Name: microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at

Bu çalışma NIH R00 HD00 HD032636 tarafından desteklenmiştir.

1. İlk Antikor ile Boyama
<ol><li>Aşağıdaki adımların her birine ayrılan 5 dk ile dewax ve rehydrate FFPE slaytlar: ksilen veya eşdeğer reaktifler 3x, 100% etanol 2x, 95% etanol 1x, 70% etanol 1x, 50% etanol 1x, ve distile su 2x. NOT: Slaytlar bu rehidrasyon adımından başlayarak son adıma kadar nemli kalmalıdır.</li>
	<li>İsteğe bağlı antijen alımı için slaytları 8 dk kaynar sodyum sitrat çözeltisinin (10 mM, pH = 6,0) 275 mL'sine yerleştirin. Çözeltinin kaynamasını sağlamak için, sla...

<ol>
	<li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies.">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li><li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel,+simple,+reliable,+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining:+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens.">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li><li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies.">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li><li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization.">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043 (2012).</li><li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections.">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li><li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species.">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li><li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification.">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li><li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype.">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li><li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype.">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li><li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIMPLE:+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method.">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li><li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies.">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li><li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential.">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li><li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieved+endogenous+biotin:+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry.">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li><li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues:+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology.">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li></ol>

Multipleks immünboyama iki veya daha fazla antijenin hücresel kolokalizasyonunu incelemek için yararlıdır. Yaygın olarak kullanılan bu teknik, primer antikorlar farklı muhabirlerle konjuge edildiğinde (doğrudan boyama) ikna edici kolokalizasyon sonuçları verir. Ancak, doğrudan boyama genellikle birincil antikorları tespit etmek için konjuge ikincil antikorlar içeren dolaylı boyama ile karşılaştırıldığında zayıf sinyaller sağlar. Dolaylı boyamada, yüksek kaliteli multipleks immünboyama sonucu...

Multipleks immünboyama, konjuge primer antikorlar kullanılarak doğrudan boyama bilgilendirici sonuçlar sağlayabilir. Sekonder antikorlar kullanmadan, doğrudan boyama yöntemi antikor çapraz reaktivite yanlış kolokalizasyon sinyalleri düşük bir risk vardır. Ancak, konjuge muhabirler (florofor, enzimler) veya primer antikor üzerinde biotin gelecekteki kullanımını sınırlamak. Alternatif olarak, dolaylı immünboyama genellikle etiketli ikincil antikor ile konjuge olmayan bir primer antikor kullanarak güçlü sinyaller sağlar. İdeal olarak, multipleks immünboyama kullanılan konjuge olmayan primer antikorlar antikor çapraz reaktivite önlemek için farklı konak türlerden gelmelidir. Ancak, farklı konak türlerden birincil antikorların uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir.
İstenmeyen bir primer antikorile tepki gösteren sekonder antikor riskini ortadan kaldırmak için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Yaygın yöntemlerden biri, ikinci primer antikor1ile boyama dan önce ilk primer antikor kompleksinde kalan bağlayıcı epitopları engellemek için F(ab) monomerik antikor kullanımıdır. Batı leke tabakasının şerit ve reprobuna benzeyen antikor sıyırma, 3,3'-diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)2 ve floresan tiramidbirikimi3 gibi saptanabilir muhabir moleküllerin birikimini sıyırma olmadan daha önce lekeli antikor kompleksini kaldırır. Bu yöntemle, farklı renklerdeki muhabir moleküller aynı slaytta çok katlı bir sonuç gösterebilir. Multipleks boyama da antikorların daha önce birikmiş katmanları nın tamamen kaldırılması ve diğer antikorlardan sonradan edinilen görüntülerin hizalanması ile elde edilebilir4,5. Her yöntemin kendi sınırlamaları olmasına ve karmaşık prosedürler veya özel bir görüntüleme sistemi gerektirmesine rağmen, bu yöntemlerin tümü güvenilir sonuçlar verir.
Bu protokol, yaygın olarak kullanılan arabelleklerin kullanımı yla birlikte bir antikor sıyırma yönteminin uygulanmasını gösterir. Bu protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde aynı konak türden iki etiketsiz birincil antikor içeren çok katlı immünoresan boyama yapmak için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-mouse</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>715-066-151</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>711-066-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>422801</td>
			<td>2 &#956;g/mL in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>Revolve 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-030-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven, 700W</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>JEM3072DH1BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CYP2F2</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-374540</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-TH</td>
			<td>Santa Cruz,</td>
			<td>SC-25269</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td>2% serum in PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-20&#945;HSD</td>
			<td>Kerafast,</td>
			<td>EB4002</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-3&#946;HSD</td>
			<td>TransGenic,</td>
			<td>KO607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-TH</td>
			<td>NOVUS,</td>
			<td>NB300-109</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-&#946;-catenin</td>
			<td>Abcam,</td>
			<td>ab32572</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td>
			<td>JacksonImmuno</td>
			<td>016-303-084</td>
			<td>1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Cy3 Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT704B001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA Fluorescein Tyramide</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>SAT701001EA</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microwaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse adrenals &#8722; using unconjugated primary antibodies from the same host species

