Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة الوطنية للسرطان المرحلة الأولى SBIR (HHSN26120700015C) وP01CA098912.

تم الحصول على أنسجة الورم بموافقة المريض ووفقا لبروتوكول مجلس المراجعة المؤسسية المعتمد (IRB). تم زرع Xenografts ، ونمت ، وحصد وفقا لاتفاقية رعاية الحيوان المؤسسية المقبولة واستخدامها (IACUC) بروتوكول.
ملاحظة: كل العمل هو أن يتم تنفيذها في مجلس الوزراء سلامة البيولوجية المعقمة للحفا...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

هنا نحن وصف طريقة لمعالجة واستزراع خلايا الورم القابلة للحياة PDX المستمدة في نظام ثقافة 3D عالية الإنتاجية. في حين أن هذا البروتوكول يستخدم أنسجة PCa PDX ، فهو فعال بنفس القدر للأورام الأخرى المشتقة من الظهارية. تختلف خصائص الورم بين خطوط PDX الفردية حتى داخل نفس النسيج الأصلي (البروستاتا والثد?...

على مدى العقد الماضي، وقد أظهرت مجال أبحاث السرطان الحماس المتجدد لxenografts المستمدة من المريض (PDXs) كأداة لتقييم الاعتماد على مسار الخلايا السرطانية وحساسية المخدرات1. يتم تأسيس نماذج PDX الأكثر شيوعًا عن طريق زراعة الخلايا السرطانية البشرية تحت الجلد أو العظام — وهي جزء من الورم ، أو مجموعة من الخلايا المتفرعة عن الورم المنفصلة ، أو عينة من الخلايا السرطانية المنتشرة المعزولة (CTCs) - في مضيف القوارض. إذا كان الورم "اتخاذ" ناجحا، سوف تتكاثر خلايا xenograft، والأوعية الدموية، والتفاعل خلاف ذلك مع الأنسجة المضيفة لخلق ورم، والتي يمكن حصادها في الحجم الأمثل، وتقسيمها، وإعادة زرعها في المضيفين الآخرين. من بين مزاياها العديدة كنظام نموذجي ، تحتفظ PDXs عادة بجزء كبير من عدم تجانس خلايا الورم الأصلية وتمكن من تقييم المسارات البشرية الخاصة واستجابات الخلايا2،3. في سياق vivo تمكن التفاعل الورم مع الأوعية الدموية وغيرها من السترمة المجاورة وتلخص خصائص الأنسجة مثل ديناميات انتشار المخدرات، والتوتر الأكسجين، وتأثير المصفوفة خارج الخلية التي تؤثر بيولوجيا وميكانيكيا تطور الورم. الجانب السلبي من PDXs هو اعتمادها على مضيف القوارض ، سواء لتوسيع الورم وفي نهاية المطاف لاختبار الفرضية. لأن العديد من PDXs لا يمكن أن تتكيف مع الثقافة التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) على زراعة الأنسجة البوليسترين دون أن تفقد العديد من خصائصها المرغوبة ، كان هناك الحد الأدنى من الأرضية الوسطى للباحثين بين هذه الطريقة التي تسيطر عليها نسبيا في المختبر ، والزيادة الكبيرة في النفقات والمرافق ومتطلبات الوقت لاستخدام في الطب البصري PDX.
لقد وصفنا نماذج متعددة في المختبر التي تنفذ ثقافة الخلايا 3D داخل مصفوفة داعمة، وتوسعت مؤخرا أن العمل لإثبات ثقافة الجسم الحي السابق من سرطان البروستاتا متعددة (PCa) المشتقة PDXs، سواء وحدها وفي الثقافة المشتركة مع الخلايا الليفية المشتقة من نخاع العظم4،5. حمض الهيالوروني (HA) القائم على المصفوفات hydrogel توفير الدعم للتخصيص والبيولوجيا ذات الصلة لكلا النوعين الخلية، مع السيطرة السهل على خصائص هيدروجيل والوضوح البصري للتصوير من خلال عمق هيدروجيل6.
أنسجة الورم PDX ناضجة تضم خليط متغير من الخلايا السرطانية البشرية غير متجانسة والماوس ستروما (الخلايا الليفية، والخلايا البطانية، الخ). لدراسة مساهمات محددة من نوع الخلية في تطور الورم في المختبر ، يمكن أن يكون من المفيد فصل الأورام ، وفصل مجموعات الخلايا ، ودمجها تجريبيًا بطريقة منظمة لتشريح مسارات التواصل بين الخلايا. مجموعات الخلايا المختلطة داخل هضم الأنسجة لديها توافق التفاضلية مع ظروف ثقافة محددة. على سبيل المثال، يستلزم قابلية البقاء الليفية المرتبطة بالورم إما الالتزام السطحي أو مصفوفات ثلاثية الأبعاد وظيفية مع أربطة integrin، في حين أن خلايا PDX المشتقة من الظهارية لا تحتوي عادة على هذه المتطلبات، بدلاً