Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
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1. पहले एंटीबॉडी के साथ धुंधला
<ol><li>डिवैक्स और रिहाइड्रेट एफएफपीई निम्नलिखित चरणों में से प्रत्येक को आवंटित 5 मिन के साथ स्लाइड: जाइलीन या समकक्ष रिएजेंट्स 3x, 100% इथेनॉल 2x, 95% इथेनॉल 1x, 70% इथेनॉल 1x, 50% इथेनॉल 1x, और ...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग दो या दो से अधिक एंटीजन के सेलुलर कोस्थानीयकरण की जांच करने के लिए उपयोगी है। यह व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक कोस्थानीयकरण के परिणामों को समझाने देती है जब प्र?...

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग में, कंजुगेट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके सीधे धुंधला करने से जानकारीपूर्ण परिणाम प्रदान किए जा सकते हैं। माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किए बिना, प्रत्यक्ष धुंधला विधि में एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से झूठे कोस्थानीयकरण संकेतों का खतरा कम होता है। हालांकि, प्राथमिक एंटीबॉडी पर संयुग्मित रिपोर्टर्स (फ्लोरोफोर, एंजाइम) या बायोटिन अपने भविष्य के उपयोग को सीमित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, अप्रत्यक्ष इम्यूनोस्टेनिंग आमतौर पर एक लेबल वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक अनकॉन्जुजेट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके मजबूत संकेत प्रदान करता है। आदर्श रूप से, एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से बचने के लिए मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग में उपयोग किए जाने वाले अनकॉन्जुजेड प्राथमिक एंटीबॉडी को विभिन्न मेजबान प्रजातियों से आना चाहिए। हालांकि, विभिन्न मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उचित संयोजन हमेशा उपलब्ध नहीं होता है।
एक अवांछित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करने वाले माध्यमिक एंटीबॉडी के जोखिम को खत्म करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं। एक आम विधि दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी1के साथ धुंधला करने से पहले पहले प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर पर किसी भी शेष बाध्यकारी एपीटोप को ब्लॉक करने के लिए एफ (एबी) मोनोमेरिक एंटीबॉडी का उपयोग है। एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग, जो एक पश्चिमी दाग पत्र की पट्टी और पुनर्जांच के समान है, 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 और फ्लोरोसेंट टायरामाइड जमाव3जैसे पता लगाने योग्य रिपोर्टर अणुओं के बयान को अलग किए बिना पहले दाग एंटीबॉडी परिसर को हटा देता है । इस विधि से अलग-अलग रंगों में रिपोर्टर अणु एक ही स्लाइड पर मल्टीप्लेक्स का रिजल्ट दिखा सकते हैं। मल्टीप्लेक्स धुंधला भी एंटीबॉडी की पहले से जमा की गई परतों को पूरी तरह से हटाने और अन्य एंटीबॉडी4,5से बाद में अधिग्रहीत छवियों के संरेखण से प्राप्त किया जा सकता है । ये विधियां सभी विश्वसनीय परिणाम देती हैं, हालांकि प्रत्येक विधि की अपनी सीमाएं होती हैं और या तो जटिल प्रक्रियाओं या एक विशेष इमेजिंग सिस्टम की आवश्यकता होती है।
वर्तमान प्रोटोकॉल आमतौर पर उपलब्ध बफ़र्स के उपयोग के साथ एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग विधि के आवेदन को दर्शाता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक ही मेजबान प्रजातियों से दो अलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) माउस अधिवृक्क वर्गों पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला प्रदर्शन करने के लिए किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