Immunostaining yaygın olarak belirli bir proteinin hücresel ifade deseni göstermek için biyomedikal araştırmalarda kullanılır. Multipleks immünboyama birden fazla primer antikor kullanarak etiketleme sağlar. Antikor çapraz reaktivitesini en aza indirmek için, dolaylı boyama kullanarak multipleks immünboyama farklı konak türlerinden etiketsiz birincil antikorlar gerektirir. Ancak, farklı tür antikorlarının uygun kombinasyonu her zaman mevcut değildir. Burada, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) fare adrenal kesitlerinde multipleks immünofluoresans için aynı konak türlerden (örneğin, bu durumda her iki antikor da tavşandan) etiketlenmemiş birincil antikorların kullanılması nın bir yöntemini tanımlıyoruz. Bu yöntem, daha önce lekelenmiş primer antikor kompleksinin aktivitesini siliklemek için antijen alma adımında kullanılan aynı prosedürü ve reaktifleri kullanır. Slaytlar genel bir immünboyama protokolü kullanılarak ilk primer antikor ile boyandı ve ardından biyotinylated sekonder antikor ile bağlayıcı bir adım atıldı. Daha sonra, bir avidin-biotin-peroksidaz sinyal geliştirme yöntemi substrat olarak florofor-tiramid ile kullanılmıştır. İlk primer antikor kompleksinin immünaktivitesi mikrodalgada kaynayan sodyum sitrat çözeltisi ile 8 dakika boyunca daldırma yoluyla çıkarıldı. Çözünmez florofor-tiramid birikimi, slayt diğer primer antikorlar ile lekeli izin örnek üzerinde kaldı. Bu yöntem çoğu yanlış pozitif sinyalleri ortadan kaldırsa da, antikor çapraz reaktivite bazı arka plan kalabilir. Örnekler endojen biotin ile zenginleştirilmiş ise, bir peroksidaz konjuge sekonder antikor kurtarılan endojen biotin yanlış pozitif önlemek için biyotinylated ikincil antikor yerine kullanılabilir.

Sonuçlar, antijen alma adımı 1.2 de dahil olmak üzere açıklanan tüm adımlarla tedavi edilen örneklerden elde edildi. Burada kullanılan tüm sekonder antikorlar biyotinylated edildi. Florofor-tiramid birinci ve ikinci primer antikorlardan gelen sinyalleri geliştirmek için kullanıldı. Görüntüler, FITC küpü (yeşil floresan için), TxRED küpü (Cy3 için) ve DAPI küpü (DAPI için) ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak çekildi.
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals Ã¢Ë†' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species at 

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals ÃƒÂ¢Ã‹â€ ' Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Aynı konak türün primer antikorları kullanılarak multipleks immünboyama için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur. Burada, formalin-sabit parafin gömülü fare adrenal bölümlerinde multipleks immünboyama sırasında antikor çapraz reaktivitesini engellemek için mikrodalga aracılı antikor sıyırma ve florofor-tiramid kullanımını açıklıyoruz.

