Name: enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform at JoVE.com

这项工作得到了国家卫生研究院国家癌症研究所SBIR第一期（HHSN26120700015C）和P01CA098912的支持。

肿瘤组织是在患者同意后根据经批准的机构审查委员会 （IRB） 协议获得的。Xenograft 根据公认的机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 协议进行植入、种植和收获。
注：所有工作将在无菌生物安全柜中进行，以保持无菌。除非另有说明，否则所有步骤应在室温下执行。
1. 为PDX加工准备材料
<ol><li>自用钳和手术刀手柄或剃须刀刀片。</li>
	<li>解冻分离酶溶?...

<ol>
	<li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research.">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li><li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+mouse,+one+patient+paradigm:+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy.">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li><li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDX-MI:+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models.">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening.">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li><li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions.">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li><li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures.">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li><li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform.">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709 (2017).</li><li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform.">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856 (2016).</li><li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phaseguides:+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying.">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li><li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133,+CD15/SSEA-1,+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors.">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66 (2010).</li><li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth,+invasion+and+drug+responses.">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431 (2010).</li></ol>

在这里，我们描述了一种在高通量、注入三D培养系统中处理和培养可行的PDX衍生肿瘤细胞的方法。虽然该协议利用PCa PDX组织，它同样有效的其他上皮衍生肿瘤。肿瘤特征在单个 PDX 线之间有所不同，即使在同一原点组织（前列腺、乳房等）内。一些PCa PDX线是更多的纤维化和难以分离可行的细胞，而其他更多的细胞。此处指出的肿瘤大小可以在 IACUC 指南中变化，为特别低产的肿瘤提供更多的组织?...