من ذلك تفضل تفاعلات الخلايا الخلية. يمكن استغلال هذه الاختلافات لتحقيق فصل فعال من خلايا PDX من الخلايا الماوس اللوّث stromal. تسمح ثقافة الدوران في هضم الأنسجة بتمسك الخلايا الضمية بسطح ثقافة الأنسجة بينما تدفع التصاقات الخلايا الخلوية خلايا PDX العائمة فوق سطح الثقافة الدوارة لتشكيل مجموعات متعددة الخلايا في المابير في 24−48 ساعة. وتختلف الخصائص المحددة لهذه المجموعات مع PDX (مثل، مجموعات كبيرة، ضيقة، كروية للغاية أو مجاميع أصغر وفكها تشبه عناقيد العنب)، ولكنها عادة ما تكون ذات أحجام ذات صلة بيولوجيا (قطر 50-250 ميكرومتر)، كافية لتقييم التفاعلات الخلوية التي تعتمد على الاتصالات بين الخلايا.
يؤدي استرجاع الورم ومعالجته إلى درجة ما من موت الخلايا الجانبية، إما بسبب الأضرار قصيرة الأجل الناجمة عن الاضطراب الميكانيكي/الأنزيمي، أو عدم التوافق على المدى الطويل بين السكان الفرعيين وظروف الثقافة المختارة. على الرغم من فائدة ثقافة التناوب كفصل كبير أولي ، يتم نقل الخلايا الميتة أو المحتضرة لا محالة مع مجموعات PDX ويمكن أن تؤثر على الثقافة الناتجة. هذه الخلايا الميتة غالباً ما تكون خلايا PDX الفردية التي لم يتم دمجها في كتلة، الماوس الخلايا الليفية الليفية الليفية الضمائية التي لا يمكن البقاء على قيد الحياة في ظروف الثقافة المحددة، أو خلايا بطانة الرحم الهشة بشكل خاص. ويمكن لهذه الخلايا المحتضرة أن تؤثر على النتائج التجريبية من "الناجين" ويمكن أن تؤثر بشكل كبير على القياس الكمي، على سبيل المثال، عن طريق مقايسات فحص قابلية البقاء القائمة على الصور الفلورية. لتحسين اختيار خلايا PDX الحية من هذه الطريقة، قمنا بتكييف طرق الطرد المركزي مع خطوات الكثافة لإزالة الخلايا الميتة /المحتضرة الفردية بسهولة من مخاليط PDX والاحتفاظ بمجموعات متعددة الخلايا حية في الغالب.
لتعزيز دراسة الناتجة PDX المستمدة من المجموعات في الثقافة 3D، استخدمنا منصة ثقافة الضخ microfluidics القائم على، OrganoPlate (الشكل 1)، وهو جهاز عالية الإنتاجية على رقاقة منصة تسمح للثقافة في وقت واحد تصل إلى 96 الفردية الم perfused ، 3D الثقافات على 384 جيدا microtiter لوحة القاعدة(الشكل 1A)7،8. في لوحة microfluidic 2 حارة، يتم توصيل شريحة نسيج واحد من قبل اثنين من القنوات microfluidic(الشكل 1B، هلام قناة: الأحمر، قناة التسريب: الأزرق) التي تمتد أربعة آبار في صف واحد. يتم فصل القناتين microfluidic من قبل سلسلة من البلاستيك قصيرة تسمى Phaseguide الذي يمنع تجاوز قناة واحدة في قناة جارتها المجاورة ، ويسمح في وقت واحد لواجهة خالية من الغشاء بين محتويات هلام و perfusion قناة9. لأن الجزء السفلي من لوحة microfluidic يتكون من الزجاج المجهر الصف، يمكن الاطلاع على الثقافات في نافذة المراقبة من خلال الجزء السفلي من لوحة مع مجهر قياسي أو الآلي. يتم تأسيس Perfusion في لوحة microfluidic مع الروك برمجة، وذلك باستخدام الجاذبية لدفع وسائل الإعلام من خلال قنوات microfluidic، بين آبار الخزان (الشكل 1C). يحاكي تدفق القذف بشكل أدق يلخص البيئة الدقيقة للورم من الثقافة الساكنة ، مما يسمح بدمج إجهاد القص وتعزيز توزيع الغازات والمواد المغذية. وقد سبق وصف فوائد الحفاظ على ثقافة الخلايا السرطانية الم PERFUSED في لوحة microfluidic كما أظهرت الثقافات سرطان الثدي perfused القدرة على البقاء الأمثل بالمقارنة مع ثقافة 3D ثابت من نفس الخلايا7.
ويصف هذا التقرير طريقة للانفروج المركزي للكثافة المكيفة لعزل مجموعات PDX الحية متعددة الخلايا، ويبين فائدتها في إنشاء ثقافات PDX ثلاثية الأبعاد داخل ألواح الفلورويديك القابلة للانحلال. ونظرًا لأن عددًا متزايدًا من مختبرات الأبحاث يبحث عن طرق لتسهيل استخدام PDX ، فإننا نتوقع أن تكون البروتوكولات المعروضة هنا ذات فائدة فورية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

