Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
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Este trabajo es compatible con NIH R00 HD032636.

1. Manchado con el primer anticuerpo
<ol><li>Dewax y rehidratar los portaobjetos FFPE con 5 min asignados a cada uno de los siguientes pasos: xileno o reactivos equivalentes 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, y agua destilada 2x. NOTA: Las diapositivas deben permanecer húmedas a partir de este paso de rehidratación hasta el montaje en el paso final.</li>
	<li>Para la recuperación opcional de antígenos, coloque las diapositivas en 275 ml de solución de citrato de sodio hirviendo (10...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

La inmunomancha múltiple es útil para examinar la colocalización celular de dos o más antígenos. Esta técnica ampliamente utilizada da resultados convincentes de colocación cuando los anticuerpos primarios se conjugan con diferentes reporteros (tinción directa). Sin embargo, la tinción directa generalmente proporciona señales más débiles en comparación con la tinción indirecta, que implica anticuerpos secundarios conjugados para detectar los anticuerpos primarios. En la tinción indirecta, un resultado de i...

En la inmunomancha múltiple, la tinción directa con anticuerpos primarios conjugados puede proporcionar resultados informativos. Sin el uso de anticuerpos secundarios, el método de tinción directa tiene un bajo riesgo de señales de colocalización falsas debido a la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, los reporteros conjugados (fluoróforo, enzimas) o biotina en el anticuerpo primario limitan su uso futuro. Alternativamente, la inmunomancha indirecta generalmente proporciona señales más fuertes mediante el uso de un anticuerpo primario no conjugado con un anticuerpo secundario etiquetado. Idealmente, los anticuerpos primarios no conjugados utilizados en la inmunomancha múltiple deben provenir de diferentes especies anfitrionas para evitar la reactividad cruzada de anticuerpos. Sin embargo, la combinación adecuada de anticuerpos primarios de diferentes especies anfitrionas no siempre está disponible.
Se han establecido varios métodos para eliminar el riesgo de que el anticuerpo secundario reaccione con un anticuerpo primario no deseado. Un método común es el uso de un anticuerpo monomérico F(ab) para bloquear los epítopos de unión restantes en el primer complejo de anticuerpos primarios antes de manchar con el segundo anticuerpo primario1. El desmontaje de anticuerpos, que es similar a la tira y resondas de una hoja de manchas occidentales, elimina el complejo de anticuerpos previamente teñidos sin eliminar la deposición de moléculas de reportero detectables como el tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB)2 y la deposición de tiramida fluorescente3. Con este método, las moléculas de reportero en diferentes colores pueden mostrar un resultado multiplex en la misma diapositiva. La tinción múltiple también se puede lograr mediante la eliminación completa de las capas de anticuerpos previamente depositadas y la alineación de las imágenes adquiridas posteriormente de otros anticuerpos4,5. Todos estos métodos proporcionan resultados fiables, aunque cada método tiene sus limitaciones y requiere procedimientos complicados o un sistema de imágenes especial.
El presente protocolo muestra la aplicación de un método de desmontaje de anticuerpos con el uso de búferes comúnmente disponibles. Este protocolo se puede utilizar para realizar la tinción inmunofluorescente múltiple x en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fija de formalina (FFPE) con dos anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