在过去的十年中，癌症研究领域已经显示出对患者衍生异种移植（PDX）作为评估癌细胞通路依赖和药物易感性1的工具的新的热情。最常见的PDX模型通过人类肿瘤细胞的皮下或正畸植入建立——肿瘤片段、分离肿瘤衍生细胞群或分离循环肿瘤细胞样本——进入啮齿动物宿主体内。如果肿瘤"服用"成功，异种移植细胞将增殖，血管化，或以其他方式与宿主组织相互作用，形成肿瘤，可以收获的最佳大小，细分，并重新植入到其他宿主。作为模型系统，PDX在众多优点中通常保留了原生肿瘤细胞种群的异质性，并能够评估人类特异性通路和细胞反应2,2、3。体内语境允许肿瘤与血管和其他相邻频闪体相互作用，并回顾组织特征，如药物扩散动力学、氧气张力和细胞外基质影响，从而影响肿瘤进展。PDX 的一个负面方面是它们依赖啮齿动物宿主，这既是肿瘤扩张，也是最终的假设检验。由于许多PDX无法适应传统的二维（2D）培养组织培养聚苯乙烯而不失去许多理想的特征，因此，在这种方法相对可控的体外方法与体内PDX使用费用、设施和时间要求显著增加之间，研究人员的中间地带微乎其微。
我们描述了多个体外模型，在支持矩阵中实现3D细胞培养，最近扩展了该工作，以证明多种前列腺癌（PCa）衍生PDX的外活培养，单独和与骨髓衍生的成纤维细胞44，5联合培养。基于透明质酸 （HA） 水凝胶基质为两种细胞类型提供可定制且与生物学相关的支持，通过水凝胶深度 6 对水凝胶特性和光学清晰度进行简单控制，用于成像。
成熟的PDX肿瘤组织包括异质人类癌细胞和小鼠频闪（成纤维细胞、内皮细胞等）的可变混合物。研究细胞型对体外肿瘤进展的具体贡献，有利于分离肿瘤，分离细胞群，并以有组织的方式进行实验合并，以解剖细胞间交流的通路。组织消化中的混合细胞群与特定培养条件具有差异性相容性。例如，肿瘤相关的成纤维细胞生存能力需要表面粘附或3D基质与整黄素配体功能化，而上皮衍生PDX细胞通常没有这些要求，而是倾向于细胞-细胞相互作用。这些差异可以被利用，以实现PDX细胞与污染小鼠频闪细胞的有效分离。组织消化的旋转培养允许频闪细胞粘附于组织培养表面，而细胞粘附驱动PDX细胞漂浮在旋转培养表面之上，在24~48小时内在上半部分形成多细胞簇。这些聚类的具体特性因 PDX 而异（例如，大、紧、高球形聚类或类似葡萄束的更小、更松散的聚集体），但通常具有生物相关尺寸（直径为 50–250 μm），足以评估依赖于细胞间接触的细胞相互作用。
肿瘤检索和处理不可避免地导致某种程度的附带细胞死亡，要么是由于机械/酶中断造成的短期损害，要么是亚细胞与所选培养条件的长期不相容。尽管旋转培养作为初始批量分离的效用，但死细胞或垂死的细胞不可避免地会随着PDX簇而转移，并会影响由此产生的培养。这些死细胞通常是单个PDX细胞，没有集成到一个集群，小鼠频闪成纤维细胞，不能在选定的培养条件下生存，或特别脆弱的内皮细胞。这种垂死的细胞可以影响"幸存者"的实验结果，并可以极大地影响定量，例如，通过荧光图像的生存能力筛查测定。为了改进从此方法中选择活的PDX细胞，我们采用离心方法，采用密度步骤，以轻松去除PDX混合物中的单个死/死细胞，并保留主要活体多细胞簇。
为了加强对3D培养中PDX衍生聚类的研究，我们利用了一个基于微流体的灌注培养平台，即有机板（图1），这是一个高通量的有机体片平台，允许在384孔微刺激板基上同时培养多达96个个体灌注、3D培养基（图,81A）7。7在双通道微流体板中，单个组织芯片通过两个微流体通道（图1B，凝胶通道：红色，灌注通道：蓝色）连接，连续跨越四个孔。两个微流体通道由一个称为相位导的短塑料脊隔开，防止一个通道溢出到相邻的相邻通道中，同时允许在凝胶的内容和灌注通道9之间实现无膜接口。由于微流体板的底部由显微镜级玻璃组成，因此可以通过标准或自动显微镜在观察窗口通过检查窗口查看。灌注是在微流体板与可编程摇臂，利用重力驱动介质通过微流体通道，在储层井之间（图1C）。灌注流模仿比静态培养更密切地概括肿瘤微环境，允许合并剪切应力和增强气体和营养物质的分布。与相同细胞的静态3D培养物相比，在微流体板中维持高融合癌细胞培养的好处以前被描述为高融合乳腺癌培养物表现出最佳的生存能力。
本报告介绍了一种用于隔离活多细胞PDX聚类的适应密度梯度离心方法，并展示了其在可测量微流体板内建立3D PDX培养物的效用。由于越来越多的研究实验室正在寻求促进 PDX 使用的方法，我们预计此处介绍的协议将立即具有实用价值。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:812px;" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">1N NaOH</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">60 mm round tissue culture dishes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">6-well tissue culture plates</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">70 &#181;m cell strainers</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:189px;">431751</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">5810R with suitable rotor and buckets for 15/50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Density gradient centrifugation solution</td>
			<td style="width:148px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:189px;">P1644</td>
			<td>Percoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable tissue culture grade</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Dissociation enzyme solution</td>
			<td style="width:148px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:189px;">07921</td>
			<td style="width:224px;">ACCUMAX</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">11039021</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Forceps</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">HA hydrogel kit</td>
			<td style="width:148px;">ESI BIO</td>
			<td style="width:189px;">GS311</td>
			<td style="width:224px;">HyStem (Hyaluronic acid-SH and PEGDA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">10-527F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td style="width:148px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:189px;">S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">02-671-51B Hausser BrightLine</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">H1398</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Image processing software</td>
			<td style="width:148px;">Oxford Instruments</td>
			<td style="width:189px;">Imaris 9.3</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">L3224</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microfluidic culture plate</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">9603-400-B</td>
			<td>2-lane OrganoPlate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Microscope</td>
			<td style="width:148px;">Nikon</td>
			<td style="width:189px;">A1R</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:251px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">3125000036</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:251px;">PDX-derived tumor tissue</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td style="width:224px;">obtained under IRB approval for human tissue and IACUC approval for animal host</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:148px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:189px;">15140-122</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Perfusion rocker</td>
			<td style="width:148px;">Mimetas</td>
			<td style="width:189px;">OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">pH strips (pH 5-9)</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Phosphate-buffered saline solution</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:189px;">17-516F</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Razor blades</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:251px;">Rotating xy-shaker</td>
			<td style="width:148px;">VWR</td>
			<td style="width:189px;">Advanced 3500 Orbital Shaker</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Scalpel handle</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Single channel repeating pipette</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:189px;">22260201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 15mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">Sterile, 50mL conical centrifuge tubes</td>
			<td style="width:148px;"></td>
			<td style="width:189px;"></td>
			<td>any suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced viability for ex vivo 3d hydrogel cultures of patient-derived xenografts in a perfused microfluidic platform

