Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at

עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R00 HD032636.

1. כתמים עם הנוגדן הראשון
<ol><li>Dewax עווה ומימה מחדש מגלשות ffpe עם 5 דקות מוקצה לכל אחד השלבים הבאים: קסילן או המקבילה ריאגנטים 3x, 100% אתנול 2x, 95% אתנול 1x, 70% אתנול 1x, 50% אתנול 1x, ו מים מזוקקים 2x. הערה: שקופיות צריכות להישאר לחות החל משלב מחדש זה עד להרכבה בשלב הסופי.</li>
	<li>עבור אחזור אנטיגן אופציונלי,...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

כתמים חיסוני מולטיפלקס שימושי כדי לבחון את ההתאמה התאית של שני אנטיגנים או יותר. טכניקה זו בשימוש נרחב נותן תוצאות משכנעות לוקליזציה כאשר נוגדנים העיקרי הם מצועם כתבים שונים (כתמים ישירים). עם זאת, מכתים ישירה בדרך כלל מספק אותות חלשים יותר לעומת כתמים עקיפים, אשר כרוך נוגדנים משניים מצופנ...

בתוך החומרים החיסונית, מכתים ישירות באמצעות נוגדנים ראשוניים מצוים יכול לספק תוצאות אינפורמטיביות. מבלי להשתמש בנוגדנים משניים, שיטת הצביעה הישירה מהווה סיכון נמוך לאותות לוקליזציה מזוייפים מנוגדן לפעילות מחודשת. עם זאת, הכתבים הצוחיים (fluorophore אנזימים) או ביוטין על הנוגדן הראשוני מגביל את השימוש העתידי שלה. לחילופין, חיסוני עקיף מספק בדרך כלל אותות חזקים יותר באמצעות נוגדן ראשוני ללא מעלה עם נוגדן משני מתויג. באופן אידיאלי, נוגדנים ראשוניים בלתי מצובאים בשימוש בבית החומרים החיסוני צריך לבוא ממינים שונים של מארחים כדי להימנע מפני הנוגדנים החוצה פעילות. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים ראשוניים ממינים מארחים שונים אינו תמיד זמין.
מספר שיטות הוקמו כדי לחסל את הסיכון של הנוגדן המשני המגיבים עם נוגדן ראשוני בלתי רצוי. אחת השיטות הנפוצות היא השימוש ב-F (ab) נוגדן monomeric לחסום את כל אפיסקופים הכריכה הנותרים על מתחם הנוגדן הראשוני הראשון לפני הצביעת עם הנוגדן העיקרי השני1. הנוגדן בנוכחות, אשר דומה לרצועה ומחדש של גיליון כתמים מערבי, מסיר את מתחם הנוגדן הקודם ויטראז מבלי להתפשט את התצהיר של מולקולות עיתונאי לזיהוי כגון 3, 3 '-diaminobenzidine (לפרק)2 ו-פלורסנט tyramide התצהיר3. בשיטה זו, מולקולות עיתונאי בצבעים שונים יכולות להציג את התוצאה של השקופית באותה שקופית. הצביעת של מולטיפלקס הינה גם השגה מוחלטת של שכבות הנוגדנים שהופקדו קודם לכן והיישור של תמונות שנרכשו לאחר מכן מנוגדנים אחרים4,5. שיטות אלו נותנות תוצאות אמינות, אם כי לכל שיטה יש מגבלות והיא דורשת הליכים מסובכים או מערכת דימות מיוחדת.
הפרוטוקול הנוכחי מציג את היישום של נוגדן שיטת החשפנות עם שימוש של מאגרים זמינים בדרך כלל. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של מרכיבים מגנטים לשימוש באמצעות משטחי האדרנל (FFPE) עם שני נוגדנים ראשוניים שאינם מתויגים מאותו זן מארח.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