xenografts المستمدة من المريض (PDX) ، التي تم إنشاؤها عندما يتم نقش أنسجة ورم المريض مُجَذَّبًا مباشرةً إلى فئران مُنَاعِدة ، تظل مستقرة بيولوجيًا ، وبالتالي الحفاظ على الميزات الجزيئية والوراثية والهظرية ، وكذلك عدم تجانس الورم الأصلي. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه النماذج لإجراء العديد من التجارب ، بما في ذلك فحص المخدرات ، هو أمر باهظ سواء من حيث التكلفة والوقت. تُنظر إلى أنظمة الاستزراع ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع على أنها منصات تحتفظ فيها الخلايا السرطانية بسلامتها البيولوجية من خلال التفاعلات الكيميائية الحيوية، والمورفولوجيا، والهندسة المعمارية. فريقنا لديه خبرة واسعة في زراعة خلايا PDX في المختبر باستخدام مصفوفات ثلاثية الأبعاد مكونة من حمض الهيالورونيكس (HA). من أجل فصل الخلايا الليفية الليفية الماوس الخلايا الضموية المرتبطة PDXs، ونحن نستخدم ثقافة التناوب، حيث الخلايا القوية تلتزم سطح الأنسجة ثقافة معالجة لوحات بينما خلايا الورم PDX تفكك تعويم والنفس المنتسبين في مجموعات متعددة الخلايا. تطفو أيضا في عظمى هي واحدة، وخلايا ميتة في كثير من الأحيان، والتي تشكل تحديا في جمع مجموعات PDX قابلة للحياة لتغليف المصب في الهيدروجيلز لثقافة الخلية 3D. من أجل فصل هذه الخلايا الفردية من مجموعات الخلايا الحية، لدينا استخدام كثافة الخطوة الطرد المركزي. البروتوكول الموصوف هنا يسمح باستنفاد الخلايا الفردية غير القابلة للحياة من السكان الأصحاء من مجموعات الخلايا التي سيتم استخدامها لمزيد من التجارب في المختبر. في دراساتنا، ونحن دمج الثقافات 3D في لوحات microfluidic التي تسمح لضخ وسائل الإعلام أثناء الثقافة. بعد تقييم الثقافات الناتجة باستخدام مقايسة قابلة للتطبيق تستند إلى الصور الفلورية للخلايا النقية مقابل الخلايا غير النقية ، تظهر نتائجنا أن خطوة الفصل الإضافية هذه خفضت بشكل كبير عدد الخلايا غير القابلة للحياة من ثقافاتنا.

تم إعداد الروك perfusion للبرمجة في حاضنة ثقافة الخلية المياه جاكيد القياسية، وتم إعداد لوحات microfluidic اثنين حارة في مجلس الوزراء السلامة الحيوية القياسية للتحميل (الشكل 1). تم توسيع ورم PDX MDA-PCA-118b في الجسم الحي، وحصد عندما كان قد وصل إلى أقصى حجم، وفك كما هو موضح في قسم البروتوكول ...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

يوضح هذا البروتوكول أساليب تمكين الثقافة الموسعة في المختبر من xenografts المستمدة من المريض (PDX). خطوة واحدة يعزز القدرة على البقاء العام للثقافات العنقودية متعددة الخلايا في الهيدروجيل ثلاثية الأبعاد، من خلال إزالة مباشرة من الخلايا الفردية غير قابلة للحياة. خطوة ثانوية توضح أفضل الممارسات لثقافة PDX في منصة microfluidic perfused.