किसी दिए गए प्रोटीन के सेलुलर अभिव्यक्ति पैटर्न को दिखाने के लिए बायोमेडिकल रिसर्च में इम्यूनोस्टेनिंग का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग कई प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबलिंग की अनुमति देता है। एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को कम करने के लिए, अप्रत्यक्ष धुंधला का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग को विभिन्न मेजबान प्रजातियों से अलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है। हालांकि, विभिन्न प्रजातियों एंटीबॉडी का उपयुक्त संयोजन हमेशा उपलब्ध नहीं होता है। यहां, हम एक ही मेजबान प्रजातियों (उदाहरण के लिए, इस मामले में दोनों एंटीबॉडी खरगोश से हैं) से अवेलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन करते हैं, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई) माउस अधिवृक्क वर्गों पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए। यह विधि पहले से दाग प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर की गतिविधि को पट्टी करने के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति चरण में उपयोग की जाने वाली एक ही प्रक्रिया और अभिकर्मकों का उपयोग करती है। स्लाइड एक सामान्य इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटोकॉल का उपयोग करके पहले प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग थे जिसके बाद एक बायोटिनेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक बाध्यकारी कदम था। फिर, एक एविडिन-बायोटिन-पेरोक्सिडेस सिग्नल विकास विधि का उपयोग फ्लोरोफोर-टायरामाइड के साथ सब्सट्रेट के रूप में किया गया था। 8 मिन के लिए एक माइक्रोवेव उबलते सोडियम साइट्रेट समाधान में विसर्जन के माध्यम से पहले प्राथमिक एंटीबॉडी परिसर की इम्यूनोएक्टिविटी छीन ली गई थी। अघुलनशील फ्लोरोफोर-टायरामाइड जमाव नमूने पर बना रहा, जिसने स्लाइड को अन्य प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ दाग दिया। हालांकि यह विधि सबसे झूठे सकारात्मक संकेतों को समाप्त करती है, एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी से कुछ पृष्ठभूमि बनी रह सकती है। यदि नमूनों को एंडोजेनस बायोटिन से समृद्ध किया जाता है, तो बरामद एंडोजेनस बायोटिन से झूठे सकारात्मक से बचने के लिए बायोटिनेटेड माध्यमिक एंटीबॉडी को बदलने के लिए एक पेरोक्सिड्स-कॉन्जुगेटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है।

परिणाम एंटीजन पुनर्प्राप्ति कदम १.२ सहित वर्णित सभी चरणों के साथ इलाज नमूनों से प्राप्त किए गए थे । यहां इस्तेमाल किए जाने वाले सभी सेकेंडरी एंटीबॉडी बायोटिनेटेड थे । फ्लोरोफोर-टायरामाइ?...

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Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

एक ही मेजबान प्रजातियों से प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के लिए कई अलग-अलग तरीके स्थापित किए गए हैं। यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड माउस एड्रेनल सेक्शन पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को ब्लॉक करने के लिए माइक्रोवेव-मध्यस्थता एंटीबॉडी स्ट्रिपिंग और फ्लोरोफोर-टायरामाइड के उपयोग का वर्णन करते हैं।

माउस एड्रेनल पर मल्टीप्लेक्स इम्यूनोस्टेनिंग के लिए माइक्रोवाविंग और फ्लोरोफोर-टायरामाइड − एक ही मेजबान प्रजातियों से अनकॉन्जुज्ड प्राइमरी एंटीबॉडी का उपयोग करना