患者衍生的异种移植物（PDX），当被切除的患者肿瘤组织被直接移植到免疫功能低下的小鼠中时产生，在生物学上保持稳定，从而保留分子、遗传和组织学特征，以及原始肿瘤的异质性。然而，使用这些模型进行大量的实验，包括药物筛选，在成本和时间方面都是令人望而却步的。三维（3D）培养系统被广泛视为癌细胞通过生化相互作用、形态学和建筑保持其生物完整性的平台。我们的团队使用由透明质酸 （HA） 组成的 3D 基质在体外培养 PDX 细胞方面拥有丰富的经验。为了分离与PDX相关的小鼠成纤维细胞，我们使用旋转培养，其中频闪细胞粘附在组织培养治疗板的表面，而分离的PDX肿瘤细胞漂浮和自联成多细胞簇。也漂浮在上流液是单，往往是死细胞，这提出了一个挑战，收集可行的PDX集群下游封装到水凝胶的3D细胞培养。为了将这些单细胞与活细胞簇分离，我们采用了密度步进梯度离心。此处描述的协议允许将不可行的单细胞从细胞群的健康群体中耗尽，这些细胞群将用于进一步的体外实验。在我们的研究中，我们将 3D 培养物融入微流体板中，从而在培养过程中进行介质灌注。在使用纯化细胞与非纯化细胞的荧光图像可行性测定评估结果培养物后，我们的结果表明，这一额外的分离步骤大大减少了来自我们培养物的非活细胞的数量。

在标准水千斤细胞培养箱中准备了可编程灌注摇臂，在标准生物安全柜中准备了双通道微流体板进行装载（图1）。MDA-PCA-118b PDX肿瘤在体内扩大，在达到最大尺寸时收获，并如协议第2节所述分离，以大约单细胞状态形成细胞的泥浆悬浮（图2A）。浆料被分配到6孔组织培养板中，并按所述放置在XY旋转器上，为48小时。如先前所述，小鼠频闪附附于组织培...

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Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

该协议演示了启用患者衍生异种移植 （PDX） 的扩展体外培养的方法。通过直接去除不可行的单细胞，一步提高三维水凝胶中多细胞聚类培养的整体生存能力。辅助步骤演示了在全融合微流体平台中 PDX 培养的最佳实践。