تعزيز قابلية البقاء لثقافات الهيدروجيل Ex vivo 3D من Xenografts المستمدة من المريض في منصة Microfluidic Perfused

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

تحسين أساليب الثقافة لعينات الورم المستمدة من المريض هي ذات أهمية حاسمة كما يتحرك الحقل بعيدا عن استخدام خطوط الخلايا التقليدية. يسمح هذا البروتوكول للثقافة في المختبر من الخلايا السرطانية المستمدة من المريض في منصة قابلة للإنتاجية عالية وعالية المحتوى الفحص، على عكس نماذج سرطان الجسم الحي. منصة دمج PDXs يسمح لنا لتقييم أنظمة أكثر غير متجانسة تعكس الأورام الأصلية.وهذا قد يؤدي إلى نظرة ثاقبة آليات المخدرات ويسمح للفحص أسرع المخدرات. ويمكن توسيع هذه الطريقة من خلال دمج ستروما، البطين، والخلايا المناعية. هذه الثقافات المشتركة يمكن أن تكون أكثر تعبيرا عن السكان الأورام الأصلية والهندسة المعمارية.ممارسة تحميل لوحات microfluidic مع خطوط الخلايا الموسعة بسهولة لتصبح كفاءة عالية قبل التحول إلى خلايا أكثر قيمة مثل PDXs. محاذاة خلال لوحة الاستغناء يؤثر على النجاح بشكل كبير، ويمكن بسهولة مظاهرة بصرية نقل هذا المفهوم. للبدء، نقل أنسجة الورم إلى أنبوب مخروطي مخروطي معقم يزن ما قبل الوزن 50 ملليلتر.شطف ست مرات مع 30 ملليلتر من برنامج تلفزيوني عقيم لإزالة الدم والملوثات. إزالة أكبر قدر ممكن من السائل، وزن أنسجة الورم. نقل أنسجة الورم إلى طبق زراعة الأنسجة المستديرة 60 ملليمترًا ، واستخدم شفرة حلاقة معقمة أو مشرطًا لتلكمه إلى قطع من ملليمتر واحد.إضافة خمسة ملليلتر من PDX معالجة المتوسطة لجمع الطين الورم. إضافة خمسة ملليلتر من محلول انزيم الانفصام لجمع ملاط الورم. شطف طبق الثقافة مع خمسة ملليلتر آخر من محلول انزيم الانفصام.ثم إضافة خمسة ملليلتر من PDX معالجة المتوسطة. احتضان 20 دقيقة في 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. في منتصف الوقت الحضانة، دوامة الأنبوب بلطف.بعد الحضانة، ماصة صعودا وهبوطا بلطف مع ماصة المصلية لتفريق كتل. ضع مصفاة خلايا 70 ميكرون فوق أنبوب جديد معقمة 50 ملليلتر، وتصفية الخلايا. ثم الطرد المركزي في 1، 200 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين ل بيليه الخلايا.إزالة افرنح و resuspend في 2-3 ملليلتر من وسط ثقافة PDX. عد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. استخدم هذا الجدول لتقدير العدد المطلوب من الخلايا المشتقة من PDX المرتبطة المطلوبة لتحقيق كثافة الخلايا المطلوبة لكل شريحة.لوحة واحدة إلى مرتين 10 مرات إلى الخلايا الست في خمسة ملليلتر من ثقافة PDX المتوسطة في بئر من ستة بئر لوحة ثقافة الأنسجة. احتضان لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، و 95٪ الرطوبة مع اهتزاز لطيف في 50 إلى 55 دورة في الدقيقة لتعزيز تشكيل الكتلة. بعد تشكيل المجموعات، انتقل إلى الطرد المركزي.أولا إعداد 20 ملليلتر من 100٪ حل التدرج كثافة عن طريق خلط دقيق 18 ملليلتر من حل التدرّج المركزي الكثافة مع مليلترين من HBSS معقم 10X في أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر. تخفيف هذا الحل 100٪ مع 1X HBSS عقيمة لجعل 10 ملليلتر كل من 20٪ 30٪ 40٪ و 55٪ حلول التدرج الكثافة. إضافة ثلاثة ملليلتر من 55٪ حل التدرج كثافة إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.عقد الأنبوب في زاوية، الاستغناء ببطء ثلاثة ملليلتر من 40٪ حل التدرج كثافة على الجانب الزاوية من الأنبوب وعلى رأس طبقة 55٪. كرر مع حل التدرج الكثافة 30٪. ثم جمع افرائب من الثقافات دوران PDX مع ماصة المصلية خمسة ملليلتر في أنبوب، شطف سطح لوحة بلطف.