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

इम्यूनोस्टेटिंग का व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है ताकि ब्याज के प्रोटीन के स्थान की पहचान की जा सके। मल्टीप्लेक्स इम्यूनोदाता विभिन्न प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके एक ही नमूने पर कई लक्ष्यों का पता लगा सकता है। इस विधि का लाभ आमतौर पर उपलब्ध बफ़र्स का उपयोग एक ही मेजबान प्रजातियों से दो या अधिक अवेलेबल प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोस्टेपिंग की अनुमति देने वाली एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को खत्म करने के लिए है।प्रक्रिया का प्रदर्शन सोफिया झेंग, एक स्नातक छात्र, और Qiongxia Lyu, मेरी प्रयोगशाला के एक अतिथि विद्वान होगा । धुंधला होने से पहले, डी-वैक्स और रिहाइड्रेट फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड स्लाइड्स के साथ प्रत्येक समाधान में पांच मिनट के विसर्जन के साथ संकेत दिया गया है। दूसरे आसुत जल विसर्जन के बाद स्लाइड्स को एक पाइपट टिप बॉक्स के नीचे उबलते सोडियम साइट्रेट सॉल्यूशन के २७५ मिलीलीटर में ढक्कन के साथ रखें और बॉक्स को आठ मिनट के लिए ७५% बिजली पर ७०० वाट माइक्रोवेव में रखें ।उपचार के अंत में, ढक्कन खोलें और समाधान को कॉप्लिन जार में ताजा पीबीस्ट के तीन पांच मिनट के वॉश के साथ स्लाइड धोने से पहले कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें। किसी भी गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करने के लिए, अंतिम धोने के बाद प्रत्येक स्लाइड से अतिरिक्त पीबीएएसटी को हिलाएं और स्लाइड को उचित अवरुद्ध समाधान की पर्याप्त मात्रा के साथ कवर करें। एक आर्द्र कक्ष में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के बाद, प्रत्येक स्लाइड से अतिरिक्त अवरुद्ध समाधान हिलाएं और प्रत्येक नमूने में ब्याज की पहली प्राथमिक एंटीबॉडी के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें।नमूनों को सूखने से रोकने के लिए, स्लाइड पैराफिन फिल्म के एक टुकड़े से कवर किया जा सकता है । एक आर्द्र कक्ष में चार डिग्री सेल्सियस पर एक रात इनक्यूबेशन के बाद, प्रति धोने पांच मिनट के लिए ताजा PBST के साथ स्लाइड तीन बार धोते हैं । अतिरिक्त पीबीएएसटी को हिलाएं फिर जल्दी से कमरे के तापमान पर एक आर्द्रीकृत कक्ष में एक घंटे के इनक्यूबेशन के लिए एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 250 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक स्लाइड को कवर करें।इनक्यूबेशन के अंत में, ताजा पीबी एस में तीन बार स्लाइड धोएं और प्रत्येक स्लाइड में ताजा तैयार स्ट्रेप्टाविडिन सहिजन पेरोक्सिडेस के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के बाद, ताजा PBST में तीन बार स्लाइड धोएं । फिर अतिरिक्त पीबीएएसटी को हिलाएं और प्रत्येक स्लाइड को 250 माइक्रोलीटर के साथ कवर करें जो कि ताजा तैयार फ्लोरोफोर-टायरामाइड समाधान है।एक मिनट बाद, ताजा PBST में स्लाइड जलमग्न और ताजा PBST में ३ २ मिनट की धुलाई के बाद । अंतिम धोने के बाद, वर्गों में एक-से-एक ग्लाइस्रोल-टू-पीबीएस समाधान की कुछ बूंदें लगाएं और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा फ्लोरेसेंस सिग्नल की उपस्थिति की जांच करें। पहले एंटीबॉडी परिसर पट्टी करने के लिए, प्रदर्शन के रूप में कम से कम आठ मिनट के लिए उबलते सोडियम साइट्रेट समाधान के 275 मिलीलीटर में एंटीबॉडी लेबल स्लाइड रखें।उपचार के अंत में, ढक्कन खोलें और समाधान को पांच मिनट प्रति धोने के लिए पीबीस्ट के साथ तीन बार स्लाइड धोने से पहले कमरे के तापमान को ठंडा होने दें। ब्याज के दूसरे लक्ष्य प्रोटीन के लिए दाग करने के लिए, प्रदर्शन के रूप में गैर विशिष्ट बाध्यकारी के लिए अवरुद्ध करने के बाद, चार डिग्री सेल्सियस रात में ब्याज की दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी के २५० माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक नमूना लेबल । अगली सुबह, कमरे के तापमान पर एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए एक उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के २५० माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक स्लाइड को कवर करने से पहले ताजा PBST प्रति वॉश में पांच मिनट के लिए तीन बार स्लाइड धोएं ।इनक्यूबेशन के अंत में, ताजा पीबी एस में तीन बार स्लाइड धोएं और प्रत्येक स्लाइड में ताजा तैयार स्ट्रेप्टाविडिन सहिजन पेरोक्सिडेस के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। ब्याज के दूसरे लक्ष्य प्रोटीन के लिए संकेत विकसित करने के लिए, तीन पीबीएसटी वॉश के बाद, एक अलग फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रम में फ्लोरोफोर कंजूसी टायरामाइड के साथ स्लाइड का इलाज करें। टायरमाइड सिग्नल विकास को रोकने के लिए, पीबीएएसटी में स्लाइड जलमग्न करें।फिर एक उपयुक्त परमाणु डाई के साथ नमूनों दाग। फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए, प्रत्येक परमाणु डाई लेबल स्लाइड को कवरस्लिप में एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम की बूंद के साथ माउंट करें। स्लाइड पर ऊतक का पता लगाने के लिए 4X उद्देश्य का उपयोग करें।इमेजिंग के लिए 10X उद्देश्य पर स्विच करें और एक्सपोजर समय को 40 से 80% तीव्रता के बीच प्रकाश स्रोत के साथ 100 से 400 मिलीसेकंड में समायोजित करें। फिर मंच को स्थानांतरित किए बिना प्रत्येक चैनल में छवियां प्राप्त करें। प्रत्येक चैनल से छवियों को एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट छवि बनाने के लिए विलय किया जा सकता है।पहले और माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला के बीच अलग करना के बिना, टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज के लिए दूसरा धुंधला ब्याज के पहले लक्ष्य प्रोटीन से संकेत लेने के परिणामस्वरूप एक झूठी सकारात्मक टायरोसिन हाइड्रोक्सिलेज धुंधला, उदाहरण के लिए अधिवृक्क प्रांतस्था के भीतर इस नमूने में होगा । पहले इम्यूनोस्टेपिंग से सहिजन पेरोक्सिडास में एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को हटाने के लिए, एक मिनट और आठ मिनट के माइक्रोवेव-मध्यस्थता स्ट्रिपिंग को साफ डबल धुंधला परिणाम के परिणामस्वरूप किया जा सकता है। नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में कोई महत्वपूर्ण संकेत नहीं उठाया जाता है।उबलते साइट्रेट बफर में आठ मिनट की स्ट्रिपिंग आमतौर पर अधिवृक्क ग्रंथि में उपयोग किए जाने वाले कई एंटीबॉडी के लिए एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को खत्म करने के लिए भी पर्याप्त है। कुछ मामलों में, एक कमजोर झूठी सकारात्मक संकेत अभी भी पता लगाने योग्य है, हालांकि, और माइक्रोवेव उपचार के लिए 20 मिनट की वृद्धि अभी भी पूरी तरह से एंटीबॉडी क्रॉस-रिएक्टिविटी को दूर नहीं कर सकती है। फ्लोरेसेंस इमेजिंग के दौरान, चैनलों को स्विच करते समय मंच को स्थानांतरित करना महत्वपूर्ण नहीं है।हालांकि, प्रत्येक चैनल की स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए ध्यान को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। प्रत्येक चैनल के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए एक्सपोजर समय को समायोजित करना सुनिश्चित करें कि सिग्नल उचित रूप से छवियों में कोई अधिक उजागर पिक्सेल या क्षेत्रों के साथ उजागर किए गए हैं। धुंधला प्रक्रिया के दौरान, स्लाइड्स को डी-वैक्सिंग से हाइड्रेटेड रखना महत्वपूर्ण है और स्लाइड्स को कई बार एक ही स्ट्रिपिंग तरीकों का उपयोग करके छीन लिया जा सकता है ताकि मल्टीप्लेक्स धुंधला हो सके।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