Fare Adrenallerinde Çokkatlı İmmünoboyama için Mikrowaving ve Florosofor-Tyramide - Aynı Konak Türlerinden Konjuge Olmayan Birincil Antikorların Kullanılması

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

Immunostaining yaygın ilgi bir proteinin yerini belirlemek için biyomedikal araştırmalarda kullanılır. Multipleks immünboyama farklı primer antikorlar kullanarak aynı örnek üzerinde birden fazla hedef tespit edebilirsiniz. Bu yöntemin yararı, aynı konak türlerden iki veya daha fazla etiketlenmemiş birincil antikor kullanarak immünboyama sağlayan antikor çapraz reaktivite ortadan kaldırmak için yaygın olarak kullanılabilir tamponlar kullanılmasıdır.Prosedürü gösteren Sophia Zheng, yüksek lisans öğrencisi ve Qiongxia Lyu, benim laboratuvar misafir bilim adamı olacaktır. Boyama önce, de-wax ve rehydrate formalin-sabit parafin gömülü slaytlar her çözeltide beş dakikalık daldırma ile belirtildiği gibi. İkinci distile su daldırma sonra, bir kapak ile bir pipet ucu kutusunun altına 275 mililitre kaynar sodyum sitrat çözeltisi slaytlar yerleştirin ve 8 dakika boyunca% 75 güç 700 watt mikrodalga içine kutu yerleştirin.Tedavinin sonunda, kapağı açın ve bir Coplin kavanozda taze PBST üç beş dakikalık yıkar ile slaytlar yıkamadan önce oda sıcaklığına çözelti soğumasını bekleyin. Spesifik olmayan bağlama sitelerini engellemek için, son yıkamadan sonra her slayttaki fazla PBST'yi sallayın ve slaytları uygun bir engelleme çözeltisinin yeterli hacmiyle kapatın. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 30 dakika kaldıktan sonra, her slayttan fazla engelleme çözeltisini sallayın ve her numuneye ilgi çekici ilk birincil antikordan 250 mikrolitre ekleyin.Örneklerin kurumasını önlemek için, slaytlar bir parça parafin film le kaplanabilir. Nemlendirilmiş bir odada dört derece santigrat bir gecede kuluçka sonra, yıkama başına beş dakika taze PBST ile slaytlar üç kez yıkayın. Fazla PBST'yi silkeleyin, oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir odada bir saatlik kuluçka için her slaytı 250 mikrolitre uygun ikincil antikor çözeltisi ile hızlı bir şekilde kapatın.Kuluçka sonunda, gösterdiği gibi taze PBST slaytlar üç kez yıkayın ve her slayt taze hazırlanmış streptavidin horseradish peroksidaz 250 mikrolitre ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, taze PBST slaytlar üç kez yıkayın. Sonra aşırı PBST kapalı sallamak ve taze hazırlanmış florofor-tiramid çözeltisi 250 mikrolitre ile her slayt kapağı.Bir dakika sonra, taze PBST slaytlar batırın taze PBST üç iki dakikalık yıkayıyor ardından taze PBST. Son yıkamadan sonra, bölümlere bire bir gliserol-pBS çözeltisi birkaç damla uygulayın ve floresan mikroskopi ile bir floresan sinyal varlığını kontrol edin. İlk antikor kompleksini soymak için, antikor etiketli slaytları 275 mililitre kaynar sodyum sitrat çözeltisine en az sekiz dakika yerleştirin.Tedavinin sonunda, kapağı açın ve kaydırma başına beş dakika PBST ile üç kez yıkamadan önce çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. İkinci hedef proteini lekelemek için, gösterildiği gibi nonspesifik ciltleme için bloke sonra, her örnek ile etiket 250 mikrolitre ilgi ikinci birincil antikor bir gecede. Ertesi sabah, oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için uygun bir ikincil antikor çözeltisi 250 