جهاز طرد مركزي في 1، 200 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين لخلايا بيليه. إزالة فائقة، وإعادة فرض بيليه الخلية في ثلاثة ملليلتر من 20٪ حل التدرج الكثافة. قم بطبقة بعناية على حل التدرج الكثافة 20٪ مع الخلايا على الجزء العلوي من التدرج في أنبوب 15 ملليلتر.سقف الأنابيب والطرد المركزي في جهاز طرد مركزي الدوار سوينغ دلو 30 دقيقة في أربع درجات مئوية، 2، 000 مرات G، وكسر صفر. بعد الطرد المركزي، تكون الكسور مرئية. عادة ما يتم العثور على ثقافات خلايا PDX قابلة للحياة في واجهة حل التدرج الكثافة 40 إلى 55٪ .جمع 2-3 ملليلتر من كل كسر في أنابيب 15 ملليلتر الطازجة. إضافة ثلاثة إلى أربعة مجلدات من 1X HBSS العقيمة إلى كل كسر، وعكس لخلط دقيق. جهاز طرد مركزي في 1،000 مرة G لمدة ثلاث دقائق ل بيليه الخلايا.إزالة المناط. Resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد إلى اثنين من PDX معالجة المتوسطة. نقل aliquot صغيرة بين 50 إلى 100 ميكرولترات في أنبوب، وإضافة حجم مساو من محلول انزيم الانفصام لإعادة التوثيق.تقييم رقم الخلية في نظام التعليق خلية متفاوت المسافات. عد الخلايا مع قياس الهيموسيت أو عداد الخلايا الآلي. إعادة تشكيل هيدروجيل حمض الهيالوروني وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميكرولترات من HBSS إلى جميع الآبار في أعمدة نافذة المراقبة من لوحة microfluidic ذات حارتين للحفاظ على الرطوبة الثقافة وظروف التصوير الأمثل. حساب حجم تعليق الخلية اللازمة ل50 ميكرولترات من هيدروجيل في كثافة الخلية المطلوبة، على سبيل المثال، 5،000 خلية لكل ميكرولتر. لبذات واحد microfluidic لوحة، aliquot الحجم المحسوب في كل من أربعة أنابيب أجهزة الطرد المركزي 1.5 ملليلتر معقمة.ضبط درجة حِسِّ حل HA thiol إلى ثمانية مع 1 هيدروكسيد الصوديوم العادي قبل الاستخدام مباشرة. إجراء اختبار هلام عن طريق خلط 40 ميكرولترات من ها thiol مع 10 ميكرولترات من PEGdA ورصد هلام مع مرور الوقت. بعد ذلك، الطرد المركزي تعليق الخلية aliquots لمدة دقيقتين في 200 مرة G ودرجة حرارة الغرفة إلى بيليه الخلايا.إزالة بعناية فائقة، وإعادة تعليق الخلايا في 40 ميكرولتر من ها ثيول لحجم النهائي 50 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولترات من PEGdA إلى aliquot واحد من خلايا ها ثيول. تخلط جيدا، وانتظر من واحد إلى ثلاث دقائق قبل البذر لوحة microfluidic.قم بلصق طرف لتوزيع 1.5 ميكرولتررس على ماصة مكررة من قناة واحدة، وتحميلها مع الخلايا في حل هيدروجيل HA. تذكر أن تبقي aliquot الهيدروجين مختلطة جيدا لضمان توزيع الخلايا حتى. لبذات لوحة microfluidic، محاذاة طرف ماصة عمودي على شفرة في حين وضع بلطف تلميح في وسط مدخل هلام لضمان الاتصال ولكن لا يوجد ضغط عند الاستغناء 1.5 ميكرولترات من محلول هيدروجيل.مراقبة حالة التعبئة للقنوات microfluidic من خلال عرض من أعلى لوحة، أسفل لوحة، أو عن طريق المجهر. تقييم التحميل باستخدام هذا الرقم كدليل. بعد دقيقة واحدة من التحميل، عكس لوحة أثناء التحضير لألكوت المقبل.كرر البذر من لوحة microfluidic ل aliquots الثلاثة المتبقية من الخلايا في حل HA. بعد ملء جميع الرقائق، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب 45 دقيقة حتى يتم الانتهاء من هلام. بعد ذلك ، باستخدام الدليل المقدم ، تأكد من تثبيت الروك perfusion في حاضنة ثقافة الخلية مع إعداد الوفرة الصحيحة في زاوية 14 درجة وفترات أربع دقائق.