उत्पादन और चुनिंदा transduce प्राथमिक Oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं को lentivirus के उपयोग के लिए<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Myelination Assays

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एक सह-अक्षीय नोजल का प्रयोग स्टेम सेल की Alginate इनकैप्सुलेशन

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

उच्च throughput के Microplate श्वसन माप के लिए माउस कंकाल की मांसपेशी की कम मात्रा से माइटोकॉन्ड्रिया पृथक का उपयोग

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

माउस कान और पूंछ के ऊतकों से उत्पन्न प्राथमिक तंतुकोशिका संस्कृति

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

रक्त कोशिकाओं से प्रेरित pluripotent स्टेम सेल पीढ़ी सेंडाइ वायरस और centrifugation का उपयोग

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

अध्ययन के लिए प्राथमिक सिलिया प्राथमिक neurosphere संस्कृति का उपयोग करना

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

एपिडीडिमिस से पृथक प्राथमिक उपकला कोशिकाओं के पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

जमे हुए अनुभाग के लिए चुंबकीय नैनोकण ट्रांसडक्शन वायरल वेक्टर्स का उपयोग प्राथमिक माउस आंत्र organoids की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

प्राथमिक मानव कोशिकाओं में सेलुलर वार्धक्य की प्रेरण और मांयता

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

ऊतक तैयारी और माउस Craniofacial ऊतकों और undecalified हड्डी के इम्यूनोस्टेनिंग

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...