La inmunomancha es ampliamente utilizada en la investigación biomédica para mostrar el patrón de expresión celular de una proteína dada. La inmunomancha múltiple permite el etiquetado con múltiples anticuerpos primarios. Para minimizar la reactividad cruzada de anticuerpos, la inmunomancha múltiple mediante tinción indirecta requiere anticuerpos primarios sin etiquetar de diferentes especies huésped. Sin embargo, la combinación adecuada de diferentes especies de anticuerpos no siempre está disponible. Aquí, describimos un método de uso de anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped (por ejemplo, en este caso, ambos anticuerpos son de conejo) para la inmunofluorescencia múltiplex en secciones suprarrenales de ratón con incrustación de parafina fijada en formalina (FFPE). Este método utiliza el mismo procedimiento y reactivos utilizados en el paso de recuperación de antígenos para eliminar la actividad del complejo de anticuerpos primarios previamente manchado. Las diapositivas se teñieron con el primer anticuerpo primario utilizando un protocolo general de inmunomanchado seguido de un paso de unión con un anticuerpo secundario biotinilado. Luego, se utilizó un método de desarrollo de señal de avidina-biotina-peroxidasa con fluoróforo-tiramida como sustrato. La inmunoactividad del primer complejo de anticuerpos primarios se desprendía a través de la inmersión en una solución de citrato de sodio hirviendo por microondas durante 8 min. La deposición insoluble de fluoróforo-tiramida permaneció en la muestra, lo que permitió que la diapositiva se manchase con otros anticuerpos primarios. Aunque este método elimina la mayoría de las señales falsas positivas, puede quedar algún fondo de la reactividad cruzada de anticuerpos. Si las muestras se enriquecen con biotina endógena, se puede utilizar un anticuerpo secundario conjugado por peroxidasa para reemplazar el anticuerpo secundario biotintilado para evitar el falso positivo de la biotina endógena recuperada.

Los resultados se obtuvieron de muestras tratadas con todos los pasos descritos, incluido el paso 1.2 de recuperación de antígenos. Todos los anticuerpos secundarios utilizados aquí fueron biotinylados. El fluoróforo-tiramida se utilizó para desarrollar señales de los anticuerpos primarios primero y segundo. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un cubo FITC (para fluorescencia verde), un cubo TxRED (para Cy3) y un cubo DAPI (para DA...

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Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Se han establecido varios métodos diferentes para la inmunomanchación múltiple utilizando anticuerpos primarios de la misma especie huésped. Aquí, describimos el uso de desmontaje de anticuerpos mediados por microondas y de taquimida de fluoróforo para bloquear la reactividad cruzada de anticuerpos durante la inmunomancha multiplex en secciones suprarrenales de ratón incrustadas en parafina fija sin forfina.

Microwaving y fluorofore-Tyramida para inmunomanchado multiplex en las adrenales del ratón - Uso de anticuerpos primarios no conjugados de la misma especie anfitriona

