die Dias dreimal mit frischem PBST fünf Minuten pro Waschgang waschen. Schütteln Sie den überschüssigen PBST ab und bedecken Sie dann schnell jeden Schlitten mit 250 Mikrolitern einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine einstündige Inkubation in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur.Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischem PBST waschen, wie gezeigt, und 250 Mikroliter frisch zubereiteter Streptavidin-Meerrettichperoxidase zu jeder Rutsche hinzufügen. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Dias dreimal in frischem PBST waschen. Dann schütteln Sie den überschüssigen PBST ab und bedecken Sie jeden Schlitten mit 250 Mikroliter frisch zubereiteter Fluorophor-Tyramid-Lösung.Eine Minute später tauchen Sie die Dias in frisches PBST ein, gefolgt von drei zweiminütigen Wärten in frischem PBST. Nach der letzten Wäsche einige Tropfen einer Eins-zu-Eins-Glyzerin-zu-PBS-Lösung auf die Abschnitte auftragen und durch Fluoreszenzmikroskopie auf das Vorhandensein eines Fluoreszenzsignals überprüfen. Um den ersten Antikörperkomplex abzustreifen, legen Sie die mit Antikörperbeschrifteten beschrifteten Dias mindestens acht Minuten lang in 275 Milliliter kochende Natriumcitratlösung.Am Ende der Behandlung öffnen Sie den Deckel und lassen Sie die Lösung auf Raumtemperatur abkühlen, bevor Sie die Dias dreimal mit PBST für fünf Minuten pro Wäsche waschen. Um für das zweite Zielprotein von Interesse zu färben, nach der Blockierung für unspezifische Bindung wie gezeigt, beschriften Sie jede Probe mit 250 Mikroliter des zweiten primären Antikörpers von Interesse bei vier Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen die Dias dreimal fünf Minuten in frischem PBST pro Wäsche waschen, bevor sie jede Rutsche mit 250 Mikrolitern einer geeigneten Sekundärantikörperlösung für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur bedecken.Am Ende der Inkubation die Dias dreimal in frischem PBST waschen, wie gezeigt, und 250 Mikroliter frisch zubereiteter Streptavidin-Meerrettichperoxidase zu jeder Rutsche hinzufügen. Um das Signal für das zweite Zielprotein von Interesse zu entwickeln, behandeln Sie nach drei PBST-Washes die Dias mit dem fluorophorkonjugierten Tyramid in einem anderen Fluoreszenzspektrum. Um die Tyramidsignalentwicklung zu stoppen, tauchen Sie die Dias in PBST ein.Dann färben Sie die Proben mit einem geeigneten Kernfarbstoff. Für die Bildgebung mittels Fluoreszenzmikroskopie, montieren Sie jeden Kernfarbstoff beschrifteten Schlitten mit einem Tropfen eines geeigneten Montagemediums in einem Deckelschlupf. Verwenden Sie das 4X-Objektiv, um das Gewebe auf der Folie zu lokalisieren.Wechseln Sie zum 10-Fach-Objektiv für die Bildgebung und passen Sie die Belichtungszeit mit der Lichtquelle zwischen 40 und 80 % Intensität auf 100 bis 400 Millisekunden an. Dann erhalten Sie Bilder in jedem Kanal, ohne die Bühne zu bewegen. Die Bilder von jedem Kanal können zu einem Multiplex-Fluoreszenzbild zusammengeführt werden.Ohne Stripping zwischen der ersten und sekundären Antikörperfärbung nimmt die zweite Färbung von Tyrosinhydroxylase Signale vom ersten Zielprotein auf, was zu einer falsch positiven Tyrosinhydroxylase-Färbung führt, z. B. in dieser Probe innerhalb der Nebennierenrinde. Um die Antikörper-Kreuzreaktivität in der Meerrettichperoxidase aus der ersten Immunostainierung zu entfernen, kann ein- und achtminütiges Mikrowellen-vermitteltes Abisolieren durchgeführt werden, was zu sauberen doppelten Färbungsergebnissen führt. In Negativkontrollproben wird kein signifikantes Signal aufgenommen.Acht-Minuten-Stripping im kochenden Citratpuffer ist auch ausreichend, um Antikörper-Kreuzreaktivität für viele Antikörper häufig in der Nebenniere verwendet zu beseitigen. In einigen Fällen ist jedoch immer noch ein schwaches falsch positives Signal nachweisbar, und eine Erhöhung der Mikrowellenbehandlung um 20 Minuten kann den Antikörper-Kreuzreaktivität noch nicht vollständig entfernen. Bei der Fluoreszenz-Bildgebung ist es wichtig, die Stufe beim Umschalten der Kanäle nicht zu bewegen.Es kann jedoch notwendig sein, den Fokus neu zu justieren, um klare Bilder von jedem Kanal zu erhalten. Stellen Sie für jeden Kanal sicher, dass Sie die Belichtungszeit anpassen, um sicherzustellen, dass die Signale ohne überbelichtete Pixel oder Bereiche in den Bildern angemessen belichtet werden. Während des Färbevorgangs ist es wichtig, die Dias von der Entwachsung hydratisiert zu halten und die Dias können mehrmals mit den gleichen Abisolierverfahren entfernt werden, um Multiplexfärbung zu ermöglichen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Herstellung und Verwendung von Lentivirus, um selektiv zu transduzieren Primäre Oligodendrozyten Vorläuferzellen für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Myelinisierung Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Ganzzellige Patch-Clamp Aufnahmen von isolierten primären Epithelzellen aus dem Epididymis

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genetische Technik der primären Maus-Darm-Organoide mit magnetischen Nanopartikel-Transduktion virale Vektoren für gefrorene Schnitte

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

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