إضافة 50 ميكروليترس من ثقافة خلية PDX المتوسطة لجميع المداخل المتوسطة. اضغط بلطف على اللوحة مقابل السطح لتشجيع السائل على ملء القنوات microfluidic. ثم قم بقلب اللوحة للتحقق مما إذا كانت القنوات ممتلئة بشكل صحيح.إضافة 50 ميكرولتر من DMEM/F-12 لجميع وسائل الإعلام. إذا كانت هناك أي فقاعات الهواء المحاصرين في قناة الضخ، وإزالة عن طريق التنصت لطيف من لوحة ضد سطح. باستخدام المجهر وشكل تخطيط لوحة، سجل رقاقة ملء النجاح.استبعاد الرقائق المعبأة بشكل غير صحيح من الاستخدام التجريبي الإضافي. ضع اللوحة على جهاز روك مائل تم تعيينه إلى إمالة 14 درجة ودورة مدتها أربع دقائق للبدء في التسريب. كل يومين، استبدال متوسط ثقافة PDX، أول 50 ميكرولترات في المداخل، ثم 50 ميكرولترات في المنافذ.في هذه الدراسة، تم تركيب الروك perfusion للبرمجة في حاضنة ثقافة الخلايا ذات السترات المائية القياسية، وتم إعداد شفرات microfluidic ذات الممرين في خزانة السلامة الحيوية القياسية للتحميل. تم تقييم 3D microfluidic PDX ثقافة البقاء ومورفولوجيا في كل من ظروف غير مفككة وكثافة الانحدار فصل. في اليوم الأول، أظهرت تلك الثقافات التي خضعت لطريقة الفصل خلايا ميتة واحدة أقل بعشرة أضعاف مقارنة بالثقافات غير المُزَوَّرة.الأهم من ذلك، مجموعات منفصلة تتألف في المقام الأول من خلايا حية. ولم يتم تحديد أي فرق ذي دلالة إحصائية فيما يتعلق بتوزيع حجم الكتلة. كما تم الحفاظ على الثقافات في لوحة المايكرولويدي لمدة سبعة أيام.بقي الرقم إجماليّة من خلايا حيّة متوافقة, و [كتل] يحتبس تقريبا 80٪ قابلية للتطبيق على الحياة من الثقافة. تذكر أن كل خط PDX فريد من نوعه ، لذلك فإن سهولة هضم الورم ، وحجم الظاهرة والمورفولوجيا من المجموعات ، وموقع الكتلة داخل تنقية التدرج سوف تختلف. يمكن إجراء عمليات الزرع في PDX باستخدام هذه الطريقة باستخدام مقايسات الجدوى المستندة إلى صورة أو لوحة تستند إلى قارئ، أو التحلل الثابت والميناعي المسمى، أو تفكيكها لجمع الخلايا البروتوكولات الأخرى.وسوف تسمح هذه الطريقة للباحثين لتكبيل البيئة الورم من أجل استكشاف علم الأحياء أو استجابة المخدرات من الخلايا السرطانية. يجب على المستخدمين إكمال تدريب الأشخاص البشريين القياسيين وتدريب مسببات الأمراض المنقولة بالدم قبل العمل مع الأنسجة المشتقة من الإنسان. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

وضع العلامات لسرطان الثدي Xenografts المستمدة من المريض مع يمكن عزوها مراسلون لنمو الأورام والدراسات الانبثاث

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

عزل وتوصيف الخلايا التي تبدأ الورم من الساركوما المستمدة من المرضى Xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

الأسفار التصوير المقطعي الجزيئية للتصوير في فيفو لتكثيفها جليوبلاستوما

Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

الفيزيولوجيالمريض المستمدة 3D Spheroids لفحص المخدرات المضادة للأورام لاستهداف الخلايا الجذعية السرطان

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

تقييم صلاحية الخلية والموت في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

فحص المخدرات للمريض الأولي المشتقة الورم Xenografts في حمار وحشي

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

استئصال الورم المشتق من المريض كمنصة "حية" قبل السريرية للتنبؤ بمقاومة الأدوية لدى المرضى

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...