חיסוני משמש נרחב במחקר ביו להראות דפוס הביטוי הסלולרי של חלבון נתון. חיסוני מולטיפלקס מאפשר תיוג באמצעות נוגדנים ראשוניים מרובים. כדי למזער את הנוגדן החוצה פעילות, חיסוני המגה באמצעות מכתים עקיף דורש נוגדנים ראשוניים ללא תווית ממינים מארחים שונים. עם זאת, השילוב המתאים של נוגדנים למינים שונים אינו תמיד זמין. כאן, אנו מתארים שיטה של שימוש בנוגדנים ראשוניים שאינם מסומנים מאותם מינים מארחים (למשל, במקרה זה שני נוגדנים הם מן הארנב) עבור מגנטים למגה-ונציה על formalin-קבוע פרפין-מוטבע (FFPE) עכבר סעיפים האדרנל. שיטה זו משתמשת באותו ההליך וריאגנטים המשמשים בשלב אחזור אנטיגן כדי להסיר את הפעילות של קומפלקס הנוגדן העיקרי שהיה מוכתם בעבר. השקופיות היו מוכתמות הנוגדן הראשוני הראשון באמצעות פרוטוקול חיסוני כללי ואחריו צעד מחייב עם נוגדן משני biotinylated. לאחר מכן, נעשה שימוש בשיטת פיתוח האותות avidin-biotin-peroxidase באמצעות פלואורואופפור-טירומידה כמצע. הפעילות החיסונית של מתחם הנוגדן הראשוני הראשון הוסרו באמצעות טבילה בתמיסה הרתיחה של נתרן ציטראט במשך 8 דקות. התצהיר המולא-מסיסים, שנותר על המדגם, שאיפשר לשקופית להיות מוכתם בנוגדנים ראשוניים אחרים. למרות שיטה זו מבטלת את רוב האותות החיוביים השווא, חלק מהרקע של הנוגדן חוצה פעילות מחודשת עשוי להישאר. אם הדגימות מועשר בביוטין, נוגדן משני peroxidase מעלה עשוי לשמש כדי להחליף את הנוגדן המשני biotinylated כדי למנוע את חיובי שווא מן התאושש ביולוגי אנדוסוגני.

התוצאות התקבלו מדגימות שטופלו עם כל השלבים שתוארו כולל האחזור אנטיגן שלב 1.2. כל הנוגדנים המשניים. ששימשו כאן היו ביולוגיים פלואור שימש לפיתוח אותות מהנוגדנים הראשוניים הראשונים והשניים. תמונות נתפסו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מצויד קוביית FITC (עבור זריחה ירוקה), קוב?...

Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at 

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

מספר שיטות שונות הוקמו עבור חיסוני הקולנוע באמצעות נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח. כאן, אנו מתארים את השימוש של מיקרוגל בתיווך נוגדן בנוכחות של fluorophore-tyramide כדי לחסום נוגדנים לחצות את הנוגדן במהלך כתמים חיסוני במגה-בניין על formalin-קבוע מוטבע האדרנל העכבר סעיפים.

המיקרוגל והפלואורופפור-טירמידה לשימוש בחומרים מדומים על העכבר באמצעות נוגדנים ראשוניים מאותו מין מארח