在全融合微流体平台中增强患者衍生异种移植物的外体 3D 水凝胶培养物的生存能力

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

改进患者衍生肿瘤样本的培养方法至关重要，因为该领域正在远离传统细胞系的使用。该协议允许在一个平台中培养患者衍生的肿瘤细胞，该平台可经得起高吞吐量和高含量筛选，与体内癌症模型不同。结合PDX的平台使我们能够评估更多反映原生肿瘤的异质系统。这可能使人们了解药物机制，并允许更快的药物筛选。该方法可以通过结合频闪、内皮和免疫细胞来扩展。这些共培养物可以更反映本地肿瘤种群和结构。练习用易于扩展的细胞系加载微流体板，在转移到 PDX 等更珍贵的细胞之前变得高度熟练。 在板点胶过程中进行对齐会极大地影响成功，视觉演示可以轻松传达这一概念。首先，将肿瘤组织转移到预称无菌的50毫升锥形管。用 30 毫升无菌 PBS 冲洗六次，以去除血液和污染物。去除尽可能多的液体，并称重肿瘤组织。将肿瘤组织转移到60毫米圆形组织培养皿中，并使用无菌剃刀刀片或手术刀将其切碎成1毫米。加入五毫升PDX加工介质，收集肿瘤浆料。加入五毫升分离酶溶液，收集肿瘤浆料。用另外五毫升分离酶溶液冲洗培养皿。然后添加五毫升的PDX处理介质。在37摄氏度下孵育20分钟，轻轻摇晃。孵育时间过半，轻轻旋转管子。孵育后，移液器上下轻轻与血清移液器，以打破团块。将70微米细胞滤株放在新的无菌50毫升管上，然后过滤细胞。然后在 1，200 rpm 时离心两分钟，对细胞进行分粒。在两到三毫升的PDX培养介质中去除上一除和重新暂停。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。使用此表可以估计实现每个芯片所需的所需单元所需的相关 PDX 派生单元数。六井组织培养板每井的五毫升PDX培养中，将一至二倍的六个细胞板。在37摄氏度、5%的二氧化碳和95%的湿度下孵育48小时，在50至55转/小时轻轻摇晃，促进聚类形成。集群形成后，继续离心。首先，在无菌的 50 毫升锥形管中，将 18 毫升密度梯度离心溶液与两毫升无菌 10X HBSS 彻底混合，准备 20 毫升 100% 密度梯度溶液。用无菌 1X HBSS 稀释此 100% 溶液，使 10 毫升各 20%30%40%和 55% 密度梯度溶液。在 15 毫升锥形管的底部加入三毫升 55% 密度梯度溶液。以一定角度握住管子，缓慢地将三毫升40%密度梯度溶液分配到管子的倾斜侧和55%层的顶部。使用 30% 密度梯度解决方案重复。然后用五毫升血清移液器将PDX旋转培养物的上一级收集到管子中，轻轻冲洗板表面。在 1，200 rpm 转速下离心两分钟，以产生细胞颗粒。去除上一提液，将细胞颗粒重新在三毫升20%密度梯度溶液中。小心地将 20% 密度梯度溶液与细胞分层到 15 毫升管中的梯度顶部。在4摄氏度、2000倍G和零破度下，将管子和离心机盖住在回转桶转子离心机中30分钟。离心后，分数是可见的。可行的 PDX 细胞培养物通常位于 40 到 55% 密度梯度解决方案接口。将每分数的两到三毫升收集到新鲜的 15 毫升管中。在每个分数中加入三到四卷无菌 1X HBSS，然后反转以彻底混合。在1000倍G下离心3分钟，使细胞产生颗粒。拆下上一液。将细胞颗粒重新在一至两毫升的PDX处理介质中。将50至100微升之间的小等分转移到管中，并加入同等体积的分离酶溶液进行再分离。评估聚类单元格悬浮液中的单元格编号。使用血细胞计或自动细胞计数器计算细胞。根据制造商的说明重组透明质酸水凝胶解决方案。使用多通道移液器，在双通道微流体板的观察窗口柱的所有孔中加入 50 微升 HBSS，以保持培养湿度和最佳成像条件。计算50微升水凝胶所需的细胞悬浮量，如每微升5000个细胞。对于播种一个微流体板，将计算的体积分成四个无菌的1.5毫升离心管。使用前，立即使用 1 个正常的氢氧化钠将 HA 硫醇溶液的 pH 值调整为 8。通过将 40 微升 HA 硫醇与 10 微升 PEGdA 混合并随着时间的推移监测凝胶，执行测试凝胶。