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

La inmunostaining se utiliza ampliamente en la investigación biomédica para identificar la ubicación de una proteína de interés. La inmunostaining multiplex puede detectar múltiples dianas en la misma muestra utilizando diferentes anticuerpos primarios. El beneficio de este método es el uso de tampones comúnmente disponibles para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos permitiendo la inmunosutención utilizando dos o más anticuerpos primarios sin etiquetar de la misma especie huésped.Demostrando el procedimiento estarán Sophia Zheng, una estudiante de posgrado, y Qiongxia Lyu, una estudiante visitante de mi laboratorio. Antes de la tinción, descerar y rehidratar diapositivas de parafina fijada en formalina con inmersiones de cinco minutos en cada solución como se indica. Después de la segunda inmersión en agua destilada, coloque los portaobjetos en 275 mililitros de solución de citrato sódico hirviendo en la parte inferior de una caja de punta de pipeta con una tapa y coloque la caja en un microondas de 700 vatios a una potencia del 75% durante ocho minutos.Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de lavar los portaobjetos con tres lavados de cinco minutos de PBST fresco en un frasco de Coplin. Para bloquear cualquier sitio de unión no específico, después del último lavado agitar el exceso de PBST de cada diapositiva y cubrir las diapositivas con un volumen suficiente de una solución de bloqueo adecuada. Después de 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada, agitar el exceso de solución de bloqueo de cada diapositiva y añadir 250 microlitros del primer anticuerpo primario de interés para cada muestra.Para evitar que las muestras se sequen, las diapositivas pueden estar cubiertas por un trozo de película de parafina. Después de una incubación durante la noche a cuatro grados centígrados en una cámara humidificada, lave los portaobjetos tres veces con PBST fresco durante cinco minutos por lavado. Agitar el exceso de PBST y luego cubrir rápidamente cada diapositiva con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria apropiada para una incubación de una hora en una cámara humidificada a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado y agregue 250 microlitros de estreptavidina recién preparada peroxidasa de rábano picante a cada tobogán. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco. A continuación, sacuda el exceso de PBST y cubra cada diapositiva con 250 microlitros de solución de fluoróforo-tiromida recién preparada.Un minuto más tarde, sumerja los portaobjetos en PBST fresco seguido de tres lavados de dos minutos en PBST fresco. Después del último lavado, aplique unas gotas de una solución de glicerol a PBS uno a uno en las secciones y compruebe la presencia de una señal de fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia. Para eliminar el primer complejo de anticuerpos, coloque los portaobjetos etiquetados con anticuerpos en 275 mililitros de solución de citrato sódico hirviendo durante al menos ocho minutos como se ha demostrado.Al final del tratamiento, abra la tapa y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente antes de lavar los portaobjetos tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Para manchar para la segunda proteína diana de interés, después del bloqueo para la unión inespecífico como se ha demostrado, etiquete cada muestra con 250 microlitros del segundo anticuerpo primario de interés a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en PBST fresco por lavado antes de cubrir cada diapositiva con 250 microlitros de una solución de anticuerpos secundaria adecuada para una incubación de una hora a temperatura ambiente.Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBST fresco como se ha demostrado y agregue 250 microlitros de estreptavidina recién preparada peroxidasa de rábano picante a cada tobogán. Para desarrollar la señal para la segunda proteína diana de interés, después de tres lavados PBST, tratar los portaobjetos con la tiramida conjugada de fluoróforo en un espectro de fluorescencia diferente. Para detener el desarrollo de la señal de tiromida, sumerja las diapositivas en PBST.A continuación, manche las muestras con un tinte nuclear adecuado. Para obtener imágenes por microscopía de fluorescencia, monte cada diapositiva con etiqueta de tinte nuclear con una gota de un medio de montaje adecuado en un cubreobjetos. Utilice el objetivo 4X para localizar el tejido en la diapositiva.Cambie al objetivo 10X para la toma de imágenes y ajuste el tiempo de exposición a 100 a 400 milisegundos con la fuente de luz entre 40 y 80% de intensidad. A continuación, obtenga imágenes en cada canal sin mover la etapa. Las imágenes de cada canal se pueden combinar para formar una imagen fluorescente multiplex.Sin desprendimiento entre la primera y la tinción secundaria de anticuerpos, la segunda tinción de tirosina hidroxilasa recogerá señales de la primera proteína diana de interés, lo que resulta en una falsa tinción positiva de tirosina hidroxilasa, por ejemplo en esta muestra dentro de la corteza suprarrenal. Para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos en la peroxidasa de rábano picante de la primera inmunosuchación, se puede realizar un des nudista mediado por microondas de un minuto y ocho minutos, lo que resulta en resultados limpios de doble tinción. No se recoge ninguna señal significativa en las muestras de control negativo.El despojo de ocho minutos en el tampón de citrato hirviendo también es suficiente para eliminar la reactividad cruzada de anticuerpos para muchos anticuerpos comúnmente utilizados en la glándula suprarrenal. En algunos casos, una señal falsa positiva débil sigue siendo detectable, sin embargo, y un aumento de 20 minutos para el tratamiento de microondas todavía puede no eliminar completamente la reactividad cruzada del anticuerpo. Durante la toma de imágenes por fluorescencia, es importante no mover el escenario al cambiar de canal.Sin embargo, puede ser necesario reajustar el enfoque para obtener imágenes claras de cada canal. Para cada canal, asegúrese de ajustar el tiempo de exposición para asegurarse de que las señales están expuestas adecuadamente sin píxeles o áreas sobreexpuestas en las imágenes. Durante el procedimiento de tinción, es importante mantener los portaobjetos hidratados de la desceración y Los portaobjetos se pueden despojar utilizando los mismos métodos de desprendimiento varias veces para permitir la tinción multiplex.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

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Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos de mielinización

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Investigación

Biología del Desarrollo

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