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

כשל חיסוני נמצא בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי כדי לזהות את המיקום של חלבון מעניין. מולטיפלקס immunostaining יכול לזהות מטרות מרובות על אותה מדגם באמצעות נוגדנים ראשוניים שונים. היתרון של שיטה זו הוא השימוש במאגרים הזמינים בדרך כלל כדי למנוע תגובתיות צולבת נוגדנים המאפשרת כשל חיסוני באמצעות שני נוגדנים ראשוניים או יותר ללא תריס מאותו מין מארח.הדגמת ההליך תהיה סופיה ז'נג, סטודנטית לתואר שני, וצ'יונגשיה ליו, חוקרת אורחת במעבדה שלי. לפני הכתמה, דה-שעווה ו rehydrate פורמלין קבוע פרפין מוטבע שקופיות עם חמש דקות טבילה בכל פתרון כפי שצוין. לאחר טבילת המים המזוקקת השנייה, מניחים את המגלשות ב-275 מיליליטר של תווי נתרן ציטראט רותחים בתחתית קופסת טיפים עם מכסה ומכניסים את התיבה למיקרוגל של 700 ואט בהספק של 75% למשך שמונה דקות.בסוף הטיפול, פתח את המכסה ואפשר לפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שטיפת המגלשות עם שלוש שטיפות של חמש דקות של PBST טרי בצנצנת קופלין. כדי לחסום אתרי איגוד לא ספציפיים, לאחר הכביסה האחרונה לנער את PBST עודף מכל שקופית ולכסות את השקופיות עם נפח מספיק של פתרון חסימה מתאים. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר בתא לח, לנער את פתרון חסימה עודף מכל שקופית ולהוסיף 250 microliters של הנוגדן העיקרי הראשון של עניין לכל מדגם.כדי למנוע התייבשות של דגימות, השקופיות עשויות להיות מכוסות על-ידי פיסת סרט פרפין. לאחר דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס בתא לח, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים עם PBST טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף. לנער את PBST עודף ואז לכסות במהירות כל שקופית עם 250 microliters של פתרון נוגדנים משני מתאים עבור דגירה של שעה אחת בתא לח בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST טרי כפי שהודגם ולהוסיף 250 microliters של חזרת סטרפטבידין טרי peroxidase לכל שקופית. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים PBST טרי. לאחר מכן לנער את PBST עודף לכסות כל שקופית עם 250 microliters של פתרון פלואורופור-טיראמיד מוכן טרי.דקה לאחר מכן, הטביעו את השקופיות ב- PBST טרי ואחריו שלוש שטיפות של שתי דקות ב- PBST טרי. לאחר הכביסה האחרונה, יש למרוח כמה טיפות של פתרון גליצרול-ל-PBS אחד לאחד על החלקים ולבדוק נוכחות של אות פלואורסצנטי על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. כדי להסיר את קומפלקס הנוגדנים הראשון, מניחים את הנוגדן שכותרתו מגלשות ב 275 מיליליטר של פתרון ציטראט נתרן רותח לפחות שמונה דקות כפי שהוכח.בסוף הטיפול, לפתוח את המכסה ולתת את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שטיפת השקופיות שלוש פעמים עם PBST במשך חמש דקות לכל לשטוף. כדי להכתים את חלבון היעד השני של עניין, לאחר חסימה עבור כריכה לא ספציפית כפי שהודגם, תווית כל מדגם עם 250 microliters של הנוגדן העיקרי השני של עניין בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות PBST טרי לכל לשטוף לפני כיסוי כל שקופית עם 250 microliters של פתרון נוגדנים משני מתאים עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר.בסוף הדגירה, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST טרי כפי שהודגם ולהוסיף 250 microliters של חזרת סטרפטבידין טרי peroxidase לכל שקופית. כדי לפתח את האות לחלבון היעד השני של עניין, לאחר שלוש שטיפות PBST, לטפל בשקופיות עם טיראמיד פלואורופור משותף בספקטרום פלואורסצנטי שונה. כדי לעצור את התפתחות האותות של טירמיד, הפוך את השקופיות ל- PBST.ואז להכתים את הדגימות עם צבע גרעיני מתאים. להדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הר כל צבע גרעיני שכותרתו שקופית עם טיפה של מדיום הרכבה מתאים בכיסוי. השתמש במטרה 4X כדי לאתר את הרקמה על השקופית.עבור למטרה 10X להדמיה והתאם את זמן החשיפה ל- 100 עד 400 אלפיות השניה עם מקור האור בין 40% ל- 80%. לאחר מכן השג תמונות בכל ערוץ מבלי להזיז את הבמה. ניתן למזג את התמונות מכל ערוץ כדי ליצור תמונה פלואורסצנטית מרובת-ערוצים.ללא הפשטה בין כתמי הנוגדן הראשון והמשני, הכתם השני של טירוסין הידרוקסילאז יהיה להרים אותות מחלבון היעד הראשון של עניין וכתוצאה מכך הכתמת טירוסין הידרוקסילאז חיובי כוזב, למשל מדגם זה בתוך קליפת יותרת הכליה. כדי להסיר את תגובתיות צולבת הנוגדן peroxidase חזרת מן הכשל החיסוני הראשון, דקה אחת ושמונה דקות מיקרוגל מתווך הפשטה יכול להתבצע וכתוצאה מכך תוצאות כתם כפול נקי. לא נאסף אות משמעותי בדגימות בקרה שליליות.הפשטה של שמונה דקות במאגר ציטראט רותח מספיקה גם כדי למנוע תגובתיות צולבת נוגדנים עבור נוגדנים רבים הנפוצים בלוטת יותרת הכליה. במקרים מסוימים, אות חיובי כוזב חלש עדיין ניתן לגילוי, עם זאת, עלייה של 20 דקות לטיפול במיקרוגל עדיין לא יכול להסיר לחלוטין את תגובתיות צולבת הנוגדן. במהלך הדמיה פלואורסצנטית, חשוב לא להזיז את הבמה בעת החלפת ערוצים.עם זאת, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המיקוד כדי לקבל תמונות ברורות של כל ערוץ. עבור כל ערוץ, הקפד להתאים את זמן החשיפה כדי להבטיח שה אותות ייחשפו כראוי ללא פיקסלים או אזורים שנחשפו יתר על כן בתמונות. במהלך הליך הכתמים, חשוב לשמור על השקופיות hydrated מן de-waxing ואת השקופיות ניתן להסיר באמצעות אותן שיטות הפשטה מספר פעמים כדי לאפשר כתמים מולטיפלקס.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

ייצור ושימוש בLentivirus לתאי סלקטיבי transduce הראשי oligodendrocyte מבשר ל<em&gt; במבחנה</em&gt; מבחני myelination

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Encapsulation אלגינט של תאי גזע pluripotent שימוש נחיר Co-הצירית

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

באמצעות מבודד המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות נשימה microplate תפוקה הגבוה

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

תרבויות יצירה ראשיות פיברובלסטים מרקמות אוזן וזנב עכבר

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

נייד דור גזע מושר מתאי דם באמצעות וירוס Sendai ו צנטריפוגה

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

כל תא תיקון מהדק הקלטות של תאים אפיתל העיקרי מבודדים מן האברדימיס

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

הכנה לרקמה וכתמים של רקמות הגולגולת והעצמות הבלתי מתויטות

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...