接下来，在200倍G和室温下将细胞悬浮液离心两分钟，以对细胞进行颗粒化。小心地去除上流剂，将细胞重新用 40 微升的 HA 硫醇重新暂停，最终体积为 50 微升。在HA硫醇细胞的一个分项中加入10微升PEGdA。混合好，等待一到三分钟，然后播种微流体板。将1.5微升的尖端粘贴到单通道重复移液器上，并在HA水凝胶溶液中用细胞进行加载。请记住保持氢气等分，确保细胞分布均匀。要播种微流体板，请将移液器尖端垂直于刀片，同时轻轻地将尖端置于凝胶入口的中心，以确保在分配 1.5 微升水凝胶溶液时接触无压力。通过从板的顶部、板的底部或显微镜观察微流体通道的填充状态。使用此图作为指南评估负载。装货一分钟后，在准备下一个等分时反转板。对HA溶液中剩余的三个细胞的分部重复微流体板的播种。填充所有芯片后，在37摄氏度的加湿培养箱中孵育板45分钟，直到凝胶完成。之后，使用提供的手册，确保灌注摇杆安装在细胞培养箱中，以 14 度角和 4 分钟间隔进行正确的灌注设置。将 50 微升 PDX 细胞培养培养培养剂添加到所有培养中。轻轻敲击板对表面，以鼓励液体填充微流体通道。然后翻转板以检查通道是否正确填充。为所有媒体添加 50 微升 DMEM/F-12。如果灌注通道中有任何气泡，请轻轻敲击板对表面，将其拆下。使用显微镜和板式布局形式，记录芯片灌装成功。将未正确填充的芯片排除在进一步实验使用之外。将板放在倾斜摇杆上，设置为 14 度倾斜，循环 4 分钟，开始灌注。每两天更换一次PDX培养介质，先在入口中更换50微升，然后在插座中更换50微升。在这项研究中，在标准水套细胞培养箱中安装了一个可编程灌注摇臂，并在标准生物安全柜中准备了双通道微流体叶片进行装载。3D微流体PDX培养机的生存能力和形态在未分离和密度梯度离心分离条件下均进行了评价。第一天，那些采用分离方法的培养物与未分离的培养物相比，单死细胞数量减少了十倍。重要的是，分离的聚类主要由活细胞组成。未为群集大小分布确定统计显著差异。在微流体板块中进一步保持了7天的培养。活细胞总数保持不变，聚类在培养的生命周期中保持了约80%的生存能力。请记住，每条PDX线都是独一无二的，因此肿瘤消化的易用性、聚类的表型大小和形态，以及聚类在梯度纯化中的位置会有所不同。使用此方法建立的 PDX 培养物可以通过基于图像或板读取器的生存能力分析、固定和免疫荧光标记或分离来收集细胞赖酸盐用于其他协议。该方法将允许研究人员重述肿瘤微环境，以探索肿瘤细胞的生物学或药物反应。用户在使用人源组织之前，应完成标准的人体受试者培训和血液传播病原体培训。应佩戴适当的个人防护装备。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

可追踪记者乳腺癌患者来源的移植瘤贴标肿瘤生长和转移的研究

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

科研

癌症研究

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来自沙柯玛患者衍生异种移植物的肿瘤启动细胞的分离和表征

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts

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Tumorigenicity is the capability of cancer cells to form a tumor mass. A widely used approach to determine if the cells are tumorigenic is by injecting ...

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患者衍生的胰腺癌异质异种移植模型,使用斑马鱼幼虫作为比较药物评估的宿主

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