mikrolitre ile her slayt kapsayan önce yıkama başına taze PBST beş dakika boyunca slaytlar üç kez yıkayın.Kuluçka sonunda, gösterdiği gibi taze PBST slaytlar üç kez yıkayın ve her slayt taze hazırlanmış streptavidin horseradish peroksidaz 250 mikrolitre ekleyin. Üç PBST yıkama sonra, ilgi ikinci hedef protein için sinyal geliştirmek için, farklı bir floresan spektrumda florofor konjuge tiramid ile slaytlar tedavi. Tiramid sinyal gelişimini durdurmak için slaytları PBST'ye batırın.Sonra uygun bir nükleer boya ile örnekleri leke. Floresan mikroskobu ile görüntüleme için, bir coverslip uygun bir montaj ortamı bir damla ile etiketli slayt her nükleer boya monte. Slayttaki dokuyu bulmak için 4X hedefini kullanın.Görüntüleme için 10X hedefine geçin ve ışık kaynağı %40 ila %80 yoğunlukta pozlama süresini 100 ila 400 milisaniyeye ayarlayın. Sonra sahne hareket etmeden her kanalda görüntüleri elde. Her kanaldan görüntüler çokluk floresan görüntü oluşturmak için birleştirilebilir.Birinci ve sekonder antikor boyama arasında sıyırma olmadan, tirozin hidroksilaz için ikinci boyama yanlış pozitif tirozin hidroksilaz boyama sonuçlanan ilgi ilk hedef protein sinyalleri alacak, örneğin adrenal korteks içinde bu örnekte. İlk immünboyama gelen horseradish peroksidaz antikor çapraz reaktivite kaldırmak için, bir dakika ve sekiz dakikalık mikrodalga aracılı sıyırma temiz çift boyama sonuçları ile sonuçlanan yapılabilir. Negatif kontrol örneklerinde anlamlı bir sinyal alınmaz.Kaynama sitrat tampon sekiz dakikalık sıyırma da yaygın adrenal bezi kullanılan birçok antikorlar için antikor çapraz reaktivite ortadan kaldırmak için yeterlidir. Bazı durumlarda, zayıf bir yanlış pozitif sinyal hala tespit edilebilir, ancak, ve mikrodalga tedavisi için 20 dakikalık bir artış hala tamamen antikor çapraz reaktivite kaldırmak olmayabilir. Floresan görüntüleme sırasında, kanal değiştirirken sahneyi hareket ettirmemek önemlidir.Ancak, her kanalın net görüntülerini elde etmek için odağı yeniden yeniden düzenlemek gerekebilir. Her kanal için, sinyallerin görüntülerde aşırı pozlanmış piksel veya alan olmadan uygun şekilde açığa alındığından emin olmak için pozlama süresini ayarladığından emin olun. Boyama işlemi sırasında, slaytlar de-waxing sulu tutmak önemlidir ve slaytlar multipleks boyama izin vermek için aynı sıyırma yöntemleri birkaç kez kullanılarak elimden alınabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Üretim ve seçici transduce İlköğretim Oligodendrosit Öncü Hücreler için Lentivirüste kullanımı için<em&gt; İn Vitro</em&gt; Myelinasyon Tahliller

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Bir Koaksiyel Memesini kullanma Pluripotent Kök Hücre Aljinat Encapsulation

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Yüksek verim Mikroplate Solunum Ölçümler Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen kondriyayı İzole kullanma

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings of Isolated Primary Epithelial Cells from the Epididymis

Epididimden İzole Edilmiş Primer Epitelyal Hücrelerin Tüm Hücreli Yama-Kelepçesi Kayıtları

The epididymis is an essential organ for sperm maturation and reproductive health. The epididymal epithelium consists of intricately connected cell types ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...